Genetická diagnostika kandidových infekcí

Kvasinky rodu Candida způsobují velkou většinu systémových mykóz, jejichž incidence stále mírně stoupá. Laboratorní diagnostika se kromě mikroskopie tradičně opírá o detekci kvasinek automatizovanými hemokultivačními systémy. Dále je možný průkaz některých jejich antigenů, resp. metabolitů, jde však většinou o poměrně zdlouhavé nebo málo citlivé postupy s rizikem falešně pozitivních výsledků.

Souhrn

Molekulárněgenetické techniky nabízejí rychlou, vysoce citlivou a v poslední době i velmi specifickou alternativu. Základním požadavkem je rychlé získání co nejčistší DNA, dnes většinou pomocí komerčně dostupných souprav. Je podán přehled genetických metod, z nichž se jako nejperspektivnější jeví kvantitativní PCR v reálném čase, pro minimální riziko falešně pozitivních výsledků a možnost kvantitativního monitorování nálože kvasinek v průběhu onemocnění. Pro finální druhovou identifikaci kandid se kromě přímého sekvencování produktu jeví jako nejvhodnější enzymimunoanalýza, analýza tání a technologie DNA čipů.

Summary

Hamal, P., Rusková, L. Molecular genetic diagnosis of invasive Candida infections

Candida yeasts cause a vast majority of systemic mycoses; their incidence increase moderately but steadily. Rapid laboratory diagnosis is traditionally based on microscopy, automated blood culture systems and detection of some antigens and metabolites. However, these procedures are mostly rather time consuming, insensitive and connected with a risk of false-positive results. Molecular genetic methods provide a rapid, highly sensitive and, recently, also highly specific alternative. The basic requirement is obtaining highly pure DNA, currently by using commercially available kits. Further, an overview of genetic methods is presented in the article. To conclude, quantitative realtime PCR seems to be the most promising approach, because of a minimal risk of false-positive results and possibility to monitor the yeast load during the course of the disease. In addition to direct sequencing, enzyme immunoanalysis, melting analysis and microarrays seem to be the most appropriate techniques for final species identification of Candida spp.

Význam kvasinkových infekcí

Kvasinkovité mikroorganismy, zejména rodu Candida, způsobují 79–85 % všech nemocničních mykóz.(1) Na jednotkách intenzívní péče (JIP) v USA jsou čtvrtým nejčastějším nozokomiálním patogenem,(2) četnost systémových kandidóz na odděleních s pacienty po transplantacích se pohybuje mezi 20 a 40 %.(3) Jde stále o závažné onemocnění, jehož incidence nemá ani v posledním desetiletí, při extenzívním rozvoji systémové antifungální léčby, sestupný trend. Dlouhodobá analýza za léta 1997–2003 uvádí konstantní hrubou míru mortality, na rozdíl od invazívní aspergilózy, kde byla zaznamenána spíše klesající tendence.(4)

Rychlá diagnostika systémové kandidózy

Mezi největší úskalí v klinické diagnostice systémové kandidózy patří zpravidla její nespecifické příznaky. Navíc, na rozdíl od invazívní aspergilózy, která je specifickým problémem na určitých odděleních, je pro kvasinkové infekce charakteristické poměrně rozsáhlé spektrum základních onemocnění ohrožených pacientů. Proto jsou tyto mykózy v praxi často zjišťovány náhodně u nemocných, jejichž klinické vzorky byly odeslány do laboratoře s podezřením na bakteriálního původce.

I když je dnes k dispozici celá řada laboratorních metod pro rychlou detekci kandid v klinickém materiálu, úspěšnost průkazu infekce je stále poměrně malá. Nevýhodou mikroskopického vyšetření je především nízká citlivost. Automatizované hemokultivační systémy jsou schopné prokázat pouze životaschopné buňky, které navíc kolují v krvi jen v malém množství. Mimoto k detekci metabolické aktivity kvasinek v kultivačním médiu dochází až zhruba za dva dny, další 1–2 dny jsou potřebné k biochemické identifikaci izolátů. Záchyt mananového antigenu komerčně dostupnou soupravou je komplikován jeho nízkou hladinou v krvi a rychlým odstraňováním.(5)

K dispozici je i diagnostický kit k průkazu stěnového beta-glukanu, jde však o nespecifický panfungální test, náročný na přesnost laboraGenetická práce a náchylný k falešně pozitivním výsledkům, např. u pacientů hemodialyzovaných pomocí celulózových membrán. Detekce některých enzymů a metabolitů v krvi, resp. moči (sekreční aspartátové proteázy, enoláza, D-arabinitol, cytoplazmatické proteiny) zatím nefunguje zcela spolehlivě nebo má v současné době nízkou citlivost či nedostatečnou prediktivní hodnotu. Nevýhodou při hodnocení protilátkové odpovědi jsou často falešné výsledky: negativní u neutropenických pacientů, pozitivní u kolonizovaných osob, navíc ani konverze z negativity do pozitivity nekoreluje se vznikem invazívní formy infekce.

Za této situace představují velmi perspektivní alternativu k výše zmíněným postupům metody detekce genetického materiálu v klinických vzorcích. V případě kandid však jejich další vývoj výrazně zaostává za metodikami k průkazu aspergilů, což je důsledkem výrazně vyšší záchytnosti v hemokulturách v poObr. se zmíněnými vláknitými houbami a návazné výhodnosti práce s izoláty.

Genetická detekce kandid

Genetické metody se u kvasinek používají nejen k jejich přímému průkazu v klinickém materiálu, ale současně i k jejich druhové identifikaci. U systémové kandidózy, kdy je třeba brát v úvahu relativně častý výskyt rezistentních non-albicans druhů, zejména Candida glabrata a Candida krusei, je zmíněný přístup potřebný. Navíc je možné pomocí specifických sond přesně detekovat i současný výskyt dvou, teoreticky i více druhů kvasinek ve vzorku.

Mezi další výhody genetických metod patří především krátký časový interval potřebný k získání výsledků a vysoká citlivost vzhledem k možnosti amplifikace nukleových kyselin. Na rozdíl od kultivace lze prokázat také přítomnost odumřelých a rozpadtorní lých buněk včetně elementů vyskytujících se uvnitř fagocytů. Naopak mezi největší problémy patří absence standardizovaného a široce akceptovaného metodického postupu, falešně pozitivní výsledky v důsledku kontaminace a intermitentní pozitivita v následně odebraných vzorcích.

Klinický materiál a izolace nukleových kyselin

Pro genetickou detekci kandid lze využít celou řadu různých klinických vzorků, nejčastěji plnou krev nebo sérum, ale také krev již odebranou do hemokultivačních lahviček, bronchoalveolární laváž, moč, hnis či vzorky tkání. Metwally et al. v recentní studii zřejmě jako první přímo porovnali záchytnost kandidové DNA z plné krve a séra u kriticky nemocných, non-neutropenických pacientů s kandidémií a jako vhodnější doporučili sérum, jehož extrakční protokol trvá podstatně kratší dobu.(6) Podobně i McMullan et al. v nedávné prospektivní klinické studii podpořili detekci z tohoto typu materiálu. (7)

Některé experimentální práce, studující invazívní kandidózu na zvířecích modelech, dokumentovaly přítomnost „nahé“ DNA v krvi, snadno izolovatelné právě ze séra.(8) Srovnávací u neutropenických pacientů zatím publikována nebyla. Vzhledem k tomu, že se na přítomnosti mimobuněčné DNA v krvi mohou zásadním způsobem podílet fagocyty, je možné, že by hodnocení obou typů vzorků mohlo v takovém případě dopadnout opačně.(9) Pro vlastní izolaci DNA je většinou nutné využít sofistikované techniky, zahrnující odstranění vlivu inhibitorů PCR, často přítomných v krvi, jiných tělních tekutinách nebo tkáních, např. pomocí bovinního sérového albuminu.(10)

Pro zvýšení záchytnosti DNA u pacientů s kandidémií je doporučována jednodenní inkubace krevních vzorků při 34 °C(11) nebo využití tzv. mikrokoncentrátorů.(12) K rychlému získání co nejčistší DNA se dnes využívá řada komerčně dostupných souprav. Při porovnávání různých způsobů izolace DNA však byly zjištěny značné rozdíly v jejím množství a kvalitě, což může mít významný vliv na výsledky detekce. Severoirští autoři, kteří nedávno vyzkoušeli celkem sedm různých technik, z nich doporučili YeaStar genomic DNA kit (Zymo Research) pro velmi efektivní lýzu buněk, vysoce čistou DNA s minimální příměsí RNA, jednoduchost provedení a ekonomickou dostupnost.

Způsoby detekce nukleových kyselin

Genetické přístupy k záchytu kandid v klinickém materiálu jsou přehledně shrnuty na Obr.(14) Lze je rozdělit podle druhu detekované nukleové kyseliny, cílových sekvencí nebo podle toho, zda využívají amplifikace. Nedávno byl v českém tisku publikován přehledový článek charakterizující principy většiny genetických technik, určených k průkazu původců systémových mykóz.(15) Parametry vybraných metod, detekujících v klinických vzorcích kandidové nukleové kyseliny, jsou porovnány v Tab.
Metody detekce DNA Nejčastěji jsou používány amplifikační metody na bázi polymerázové řetězové reakce (PCR).

Obr.
– Algoritmus genetické detekce a identifikace kandid (podle(14))

Tab. – Porovnání parametrů vybraných genetických metod
pro detekci kandidových nukleových kyselin

Volba cílových sekvencí by měla být odrazem míry znalosti etiologického agens infekce. Metodiky založené na detekci části genů, specifických pro kandidy, byly publikovány v dřívějších letech a dnes se v literatuře objevují spíše sporadicky. Zmíněné sekvence se v genomu vyskytují téměř vždy jen v jedné kopii, což se může odrazit v nižší citlivosti příslušné techniky. Jedná se o geny pro lanosterol demetylázu,(16, 17) chitin syntázu,(18) sekreční aspartátovou proteinázu,(19, 20) heat shock protein 90(21) a aktin.(22) Uvedeným způsobem je možno prokázat C. albicans, ale i jiné medicínsky významné druhy tohoto rodu.

Většina současných prací se však zaměřuje na vysoce konzervované sekvence, přítomné v genomu ve velkém počtu kopií, konkrétně na gen pro ribosomální RNA (rRNA). Využívá se přitom vysoce citlivých přístupů, tj. dvoukolové nested, resp. seminested PCR a kvantitativní PCR v reálném čase (qRT-PCR). Primery bývají obvykle navrženy pro širší spektrum houbových patogenů (panfungální nebo detekující kandidy i aspergily), poté často následuje analýza amplifikovaného produktu s cílem identifikovat jednotlivé druhy mikromycet. Může být provedena ve druhém kole nested PCR druhově specifickými primery(20, 23) nebo pomocí tzv. multiplex PCR.(24)

Další běžný způsob spočívá v hybridizaci se sondou, odvozenou obvykle ze specifických sekvencí některého z tzv. vnitřních transkribovaných mezerníků (internal transcribed spacer, ITS) genu pro rRNA. V současné době se pro jednoduchost provedení a vysokou citlivost využívají zejména neradioaktivní biotinylované sondy a detekce hybridizace je založena na principu enzymimunoanalýzy (PCR-ELISA). Pro identifikaci C. albicans ji využili např. Löffler et al.(25) a Wahyuningsih et al.(26), pro širší spektrum kandid Badiee et al.(27) a v kombinaci se seminested PCR Ahmad et al.(28) Při qRT-PCR se využívají fluorescenční sondy.(29, 30)

Novou, velmi slibnou alternativu identifikace produktu qRT-PCR na úrovni druhu kandidy představuje využití analýzy tání pro svou jednoduchost, rychlost a ekonomickou nenáročnost. V průběhu denaturace (tání) dochází k různě rychlému, druhově specifickému uvolňování interkalovaného fluorescenčního barviva z dvouřetězcového amplikonu(31) nebo z hybridu sondy a amplikonu (tzv. biprobes),(32) což lze hodnotit fluorimetricky v samostatném přístroji pro analýzu tání nebo po amplifikaci přímo v real-time cykleru, vybaveném pro takové hodnocení.

Další technicky jednoduchou možností rozlišení amplikonů z různých druhů kvasinek je restrikční endonukleázová analýza, použitá např. Moracem et al.(33) při detekci kandidémií u febrilních pacientů s hematologickou malignitou. Mezi zřídka používané alternativy post-PCR identifikace patří především velmi perspektivní technologie DNA čipů, dále analýza délky amplifikovaných produktů, reverzní hybridizace a konformační polymorfismus jednovláknové DNA.(15) Z hlediska přesnosti nezpochybnitelnosti výsledku je nejlepší volbou sekvencování produktu, použité v diagnostice systémových kandidóz např. brazilskými autory.(34) I když jsou již k dispozici automatizované a komerčně dostupné systémy, jde stále o finančně nákladnou technologii.

Detekce fungální DNA pomocí sondy bez amplifikace se provádí nejčastěji postupem označovaným jako fluorescenční in situ hybridizace (FISH). Klinickým materiálem, kde je v poslední době FISH využívána, jsou hemokultury. Sondami bývají v uvedeném případě kombinované molekuly peptidu a nukleové kyseliny (peptide nucleic acid, PNA), schopné identifikovat C. albicans a C. glabrata.(35) Zmíněný postup může výrazně snížit náklady na antimykotickou léčbu pacientů, protože výsledek je k dispozici již do tří hodin od průkazu metabolické aktivity v hemokultuře.(36) Metody detekce RNA Přítomnost kandidové RNA v klinických vzorcích je možno prokázat postupem zvaným nucleic acid sequence-based amplification (NASBA).

Během cyklu podobného PCR se využívá činnosti tří enzymů, reverzní transkriptázy, RNázy H a T7 RNA polymerázy. Metoda je vysoce citlivá a specifická, její výhodou proti PCR je rychlost amplifikace, protože může využít kopie genů již namnožené samotnými buňkami při transkripci, a provádění reakce při jedné teplotě, takže není potřebný termocykler. Hlavním problémem, bránícím šíření uvedené techniky do diagnostické praxe, je zatím vyšší cena reakční směsi enzymů. V klinickomikrobiologických studiích byla NASBA rychlejší a citlivější při detekci kandid z krevních vzorků než automatizovaný hemokultivační systém(37) a dále výrazně zvýšila (21 vs. 34 %) záchytnost kandid z hemokultur.(38) V recentní studii prokázali Zhao et al. využitelnost NASBA v real-time formátu k rychlému záchytu širokého spektra bakteriálních i houbových patogenů z hemokultur včetně kandid.(39)

Závěr

Genetické techniky se stávají běžnou součástí diagnostiky ve stále větším počtu laboratoří, detekujících původce infekčních nemocí včetně mykóz. V oblasti molekulární mykologie dominuje vývoj metodik k průkazu aspergilózy, v diagnostice kandidóz představuje „zlatý standard“ hemokultivace, která je však schopna prokázat jen část infekcí. Postupně i zde byla vyvinuta celá řada různých genetických technik, jejichž cílem je urychlit a zvýšit záchytnost spolu se zachováním přesné druhové identifikace, nutné z důvodu poměrně častého výskytu druhů rezistentních k antimykotikům.

Pro zlepšení spolehlivosti genetické detekce a mezilaboratorní reprodukovatelnosti výsledků je třeba usilovat o konsenzus v podobě standardizovaného a široce akceptovaného metodického postupu. Z cílových úseků nukleových kyselin jsou preferovány více či méně panfungální sekvence s následnou rodovou, resp. druhovou identifikací. Technologicky se jako nejperspektivnější jeví qRT-PCR pro minimální riziko kontaminace, a tím falešně pozitivních výsledků, neboť detekce i analýza produktu se provádí bez nutnosti další manipulace; navíc je možné kvantitativní monitorování kandid v průběhu onemocnění. V této souvislosti je však neméně významné rozšiřování znalostí o kinetice výskytu fungální DNA u infikovaných pacientů a posuzování významu pozitivního výsledku v uvedeném kontextu.

Práce byla podpořena výzkumným záměrem MŠMT č. MSM6198959223 a grantem IGA MZ č. NR/8365-4.

O autorovi: Doc. MUDr. Petr Hamal, Ph. D., Mgr. Lenka Rusková

Univerzita Palackého v Olomouci, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Olomouc, Ústav mikrobiologie

e-mail: petr.hamal@fnol.cz

Ohodnoťte tento článek!