Invazívní infekce způsobené vláknitými houbami a jejich mikrobiologická diagnostika

Invazívní infekce způsobené vláknitými houbami jsou stále častější komplikací u pacientů s různým stupněm imunosuprese. Nejběžnějším a vlastně nejlépe mikrobiologicky dokumentovaným původcem těchto infekcí je rod Aspergillus. Nicméně v posledních dekádě nabývají významu i zástupci třídy Zygomycetes, event. méně časté vláknité houby, jako jsou fusária, scedosporia a další.
Tato práce se snaží podat ucelený přehled o invazívních infekcích způsobených vláknitými houbami a jejich především mikrobiologické diagnostice.

Summary

Kocmanová, I., Ráčil, Z. Invasive infections caused by filamentous fungi and their microbiological diagnostics

Invasive infections caused by filamentous fungi are becoming an increasingly common complication in patients with varying degrees of immunosuppression. The most common and in fact the best microbiologically documented etiological agent of such infections is the Aspergillus genus. However, in the last decade representatives of the Zygomycetes class, possibly less common filamentous fungi such as fusaria, scedosporia and others become increasingly important.
This article seeks to present a comprehensive overview of invasive infections caused by filamentous fungi and their especially microbiological diagnostics.

Již mnohokrát bylo poukázáno na to, že za poslední dvě desetiletí vzrostl počet nemocných s invazívní mykotickou infekcí. Je to způsobeno více faktory – větším počtem pacientů v rizikových skupinách (po transplantaci krvetvorné tkáně, transplantaci orgánů, po imunosupresivních procedurách, na jednotkách intenzívní péče, rizikový je i vysoký věk nebo naopak nezralí novorozenci), ale také stálým zlepšováním laboratorní diagnostiky těchto infekcí.(1, 2) Mění se rovněž epidemiologická situace. Celkově stále převažují infekce způsobené kvasinkami(2, 3) – nicméně je pozorován posun od infekcí druhem Candida albicans směrem k tzv. non-albicans kandidám.(4) Pokud se ovšem soustředíme na pacienty v nejvíce rizikových skupinách (imunosuprimované), je naprosto zřetelná převaha infekcí způsobených vláknitými houbami. Neofytos et al. zaznamenal ve skupině 250 nemocných po transplantaci krvetvorných buněk s invazívní mykotickou infekcí (invasive fungal disaese – IFD) 25 % kandidóz a 59 % aspergilóz,(5) k podobným výsledkům dospěl i Kontoyiannis s početnější skupinou (983 IFD) stejně léčených pacientů – 28 % kandidóz a 43 % aspergilóz.(6)

Infekce vláknitými houbami jsou tedy nejběžnější mezi nemocnými s hematologickou malignitou, po transplantaci krvetvorných buněk nebo solidních orgánů – na rozdíl od pacientů s HIV pozitivitou, na jednotkách intenzívní péče, novorozenců apod., u kterých zcela převažují kandidózy. Správná a rychlá diagnostika invazívních mykotických infekcí je zásadní záležitostí, zejména u těch nejohroženějších pacientů. Byl prokázán vztah mezi mortalitou a časnou (a správnou) diagnózou – čím dříve je zahájena léčba, tím větší má pacient šanci na přežití těchto závažných infekčních komplikací.(7) Nicméně mortalita a morbidita jsou přesto stále vysoké, nezanedbatelné jsou rovněž náklady na léčbu.
Kromě rozdílů v incidenci IFD u různých skupin pacientů se rovněž rozšiřuje spektrum oportunních fungálních patogenů. Vyjma kandidóz a aspergilóz jsou stále častěji popisovány infekce způsobené například rody Saccharomyces, Trichosporon, Rhodotorula, Blastoschizomyces, ale také Fusarium, Trichoderma či dalšími vláknitými houbami ze skupiny Dematiaceae.(8–10)

Obecně vzato je stanovení diagnózy invazívní houbové infekce záležitostí komplexní a poměrně složitou – laboratorní metody mají různou specificitu a senzitivitu, klinické příznaky jsou často nejednoznačné. V současné době se při stratifikaci nemocných vychází obvykle z EORTC MSG Consensus Group kritérií (The European Organisation for Research and Treatment of Cancer – Invasive Fungal Infections Cooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group), které zohledňují přítomnost hostitelských faktorů (neutropenie, transplantace krvetvorných buněk atp.), klinické manifestace choroby (teplota, dušnost atp.) a mikrobiologických kritérií (pozitivní kultivace, přítomnost antigenů atp.).(11) Je třeba mít ale na paměti, že tato kritéria byla vytvořena pro pacienty s onkologickým onemocněním – v ostatních případech (novorozenci, popálení atp.) je třeba k nim přistupovat s patřičnou rezervou.

Aspergilózy

Ze skupiny invazívních infekcí způsobených vláknitými houbami se jednoznačně nejčastěji setkáme s invazívní aspergilózou. Zástupci rodu Aspergillus jsou v okolním prostředí takzvaně „všudypřítomní“. Lze je nalézt, zvláště ve formě konidií nebo části hyf, ve vodě, půdě, vzduchu nebo ulpívají na rostlinách či živočiších. Patří mezi askomycety a do rodu spadá kolem 200 druhů – z nich asi 40 bylo identifikováno jako původci onemocnění lidí. V klinickém materiálu je nejčastěji zachycen druh A. fumigatus sensu stricto, jsou popsány i infekce způsobené dalšími druhy – A. flavus, A. niger (Obr. 1), A. terreus, A. versicolor atd. S rozvojem molekulárněbiologických metod a jejich využití při identifikaci narostlých kultur se objevují i dříve zřídka rozpoznané druhy jako A. lentulus nebo teleomorfy rodu Aspergillus – např. Neosartorya udagawae.(12) Setkání vnímavého jedince s touto vláknitou houbou může způsobit širokou škálu onemocnění – od relativně méně závažných alergických forem přes aspergilom až po aspergilové infekce (aspergilózy), které mohou mít invazívní nebo chronický charakter, být lokalizované nebo diseminované.(13) Přechod mezi jednotlivými formami je neostrý a závisí hlavně na stupni imunokompetence postiženého jedince (Obr. 2 – podle(14)).

Obr. 1 – A. niger

Obr. 2 – Plicní aspergilóza – formy (podle Hope(14))

Vstupní branou infekce je ve většině případů dýchací ústrojí (zřídkakdy kůže) – proto také je v případě invazívní infekce její nejobvyklejší formou plicní aspergilóza. Postižení jiných orgánů – jako jsou srdce, mozek, ledviny, kosti atd. – je většinou podmíněno hematogenním rozsevem houby z tohoto primárního ložiska. Povrchová, kožní forma onemocnění je reprezentována aspergilovou otomykózou nebo onychomykózou, lokalizovaná infekce plicním aspergilomem, při formě alergické se setkáváme hlavně s alergickou bronchopulmonální aspergilózou. Nicméně předmětem tohoto sdělení jsou infekce invazívní. Stanovení diagnózy invazívní aspergilózy se opírá nejprve o zjištění přítomnosti rizikových faktorů – nejvíce ohroženi jsou nemocní s dlouhodobou a opakovanou neutropenií, po alogenní transplantaci krvetvorných buněk, dále pak nemocní léčení kortikoidy, širokospektrými antibiotiky (zejména jejich kombinací) atd. U ri pacientů s klinickými příznaky (teplota, kašel, dušnost) je dalším krokem použití zobrazovacích metod – doporučeno je vyšetření HRCT (high resolution computed tomography), které je oproti rentgenovému vyšetření podstatně citlivější.(15)

Nicméně ani nálezy z HRCT nejsou obvykle jednoznačné – je proto třeba (pokud to dovolí klinický stav pacienta) kombinovat tyto výsledky ještě s cytologickým, mikrobiologickým a sérologickým vyšetřením tekutiny z bronchoalveolární laváže (v případě plicní formy) nebo ještě lépe materiálu z biopsie nebo resekce postiženého orgánu a s vyšetřením přítomnosti aspergilového antigenu v séru.(16) Aspergilózy jsou obvykle považovány za infekce nozokomiální a zvýšená incidence je často popisována v souvislosti se stavebními úpravami v areálu nemocnice nebo jejím okolí – což umocňuje význam filtrace vzduchu do pokojů ohrožených nemocných pomocí tzv. HEPA (high-efficiency particulate air) filtrů.(17, 18) Léčba invazívní aspergilózy se opírá hlavně o použití triazolu 2. generace – vorikonazolu, další možností jsou tukové formy amfotericinu B, echinokandiny a itrakonazol. V poslední době se u vysoce rizikových pacientů dostává do popředí kombinovaná terapie (vorikonazol + echinokandin).(19, 20)

Mikrobiologická diagnostika invazívní aspergilózy

Základním kamenem mykologického vyšetření je mikroskopie a kultivace klinického materiálu – bohužel zajištění vhodného vzorku je často nejednoduché a mnohdy je nejednoznačná i interpretace výsledků. To platí prakticky u všech invazívních infekcí způsobených vláknitou houbou. Pochopitelně nejrelevantnější je pozitivita primárně sterilního materiálu (biopsie, resekát, likvor) – naopak pozitivní kultivace Aspergillus spp. z krve (hemokultura) je obvykle považována za kontaminaci.
U tekutiny z bronchoalveolární laváže (BAL) musíme vzít v potaz možnost kontaminace z kolonizovaných horních dýchacích cest, event. kontaminace při laboratorním zpracování (při interpretaci je dlužno mít na paměti, že aspergilus je houba všudypřítomná). Ještě méně vypovídající jsou pozitivní kultivační nálezy ze sputa. Bouza et al. ve své práci monitorovali kultivační nálezy houby A. fumigatus v různém klinickém materiálu v tříletém období ve velké laboratoři fakultní nemocnice – pouze 12 % z 260 pozitivních pacientů mělo invazívní infekci, ostatní nálezy byly uzavřeny jako kolonizace nebo kontaminace.(21) Na druhou stranu senzitivita kultivačního nebo mikroskopického vyšetření tekutiny z BAL není příliš vysoká – je ovlivněna náloží mikroorganismu, předchozí antiaspergilovou léčbou apod.

V mikrobiologické laboratoři nevyžadují houby rodu Aspergillus žádné zvláštní nároky – rostou dobře na základním mykologickém médiu, Sabouraudově agaru, obvykle obohaceném o antibiotika kvůli odclonění případné doprovodné bakteriální flóry. V mikroskopických technikách lze obvykle úspěšně využít běžná mikrobiologická barvení (Gram, Giemsa), event. speciální mykologická (MycoInk, fluorescenční barvení). Zařazení narostlého izolátu Aspergillus spp. do druhu se opírá hlavně o mikromorfologické znaky, v kombinaci se vzhledem a barvou kolonií na různých médiích (př. Czapek-Dox agar). V poslední době se také dostávají do popředí techniky molekulární biologie – sekvenace části houbového genomu a srovnání získané sekvence s celosvětovou databází. Další možností je hmotnostní spektrometrie – a to zejména její aplikace MALDITOF (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization – Time of Flight), která se velmi rychle rozšiřuje v rutinních mikrobiologických laboratořích, kde pomáhá při dourčování široké škály mikroorganismů. Kromě vysoké shody výsledku s klasickými biochemickými testy (nicméně různé pro různé druhy mikroorganismů) je hlavním přínosem MALDI-TOF zkrácení času do identifikace kultury (řádově minuty až hodiny).

Neocenitelnou výhodou pozitivní kultivace je možnost vyšetřit u houbového patogenu citlivost k antimykotikům. Přestože existuje standardní mikrodiluční metodika pro testování citlivosti vláknitých hub navržená CLSI (Clinical Laboratory Standard Institute) nebo doporučení EUCAST (European Committee for Antimicrobial Susceptibility Testing), v rutinní laboratoři je v našich podmínkách obvykle používán komerční systém Etestů nebo Sensititre Yeast One, které jsou levnější i méně pracné a tímto způsobem získané výsledky vykazují relativně vysokou shodu se standardní metodikou. Přesto je nutné zdůraznit, že doposud nebyly oficiálně stanoveny break-pointy pro vláknité houby u žádného antimykotika. Kultivační a mikroskopická vyšetření nejsou bohužel pro stanovení diagnózy invazívní aspergilózy dostatečně citlivá (navíc je zde problém se získáním relevantního materiálu) a tak vzhledem k vývoji posledních let je největší část nemocných identifikována na základě pravidelného screeningu aspergilového antigenu (galaktomananu) v krvi.

Neofytos a kol. analyzovali 250 invazívních infekcí u pacientů po transplantaci krvetvorných buněk – z celkového počtu 148 pravděpodobných a prokázaných aspergilóz bylo plných 52 % takto uzavřeno právě kvůli pozitivitě galaktomananu (GM) nebo pozitivní histopatologii. V 37 % případů se podařilo původce vykultivovat a příčinou onemocnění byl druh A. fumigatus.(5) Galaktomanan je termostabilní heteropolysacharid obsažený v buněčné stěně aspergilů. Během růstu houby je uvolňován do okolního prostředí – a je tedy detekovatelný v tělesných tekutinách. Nejčastěji testovaným materiálem je sérum, rozsáhlé zkušenosti jsou publikovány rovněž u tekutiny z BAL, jednotlivé zprávy se týkají i pozitivity likvoru při aspergilóze CNS, event. pozitivity tkání sterilně odebraných z místa infekce.

Principem detekce je semikvantitativní sendvičová ELISA, známá pod firemním označením Platelia Aspergillus EIA (Bio-Rad, Francie). Z mnoha publikovaných prací lze uzavřít, že opakovaná pozitivita GM je poměrně spolehlivým markerem invazívní aspergilózy.(22) Při interpretaci výsledků je třeba mít na paměti příčiny možné falešné pozitivity (současná aplikace hydratačního roztoku PlazmaLyte,(23) některých penicilinových antibiotik(24)). Naopak senzitivitu testu ovlivňují typ a závažnost imunosuprese pacienta, stupeň angioinvaze, profylaxe antiaspergilovými antimykotiky nebo frekvence odběrů.(25, 26) Kromě galaktomananu lze při invazívní aspergilóze očekávat i pozitivitu dalšího komerčně dostupného testu, který stanovuje přítomnost 1,3-beta-D-glukanu (BG). Jedná se rovněž o polysacharid buněčné stěny – ale jeho přítomnost v ní není omezena na aspergily – je součástí buněčné stěny všech hub (panfungální antigen).

Principem detekce je schopnost tohoto polysacharidu reagovat s lyzátem amébocytů ostrorepa (Limulus polyphemus nebo Tachypleus tridentatus) – tato reakce je vizualizována spektrofotometricky nebo turbidimetricky. Na světě jsou pro tento účel komerčně dostupné tři sety – Fungitell, ACC (USA), FungitecG, Seikagaku (Japonsko), Wako WB003, Wako (Japonsko). Vyšetření je velmi citlivé (dokáže detekovat koncentrace polysacharidu v tělních tekutinách v řádu pg/ml), což pravděpodobně způsobuje náchylnost setů k falešným pozitivitám. Při interpretaci je proto nutné brát v potaz léčbu některými antibiotiky, bakteriální sepsi vybranými mikroorganismy, vliv dialýzy, podávání intravenózních imunoglobulinů atp.(27) Nicméně současná pozitivita GM a BG, ve spojení s rizikovými faktory, klinickými příznaky a pozitivním vyšetřením zobrazovacími metodami by měla být jednoznačným impulsem k zahájení léčby pravděpodobné invazívní aspergilózy. Rozsáhlé práce jsou rovněž věnovány časné diagnostice invazívní aspergilózy pomocí metodik molekulární biologie, a to zejména z krve nebo tekutiny z BAL. Navzdory tomu ale ještě nebyla žádná z PCR metodik standardizována pro rutinní použití – proto je zatím třeba k výsledkům z těchto metod přistupovat velmi obezřetně.

Zygomykózy (mukormykózy)

Pojem zygomykózy je používán obecně pro označení infekcí způsobených houbami ze třídy Zygomycetes, v našich podmínkách obvykle řádu Mucorales (rody Rhizopus, Rhizomucor, Mucor, Absidia apod.). Pro tyto organismy je charakteristická přítomnost neseptovaného nebo řídce septovaného mycelia, tenkostěnných sporangiospor a bouřlivě rychlý růst.
Podobně jako Aspergillus spp. jsou zygomycety ubikviterní – lze je nalézt v půdě (zejména tlející), vodě, vzduchu apod. a stejně jako aspergilózy jsou zygomykózy považovány za infekce nozokomiální, s nárůstem incidence v průběhu stavebních prací v areálech zdravotnických zařízení ošetřujících rizikové pacienty. Branou infekce je obvykle dýchací ústrojí, možný vstup je přes poraněnou kůži atp., popsán byl i nemocniční přenos způsobený kontaminovanými chirurgickými nástroji.(28) Přestože infekcí způsobených zygomycetami je podstatně méně než aspergilóz, v posledních letech jejich počet narůstá.

Komplexně shrnuje tyto poznatky review Rodena a kol.(29) Práce popisuje 929 publikovaných případů zygomykóz (od roku 1885), vyhodnocuje mortalitu a rizikové faktory. Nejohroženější skupinou jsou nemocní s diabetes mellitus a hematologickými malignitami, dalšími rizikovými faktory může být terapie chelátory železa, léčba kortikosteroidy, popáleniny. Nejčastěji se vyskytuje forma plicní nebo rinocerebrální, s největší mortalitou je spojena forma diseminovaná.
Dlužno říci, že klinické příznaky ani použití zobrazovacích metod nemohou rozlišit mezi invazívní aspergilózou a zygomykózou – jedinou možností je průkaz mikrobiologický nebo patomorfologický, oba mají ovšem řadu limitů. Lékem volby pro léčbu invazívních zygomykóz je stále amfotericin B (a jeho tukové formy), obvykle je doporučen radikální chirurgický zákrok (je-li možný). Z ostatních antimykotik se může uplatnit pouze posakonazol, hlavně v profylaxi a záchranné terapii.
V poslední době je často diskutován vztah mezi používáním vorikonazolu (léku první volby na aspergilové infekce) a selekcí hub třídy Zygomycetes. Jakkoliv ještě nebyl vytvořen konsenzus, na myším modelu bylo prokázáno zvýšení virulence těchto vláknitých hub po expozici vorikonazolem.(30)

Mikrobiologická diagnostika invazívní zygomykózy

Stejně jako u aspergilózy se mikrobiologická diagnostika opírá o pozitivní mikroskopii a kultivaci – ovšem se stejným omezením – čili nezřídka nemožností získání validního materiálu pro laboratorní průkaz.
Při mikroskopickém vyšetření se zaměřujeme na přítomnost širokých, neseptovaných nebo řídce septovaných vláken – na rozdíl od aspergilů (a vlastně i většiny ostatních vláknitých hub), která mají vlákna gracilnější a hojně septovaná. Zygomycety nevyžadují zvláštní kultivační podmínky a metody pro zařazení případně vykultivované houby do rodu a druhu se opírají o zkoumání mikro- a makromorfologie, event. přínosem je využití metod molekulární biologie (sekvenace).
Velkým problémem pro časnou diagnostiku těchto život ohrožujících infekcí je úplná absence komerčně dostupných a spolehlivých setů. Z imunologických testů (detekce některého z antigenů buněčné stěny) nelze bohužel použít ani panfungální 1,3-beta-D-glukan – přestože je tento polysacharid v buněčné stěně zygomycet rovněž obsažen, není při růstu houby vylučován do média v dostatečném množství. Takže pro invazívní zygomykózu může svědčit současně negativní galaktomanan a glukan (což ale může samozřejmě znamenat i úplnou nepřítomnost houbové infekce).
Nejnadějnějším přístupem jsou v současné době metody molekulárněbiologické, pro jejichž použití ale trvá (kromě nezbytné standardizace) již zmiňované omezení při získání vhodného testovaného materiálu – nejčastěji tkáně z místa infekce, nebo tekutiny z BAL.(31)

Fusariózy

Zástupci rodu Fusarium (Obr. 3) patří mezi důležité rostlinné patogeny a v přírodě jsou opět široce rozšířeni (ve vodě, biofilmu, organických substrátech apod.). U lidí mohou způsobovat velkou škálu infekcí – od lokálních (onychomykózy, keratitidy atp.) až po diseminované. U imunokompromitovaných pacientů přechází lokální postižení (bránou vstupu je obvykle dýchací ústrojí nebo poškozená kůže) v diseminovanou formu až v 70 % případů.(8) U fusárií je rovněž popisována dobrá schopnost tvořit biofilm – se kterou je zřejmě také spojena do této doby největší epidemie fusarióz – 230 popsaných případů keratitid u nositelů kontaktních čoček. Léčba invazívních forem se opírá o určení druhu houby a otestování citlivosti in vitro. Pro F. solani a F. verticillioides je typická citlivost k amfotericinu B a rezistence k azolům. Ostatní fusária bývají často citlivá i na vorikonazol nebo posakonazol.
Z výše řečeného je jasné, že pro správnou léčbu je velmi přínosný pozitivní kultivační záchyt – na rozdíl od aspergilóz je v případě diseminované formy pravidelně pozitivní hemokultura, při stanovování diagnózy mohou být nápomocné výsledky z biopsie kožních lézí. Při pozitivním mikroskopickém (patomorfologickém) vyšetření primárně sterilních materiálů si je třeba ale uvědomit, že pokud houba nevysporuje, není možné ji správně zařadit do rodu. Pro časnou diagnostiku invazívních fusarióz lze využít pozitivitu glukanu – současně s negativitou galaktomananu. Žádný specifický komerčně vyráběný imunologický test zatím neexistuje.

Obr. 3 – Fusarium spp. – nativní preparát

Další obzory se otvírají na poli molekulárněbiologických metod.

Scedosporiózy Infekce způsobené dvěmi nejčastějšími scedosporii – S. apiospermum a S. prolificans jsou sice poměrně raritní, ale velmi rezistentní k léčbě antimykotiky. Práce Lamaris et al. analyzuje 25 případů scedosporióz – ve 100 % se infekce týkala pacientů s hematologickou malignitou. Vstupní branou je obvykle kůže nebo dýchací ústrojí, u imunokompromitovaných infekce často diseminuje – v tomto případě je mortalita obrovská – podle druhu scedosporia se pohybuje od 70 do 100 %. Až v jedné třetině případů můžeme houbu vykultivovat z krve.(32) Léčba je velmi komplikovaná, u infekcí způsobených S. apiospermum mohou pomoci azoly (ne amfotericin B), S. prolificans je často rezistentní na všechna používaná antimykotika. Mikrobiologická diagnostika se opírá o pozitivní mikroskopický a kultivační nález z primárně sterilního materiálu, v časné diagnostice lze použít pozitivitu glukanu a negativitu galaktomananu (což je bohužel kombinace možná u většiny ne-aspergilových invazívních houbových infekcí).

Mykózy způsobené ostatními vláknitými houbami

Tyto infekce jsou omezeny takřka vždy na pacienty s těžkým imunodeficitem. Ze skupiny hyalinních mikromycet se můžeme setkat například s rodem Acremonium a jeho rezistencí k amfotericimu B a echinokandinům – zde je možným lékem volby vorikonazol. Raritními jsou také infekce způsobené Paecilomyces spp. nebo Trichoderma spp., obdobně málo častí původci jsou houby ze skupiny Dematiaceae. Jejich mikrobiologická diagnostika je obdobná jako u všech výše jmenovaných rodů, ovšem je třeba brát v úvahu, že nález těchto hub v klinickém materiálu může nezřídka znamenat kontaminaci z prostředí. Z časných diagnostických markerů by u těchto infekcí mohl být pozitivní glukan.

Závěr

Z výše řečeného vyplývá, že invazívní infekce způsobené vláknitými houbami jsou komplikací, která je provázena stále velice významnou mortalitou. Jejich diagnostika je „skládankou“, do které vstupují znalosti ošetřujících lékařů, klinických mikrobiologů, histopatologů. Aktivní spolupráce všech jmenovaných odborníků pomáhá zlepšit kvalitu péče o ohrožené pacienty a zároveň klade vysoké nároky na jejich erudici.

Práce byla podpořena VZ MSM6198959223 a granty Ministerstva zdravotnictví České republiky č. NS10441-3/2009 a NS10442-3/2009.


O autorovi: 1Mgr. Iva Kocmanová, 2MUDr. Zdeněk Ráčil, Ph. D.
1Fakultní nemocnice Brno, Oddělení klinické mikrobiologie

2Masarykova univerzita, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Brno, Interní hematoonkologická klinika

e-mail: ikocmanova@fnbrno.cz

Ohodnoťte tento článek!