Laboratorní diagnostika invazívní kandidózy

Včasná a spolehlivá diagnostika invazívní kandidózy je stále předmětem řady diskusí. Autoři se v příspěvku na danou problematiku zaměřili z epidemiologického a laboratorně diagnostického pohledu. V epidemiologických souvislostech se v řadě studií potvrdilo, že Candida albicans je stále nejčastěji izolovanou kvasinkou (50–60 %), nicméně nejvyšší mortalitu mají infekce vyvolané C. glabrata.

Souhrn

Možnosti laboratorní diagnostiky jsou v příspěvku rozděleny do jednotlivých tematických celků, kdy největší část je věnována pohledu na možnosti kultivačního vyšetření a použití sérologických metod. Pro detekci invazívní kandidózy je stále nejdostupnější metodou se spolehlivými výsledky hemokultivace. Při použití hemokultivačních systémů je doporučeno založení hemokultury do aerobního média s/bez sorbentu a do média mykologického, kde rostou kvasinky podstatně rychleji. Je zdůrazněn význam monitoringu rizikových pacientů a sledování jejich kolonizace kvasinkami.
V případě sérologických metod je pro zvýšení senzitivity doporučováno kombinovat detekci kandidového antigenu v séru (manan) se stanovením protilátek (antimanan). Současně je vzhledem k nestabilnosti mananu v krevním oběhu doporučována jeho detekce z více vyšetření od téhož pacienta a uznání konsekutivní pozitivity. Vedle výše uvedených metod diagnostiky invazívní kandidózy se jako neméně důležitá metoda ukazuje mikroskopické vyšetření, a to včetně vyšetření histologického, a rovněž nově nastupující genetické metody.

Summary

Mallátová, N., Mencl, K. Laboratory diagnostics of invasive candidiasis

Early and reliable diagnostics of invasive candidiasis is still the subject of many discussions. In this article the authors focus on that issue from epidemiological and laboratory diagnostic perspective. The epidemiological context in a number of studies has shown that Candida albicans is still the most frequently isolated yeast (50–60 %), however, infections caused by C. glabrata have the highest mortality. The options of laboratory diagnostics are divided into different thematic units in this article; its largest part is devoted to looking at opportunities of cultivation examination and usage of serological methods. Hemocultivation is still the most accessible method for the detection of invasive candidiasis with reliable results. When using hemocultivation systems it is recommended to establish a hemoculture in an aerobic medium with or without sorbent and in a mycological medium, where yeast cells grow much faster. The importance of high-risk patients monitoring and monitoring of their colonization with yeasts is emphasized. For the sake of increased sensitivity in the case of serological methods it is recommended to combine Candida antigen detection in serum (mannan) with determination of antibodies (antimannan). At the same time, given the fragility of mannan in blood circulation its detection through multiple tests from the same patient and consecutive positivity recognition is recommended. Besides the above-mentioned method for diagnostics of invasive candidiasis microscopic examination, including histological examination, as well as newly emerging genetic methods, proves to be an equally important method.

Epidemiologie invazívní kandidózy

V současné době doporučovaný termín invazívní kandidová onemocnění je ekvivalentem názvu invazívní kandidóza, systémová kandidóza nebo dříve používaného názvu diseminovaná kandidóza. Základní formou je kandidémie, která nemusí být vždy detekována, ale provází každé orgánové kandidové onemocnění. Pod obecně používaný název invazívní kandidózy jsou někdy zahrnována i méně častá onemocnění vyvolaná příslušníky jiných rodů kvasinek než Candida, jako např. Saccharomyces, Trichosporon nebo Cryptococcus. Kvasinky jsou běžnou součástí fyziologické flóry člověka, mohou však za určitých okolností způsobit onemocnění jakéhokoli orgánu v těle. Předpokladem je prolomení přirozených bariér a nedostatečná obranyschopnost hostitele. Proto mezi nejvíce ohrožené patří pacienti s dlouhodobou neutropenií, po transplantaci kmenových buněk krvetvorby (HSCT – hematopoietic stem cell transplantation), po orgánových transplantacích, s hematologickými malignitami, se solidními nádory, pacienti na jednotkách intenzívní péče, léčení steroidy, novorozenci s nízkou porodní hmotností, pacienti s HIV a po chirurgických výkonech, zvláště v oblasti trávicího ústrojí.

K vzestupu kandidových infekcí dochází hlavně od 80. let minulého století. Mezi rokem 1984–1993 vzrostla incidence kandidémií 2,7krát.(1) Nárůst kandidových infekcí byl pak v 90. letech částečně zastaven uvedením antimykotika flukonazolu do praxe. Na druhé straně však stále výrazně vzrůstá počet osob s hematologickými malignitami a nádorovým postižením orgánů, kdy jsou tito pacienti vystaveni agresivní imunosupresivní léčbě. Ve studii Wisplinghoffa et al. bylo analyzováno 24 179 infekcí krevního řečiště a kvasinky byly jejich čtvrtým nejčastějším vyvolavatelem. Současně byly také původcem infekcí s nejvyšší mortalitou. Na JIP tvořily kvasinky 10,1 % infekcí s mortalitou 47,1 %, na ostatních odděleních 7,9 % infekcí s mortalitou 29 %. Nejčastějším druhem vyvolávajícím infekce byla C. albicans (53,8 %) a C. glabrata (18,8 %). Nejvyšší mortalita pak byla zaznamenána u infekcí vyvolaných C. krusei (58,7 %) a C. glabrata (50,1 %).(2) Při analýze infekcí krevního řečiště z U. S. epidemiologické databáze v letech 2000–2005 byly kandidy příčinou infekce pouze v 1,2 % případů. Současně byly však infekcí s nejvyšší mortalitou, nejdelší dobou hospitalizace a cenově nejnákladnější léčbou. Oproti infekcím vyvolaným např. gramnegativy byla doba hospitalizace v průměru o 5,6 dne delší a náklady na léčbu více než trojnásobné.(3) V prospektivní surveillance studii z USA byl v letech 2001–2006 sledován výskyt invazívních fungálních onemocnění (IFD) u 16 200 pacientů v 23 transplantačních centrech.

U pacientů po HSCT činily kandidové infekce 28 % invazívních fungálních (IFD), nejčastějším vyvolavatelem byla C. glabrata (33 %). Až po ní následovala C. albicans (20 %), C. parapsilosis (14 %), C. tropicalis (8 %) a C. krusei (6 %).(4) Při solidních orgánových transplantacích byly kandidové infekce nejčastěji přítomny u pacientů po transplantaci jater a slinivky, nejméně často po transplantacích plic. Nejčastějším vyvolavatelem byla C. albicans (46 %), pak C. glabrata (25 % ), C. parapsilosis (9 %), C. tropicalis (4 %), a C. krusei (2 %).(5) V Evropě se multicentrické studie účastnilo 7 zemí a hodnoceno bylo 2089 epizod kandidémie. Prevalence kandidémie byla 0,2–0,38/1000 hospitalizací. Nejčastěji byli postiženi pacienti na chirurgických odděleních, následně na JIP, pacienti se solidními tumory, léčení steroidy, s hematologickými malignitami, nedonošenci a HIV pozitivní pacienti. Nejčastěji se vyskytující kvasinkou byla C. albicans (56 %), nejvyšší mortalitu však vykazovaly infekce vyvolané C. glabrata (45 %) a C. krusei (55,3 %). Zajímavý byl posun spektra kandid vyvolávajících infekce krevního řečiště u pacientů s hematologickými malignitami. Zde činila C. albicans pouze 36 %.(6) Změnu v epidemiologii kandidových infekcí na hematologických pracovištích dokládá ve své práci i Hachem et al. Sledoval původce kandidémií u pacientů s hematologickými malignitami. V letech 1988–1993 vyvolala C. albicans onemocnění u 34,4 % ze sledovaného souboru 230 pacientů, C. glabrata u 12,2 % a C. krusei u 7,4 % pacientů. V letech 1993–2003 byla C. albicans původce onemocnění jen u 13,5 % ze souboru 281 pacientů, C. glabrata u 30,6 % a C. krusei u 24,2 % pacientů. Tento rozdíl byl na hladině statistické významnosti.(7) Změna spektra je přisuzována zavedení profylaxe flukonazolem. Přehled incidence kandidémie v evropských zemích a USA je uveden v Tab. 1.(8)

Tab. 1 – Incidence kandidémie v Evropě a v USA(8)

Diagnostická kritéria

Podle kritérií EORTC/MSG (European Organization for Research and Treatment of Cancer/Invasive Fungal InfectionsCooperative Group and the National Institute of Allergy and Infectious Diseases Mycoses Study Group) je za prokázanou invazívní kandidózu považovaná infekce potvrzená histologicky nebo mikroskopicky průkazem blastospor či pseudomycelií ve vzorku získaném invazívními technikami (aspirací, biopticky, peroperačně, endoskopicky) nebo kultivačně ze vzorku asepticky odebraného z normálně sterilních lokalit vykazujících klinické či radiologické známky infekce. Pro průkaz invazívních onemocnění vyvolaných Cryptococcus neoformans je uznáván průkaz antigenu latexovou aglutinací v moku. Za pravděpodobnou můžeme diagnózu označit tehdy, máme-li pacienta predisponovaného k mykotickým infekcím s klinickými známkami onemocnění a splňujícího mykologická kritéria. Mezi ně řadíme mikroskopický a kultivační průkaz mikromycet z méně validních materiálů, než jsou původně sterilní tekutiny nebo tkáně (sputum, bronchoalveolární tekutina, 2 pozitivní vzorky moče odebrané přes katétr), průkaz (1-3)-ß-D-glukanu a průkaz kryptokokového antigenu v séru. Průkaz kandidových antigenů a protilátek proti nim (manan a antimanan) a průkaz pomocí molekulárně genetických metod mezi tato kritéria řazeny nejsou. Abychom diagnózu mohli považovat za tzv. možnou, nemusí být splněno mykologické kritérium.(9)

Histologický průkaz

Průkaz blastospor či pseudomycelií pomocí histochemických metod z tkáně je považován za základní diagnostický parametr prokázané invazívní kandidózy. Preparáty jsou barveny hematoxilin-eozinem, PAS (periodic acid Schiff) a stříbřeny dle Grocotta; zvláště toto barvení dovoluje vyniknout charakteristickým houbovým strukturám. Histolog popíše i míru postižení okolní tkáně, invazivitu houbového procesu a přítomnost zánětu v okolí. Obraz kandidózy bývá poměrně typický, nelze však určit, o jaký druh kandid se jedná. Bližší identifikace pomocí monoklonálních protilátek, fluorescenčních metod nebo PCR není v ČR běžně používána. Je proto vhodné zasílat většinou poměrně náročně získaný materiál nejen k histologickému vyšetření, ale zároveň i na mykologickou kultivaci. Předejdeme tím nutnosti opakovat invazívní zásah, abychom určili původce infekce a mohli eventuálně provést stanovení citlivosti k antifungálním látkám a rovněž zrychlíme celý diagnostický proces.

Mikroskopické a kultivační techniky

Mikroskopický nebo kultivační průkaz kvasinek ve vyšetřovaném materiálu může být zásadní v diagnostice systémové kandidózy, ale pouze v případě, že vyšetřujeme dostatečně validní klinický materiál. Metodika odběru a způsob transportu jsou uvedeny v Tab. 2. Použití transportního média může ztížit nebo i znemožnit provedení mikroskopického vyšetření.

Tab. 2 – Mykologická vyšetření – odběr a transport

Mikroskopie

Preparáty z vyšetřovaného materiálu obarvené běžnými barvícími technikami (Gram, Giemsa, fluorescenční barvení) lze prohlížet ve velice krátké době po odběru a nález může vést ke stanovení diagnózy. Kvasinky vidíme jako tenkostěnné, kulaté či oválné buňky velikosti 4–6 µm, reprodukující se pučením. Tyto buňky mohou dále vytvářet pseudomycelia až vláknitého charakteru, jejichž přítomnost bývá hodnocena jako příznak invazivity příslušné kvasinky. Současně máme možnost sledovat i přítomnost bakteriální flóry včetně množství a charakteru leukocytů jako markerů zánětu.
Pro diagnostiku Pneumocystis jiroveci jsou mikroskopické techniky spolu s PCR jedinou dostupnou metodou. Záchytnost závisí na druhu a kvalitě odebraného materiálu. Z BAL je udávána až 90 %, naproti tomu z indukovaného sputa pak pouze 30 %. Preparáty barvíme na průkaz cystických forem podle Grocotta či Gram-Weigerta, event. toluidinovou modří (Obr. 1), na průkaz trofozoitů barvením Giemsa-Romanovski. Rovněž lze využít komerčně dodávané soupravy založené na detekci pomocí nepřímé fluorescence s využitím monoklonálních protilátek (MonoFluoTM Kit Bio-Rad, Francie).
Pro průkaz pouzder kryptokoků se používá tzv. negativní barvení tuší (Buriho barvení). Mykotické elementy jsou často dobmikrobiologická viditelné i v nativním preparátu nebo v preparátu zhotoveném pomocí 20% KOH. Mikroskopické vyšetření kromě jiného umožňuje hodnotit i validitu zaslaného materiálu podle charakteru bakteriální flóry a druhu epitelií.

Obr. 1 – Pneumocystis jiroveci, barveno toluidinovou modří

Kultivace

Kvasinky rostou dobře na většině kultivačních médií, za standardní je považován Sabouraudův glukózový agar (Obr. 2) nebo Sabouraudův agar s přídavkem antibiotika k zábraně růstu baktérií. Nárůst můžeme očekávat za 24–48 hodin při inkubaci v 37 °C. Kolonie kvasinek různých druhů si jsou velice podobné a morfologie kolonií tak neumožňuje bližší identifikaci. Candida albicans můžeme jednoduše identifikovat pomocí tzv. germ-tube testu, což je test založený na schopnosti C. albicans vytvářet do dvou hodin po inokulaci na půdy s obsahem koňského či bovinního séra nebo přímo v samotném séru při inkubaci v teplotě 37 °C tzv. klíční hyfy (Obr. 3). Identifikace C. albicans je rovněž možná podle schopnosti tvorby silnostěnných chlamydospor na rýžovém (Obr. 4), případně žlučovém agaru. Pro základní identifikaci jsou dnes hojně využívána tzv. chromogenní média, na kterých kvasinky rostou v různě barevných koloniích v závislosti na druhu použitého chromogenního substrátu (Obr. 5). Výhodou těchto půd je i jednodušší odhalení vícedruhových, tedy smíšených kandidových infekcí.

Obr. 2 – Candida krusei na Sabouraudově glukózovém agaru

Obr. 3 – Candida albicans – germ-tube test

Obr. 4 – Candida albicans – tvorba chlamydospor na rýžovém agaru

Obr. 5 – Chromogenní medium firmy bioMérieux. Ve směru hodinových ručiček C. albicans, Trichosporon asahii, C. krusei, C. parapsilosis, C. tropicalis, C. glabrata

Zásadně se však většinou dobře barevně odlišují pouze kolonie C. albicans, v některých případech další 2–3 druhy, a proto je nutné využít k identifikaci kvasinek jejich biochemické vlastnosti, což představuje schopnost asimilace zdrojů uhlíku a dusíku, fermentace sacharidů a charakteristickou mikromorfologii. Komerčně dostupné jsou identifikační soupravy, např. Auxacolor (Bio-Rad, Francie), ID32 C (bioMérieux, Francie) nebo Candidatest 21 (Pliva-Lachema, ČR), kde se identifikace daří za 24–72 hodin. Souprava RapIDTM (Remel, USA) poskytuje identifikaci základních druhů do 4 hodin. Použít lze samozřejmě i automatizované systémy jako VITEK2 nebo hmotnostní spektrometr MALDI-TOF (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization – Time Of Flight). V mezinárodní multicentrické studii ARTEMIS bylo v období 1997–2005 na více než 200 000 izolátech potvrzeno, že z asi 150 druhů kandid se u člověka vyskytuje hlavně C. albicans (65,6 %), i když její výskyt má mírně klesající trend, dále C. glabrata (10,2–11,4 %), C. tropicalis (5,4–7,5 %), C. parapsilosis (4,8–6,6 %), C. krusei (2,3 %), vzácněji pak C. guilliermondii, C. lusitaniae, C. kefyr, C. lipolytica, C. famata, C. rugosa, C. inconspicua, C. dubliniensis.

Výskyt kvasinek rodu Trichosporon, Saccharomyces, Rhodotorula, Pichia, Hansenula je velice raritní a celosvětově nepřesahuje 0,5 %. Cryptococcus neoformans se vyskytoval v 1,5 % ze všech identifikovaných agens.(10) Candida albicans běžně osídluje kůži a sliznice gastrointestinálního, respiračního i genitourinálního traktu. Tyto pak mohou být zdrojem endogenní infekce u imunokomprimovaného jedince. Miranda et al. na souboru 63 pacientů s hemokultivačně potvrzenou kandidémií prokázal molekulární typizací, že 50 % C. albicans izolovaných z hemokultur se shodovalo s kmeny C. albicans izolovanými ze zažívacího traktu téhož pacienta.(11) Význam kolonizace kandidami byl v minulých letech široce studován a obecně je kolonizace přijímána jako rizikový faktor. Hodnotí se nejen druhový nález, ale i intenzita nálezu a počet osídlených lokalit.(12) Proto u rizikových pacientů provádíme tzv. monitoring a sledujeme osídlení lokalit, které v konečném důsledku nemají zásadní vliv na stanovení diagnózy (stěry z kůže, sliznic, materiály z dýchacích cest, urogenitálu, stolice).
Nejvíce diskutovaný bývá nález kandid v moči, který může být projevem asymptomatické kandidurie stejně jako již diseminované kandidózy. Doporučuje se proto odebírat cévkovanou moč nebo se podle EORTC/MSG požaduje získání 2 pozitivních vzorků moče odebraných bez katétru. Podle Pappase se nález hodnotí jako významný při počtu 104 a více u pacientů bez močového katétru a s klinickou symptomatologií, neutropenií, pobytem na JIP, u novorozenců s nízkou porodní hmotností, u vrozených vývojových vad nebo po urologických zákrocích.(13) Při interpretaci nálezu kvasinek v moči nám může významně pomoci mikroskopické vyšetření, kde můžeme zhodnotit závažnost nálezu podle přítomnosti leukocytů a event. další bakteriální flóry.

Mikroskopie je nepostradatelná i při hodnocení nálezů z dýchacích cest. Kandidy běžně kolonizují dýchací trakt, zvláště u pacientů na řízené ventilaci, u pacientů léčených antibiotiky a steroidy. Bylo popsáno, že 20 % ventilovaných pacientů má již po 48 hodinách pobytu na JIP kultivačně potvrzenou kandidu v tracheobronchiálním sekretu.(14) Primární kandidová pneumonie je velice raritní záležitostí, častěji se objevuje pneumonie sekundární vzniklá hematogenní diseminací z trávicího ústrojí nebo kůže. Incidence je udávána 0,23–4,5 %.(15) Klinický obraz stejně jako nález pomocí zobrazovacích metod jsou nespecifické a jednoznačnou diagnózu určí pouze histologický průkaz zánětu v plicní tkáni. Při vyšetření sekčních materiálů z plic od 1960 pacientů byla kandida prokázána kultivačně v 61 vzorcích, histologicky však byla pneumonie prokázána pouze u 3 vzorků.(16) V materiálech z dolních dýchacích cest, zvláště u sputa, odhalí vyšetření jak příměs bakteriální flóry dutiny ústní, tak nález charakteristických epitelií i množství leukocytů signalizujících sílu zánětu. Tím jsme schopni určit jak validitu vzorku, tak i klinickou závažnost kandidové infekce. Významným pomocníkem při mikroskopickém hodnocení může být také kvantifikace nálezu a charakteristika přítomných vývojových stadií mikromycety (blastospory, pseudomycelia), a to nejen v dýchacích cestách.

Hemokultivace

Podstatou hemokultivace je odběr krve pacienta a inokulace do hemokultivačního média v lahvičkách, které jsou pak dále inkubovány a sledovány v automatickém systému. Hemokultivační vyšetření (HMK) je jedno z nejdostupnějších a v současnosti stále nejpřínosnějších vyšetření při podezření na invazívní kandidózu. Záchytnost vyšetření při kandidémii či invazívní kandidóze je při dodržení všech zásad asepse udávána okolo 50 %, a to i u histologicky potvrzených systémových kandidóz.(17) Vhodné je vždy odebrat HMK před zahájením terapie, a to minimálně dva odběry (2x 7–10 ml) s časovým odstupem (max. do hodiny) nebo ze dvou různých odběrových míst. U dětí do tří let věku je možné využít tzv. dětské lahvičky, do kterých stačí inokulovat menší množství krve (cca 5 ml). Doporučuje se, aby byly lahvičky s hemokulturou vloženy do automatického kultivačního systému do jedné hodiny od jejich inokulace. Systém monitoruje produkci CO2 množících se mikroorganismů. V ČR jsou nejčastěji zastoupeny 2 typy automatů: kolorimetrický systém BacT/Alert (bioMérieux, Francie) a fluorimetrický systém Bactec (Becton Dickinson, USA). Hemokulturou pak rozumíme všechny lahvičky inokulované z jednoho odběru.

Standardně jsou očkovány lahvičky určené pro aerobní kultivaci, případně jsou doplňovány i o lahvičky pro kultivaci anaerobní. Při podezření na mykotickou infekci lze dnes použít také pro tento účel vytvořené speciální mykologické lahvičky. Pro hemokulturu odebíranou až po zahájení terapie je možné použít lahvičky se sorbentem, který na sebe váže antimikrobiální látku. Horvath et al. porovnával aerobní, anaerobní a mykologické kultivační médium v systému Bactec i BacT/Alert a zjistil, že záchytnost kandid je v obou systémech srovnatelná, v mykologických médiích 100%, velice dobrá v aerobních médiích (Bactec 90 %, BacT/Alert 100 %), anaerobní média pro tyto záchyty vhodná nejsou.(18) Chiarini et al. vyhodnotil nálezy z 1253 hemokultur, které byly odebrané do aerobního, anaerobního i mykologického média. Kvasinky tvořily celkově 12,7 % nálezů, na JIP však představovaly 25% podíl. Pouze v mykologickém médiu rostlo 27 % kvasinek a 18 % kvasinek rostlo pouze v aerobním médiu. Při smíšené infekci byl v šesti případech nárůst kvasinky v aerobním mediu potlačen. V mykologickém médiu rostly kvasinky signifikantně rychleji než v médiu aerobním. Čas do automatické detekce byl v mykologickém médiu v průměru 29,1 hodiny, v aerobním 38 hodin. Na základě svých pozorování doporučili autoři zmíněné studie nabírat na JIP a hematoonkologických pracovištích hemokultury do všech tří médií.(19)

Zajímavé je také zjištění, že doba růstu C. glabrata v HMK je výrazně delší než u ostatních druhů, a to dvojnásobná ve srovnání s C. albicans a téměř trojnásobná ve srovnání s C. tropicalis.(20) Podobně Horvath et al. sledoval detekci 15 druhů kandid v závislosti na typu kultivačního média, velikosti inokula a času odezvy v systému BacT/Alert 3D. Výsledky potvrdily výbornou záchytnost mykologického a aerobního kultivačního média. I při menším množství inokula vyrostly všechny testované druhy do pěti dnů, s výjimkou C. lipolytica.(21) Odběr krve pouze přes centrální žilní katétr není považován za vhodný, neboť se v tomto místě může jednat o fokus infekce. Rovněž je obtížné laboratorně rozlišit nekatétrové kandidémie od katétrové sepse. Za tímto účelem je na kultivační vyšetření nejčastěji zasílán sterilně odstřižený konec katétru v suché sterilní zkumavce. Tento materiál je možno vyšetřit semikvantitativní metodou podle Makiho, kdy se segment katétru poválí po kultivační půdě a následně se spočítá výsledný počet narostlých kolonií. Také je možné zvolit metodu s využitím ultrazvuku (sonikace), který při působení na katétr dokáže z jeho povrchu uvolnit adherované mikroorganismy. Tato metoda je sice pracnější, zaručuje však lepší intraluminární detekci a kvantifikaci přítomného agens.

Pokud z nějakého závažného důvodu nelze katétr vyjmout, sleduje se a srovnává čas pozitivity HMK získané z periferie a přes katétr. Předpokládá se, že vzhledem k masivnějšímu osídlení katétru je dříve hlášena pozitivita z odběru přes katétr než z odběru mimo katétr.(22) Ben-ami et al. zjistil, že čas do pozitivity u HMK odebraných z periferie je 38,2 ± 3 hodiny a u HMK odebraných přes centrální žilní katétr je signifikantně nižší, a to 17,3 ± 2 hodiny.(23) Čas pozitivity HMK za více než 30 hodin může podle autorů vyloučit katétrovou sepsi. Je možné také vyšetřit intraluminární brush (stěr z lumen katétru) nebo stěry z okolí a vstupu katétru. Bouza et al. srovnával přínos technik detekujících katétrovou sepsi bez vyjmutí katétru. Sledoval výsledky stěrů z okolí vstupu katétru, kvantitu nálezu při odběru HMK z periférie a přes katétr a rozdílný čas pozitivity při odběru z periférie a přes katétr. Jako nejpřínosnější se ukázalo sledování rozdílných časů hlášení pozitivity.(24) Centrální žilní katétr je dlouhodobě považován za rizikový faktor pro pacienty s kandidémií. Rodriguez et al. prokázal ve dvouleté surveillance studii benefit včasného odstranění katétru a Pappas jednoznačně doporučuje vyjmutí katétru i při ojedinělém nálezu kandid v HMK.(13, 25)

Kandidové infekce krevního řečiště jsou spojovány s vysokou mortalitou. Přesto, že nejčastěji se vyskytujícím druhem je C. albicans, bývá nejvyšší mortalita spojována spíše s C. glabrata nebo C. krusei.(2, 6, 26) Zásadní pro zvládnutí infekce je včasné zahájení antimykotické terapie. Morrell et al. dokládá na 157 případech kandidémie sledovaných v období 2001–2004, že zpoždění více než 12 hodin při zahájení léčby (měřeno od doby hlášení pozitivní HMK) vede ke zvýšení mortality o více než 50 %.(26) Právě delší doba do nárůstu C. glabrata v hemokultuře tak může být jedním z důvodů vyšší mortality u infekcí vyvolaných právě touto kvasinkou. Snahou mikrobiologa by mělo být přinést klinikovi co nejdříve informaci nejen o pozitivním hemokultivačním nálezu, ale také včas identifikovat původce infekce. Zde je třeba připomenout, že germ-tube test pro identifikaci C. albicans lze velice spolehlivě provést i přímo z hemokultivační lahvičky a získat tím rozlišení C. albicans a non-albicans do 2 hodin po nahlášení pozitivní HMK.(27) K identifikaci kvasinek přímo z hemokultivačního média lze rovněž poměrně spolehlivě a v krátkém časovém intervalu využít metod molekulární biologie.(28, 29) Hemokultivační vyšetření je stále základem při průkazu invazívních kandidových infekcí. Úspěšné zvládnutí preanalytické i analytické fáze, rychlá a erudovaná interpretace výsledku mohou mít pro pacienta život zachraňující význam.

Sérologické metody

Metody detekující antigeny, proteiny, metabolity nebo protilátky v séru a jiných tělních tekutinách nazýváme obecně sérologické. V diagnostice invazívní kandidózy je experimentováno s průmikrobiologická extracelulární aspartylproteinázy jako faktoru virulence kandid, cytoplazmatického proteinu o síle 47 kDa (produkt štěpení známého heat-shock proteinu), s průkazem enolázy (antigen 48 kDa) a protilátek proti ní nebo metabolitu D-arabinitolu. V praxi se ovšem uchytily a komerčního úspěchu se dočkaly fakticky pouze tři metody. A to stanovení vysoce imunogenního antigenu buněčné stěny (manan), protilátek proti němu (antimanan) a průkaz tzv. panfungálního antigenu (1-3)-ß-D-glukanu. Žádná z těchto metod nemá však zásadní postavení v diagnostice invazívní kandidózy a výsledky je třeba hodnotit v kontextu s klinikou a dalšími diagnostickými markery.
Při podezření na invazívní kryptokokové infekce je možné metodou latexové aglutinace (Pastorex Crypto Plus, BioRad, Francie) detekovat přítomnost antigenu kryptokoků glukuronoxylomananu v séru, moku, moči a bronchoalveolární tekutině.

Manan a antimanan

Manan je teplotně stabilní antigen buněčné stěny a lze ho tedy uvolnit tepelnou denaturací z komplexu s protilátkou. Do séra i jiných tělních tekutin je vylučován při invazívní kandidové infekci. Tento antigen může být detekován latexovou aglutinací (Pastorex Candida, Bio-Rad, Francie) s detekčním limitem 15 ng mananu/ml, kde je výsledek udáván kvalitativně nebo dnes téměř výhradně doporučovanou senzitivnější metodou ELISA (detekční limit 1 ng mananu/ml, Platelia Candida Ag, Bio-Rad, Francie). Výsledek je udáván kvantitativně. Obě metody využívají k detekci monoklonální protilátku EBCA-1 proti ? 1-5 oligomanosidáze. Přesto, že metoda je standardizována pro použití v séru, je doložen také úspěšný průkaz mananu v moku při kandidové meningitidě.(30) Senzitivita testu je udávána od 40 % do 75 %, specificita od 49 % do 100 %.(31, 32, 33, 34) Sendid et al. prokázal zvýšení senzitivity (93 %) při kombinaci průkazu mananu s průkazem protilátky proti mananu-antimananu metodou ELISA (Platelia Candida Ab, Bio-Rad, Francie).(35)

Nízká specificita testu stanovujícího pouze antimanan je dána hlavně tím, že protilátky proti mananu vytváří i kolonizovaní pacienti a tvorba protilátek u imunosuprimovaných pacientů je velice omezena. Vyšší senzitivitu při kombinování testů potvrzují i další autoři.(36) Exprese antigenu na povrchu buněčné stěny je u jednotlivých druhů kandid rozdílná. Senzitivita testu tedy závisí na druhu kandidy vyvolávající infekci. Vyšší senzitivitu má kombinace manan-antimanan u infekcí vyvolaných C. albicans, C. glabrata a C. tropicalis (100 %, 83 %, 80 %), a to ve srovnání s C. kefyr, C. parapsilosis a C. krusei (50 %, 40 %, 50 %).(37) Pozitivita testu byla prokázána i při experimentální reakci s antigeny některých méně běžných kvasinek (C. dubliniensis, C. famata, C. guilliermondii), Geotrichum candidum a Fusarium verticillioides. Antigeny připravené z ostatních 54 druhů hub včetně kryptokoků, aspergilů, zygomycet, penicilií či dermatofyt zkřížené reakce nevykazovaly.(38) Problematické může být také hodnocení pozitivního výsledku u kolonizovaných pacientů s mukozitidou, kde můžeme předpokládat zvýšenou prostupnost kandidového antigenu přes poškozenou mukózu do krve.

V cirkulaci je manan nestabilní, je rychle eliminován, senzitivita testu se tedy zvyšuje s počtem realizovaných vyšetření u jednoho pacienta.(37) Uznání tzv. konsekutivní pozitivity (minimálně 2 pozitivní vzorky) považují při interpretaci výsledku za přínosné i Ellis et al., kteří sledovali skupinu 100 pacientů s febrilní neutropenií. Během deseti dnů febrilní neutropenie bylo odebráno každému pacientovi 5 vzorků pro detekci mananu a antimananu metodou ELISA (Bio-Rad). Statistickou analýzou (ROC křivky) byl vyhodnocen jako optimální cut off 0,25 ng/ml pro manan a 2,6 UI/ml pro antimanan. Jako optimální autoři hodnotili konsekutivní pozitivitu, při níž dosáhli senzitivity 73 %, specificity 80 %, pozitivní prediktivní hodnoty (PPV) 36 % a negativní prediktivní hodnoty (NPV) 95 %. Nižší specificitu testu pak vysvětlují vysokým procentem kolonizovaných pacientů (60 % mělo kolonizační index > 0,5). Pro relativně vysokou NPV považovali metodu za přínosnou i pro vysokou možnost vyloučení kandidové infekce.(39) (1-3)-ß-D–glukan (1-3)-ß-D–glukan (BDG) je polysacharid buněčné stěny mnoha druhů mikromycet a je uvolňován do okolí během počátečních fází růstu houby. Detekován však může být jen u některých z nich (Candida spp., Trichosporon spp., Aspergillus spp., Fusarium spp., Acremonium spp., Pneumocystis jiroveci a další), u jiných je obsažen v prakticky nedetekovatelném množství (Mucorales, Cryptococcus spp.).

Proto hovoříme o tzv. panfungálním antigenu. Detekce je založena na schopnosti glukanu aktivovat faktor G získávaný z lyzátu amébocytů ostrorepa amerického (Limulus polyphenus) v komerční soupravě FungitellTM (Associates of Cape Cod, USA), která je k detekci využívána v Evropě, nebo ostrorepa výchoasijského (Tachypleus tridentatus) v soupravách japonské provenience. Produkt štěpící reakce je následně vizualizován a detekován kolorimetricky nebo turbidimetricky.(40) Detekční limit je velice nízký, liší se v jednotlivých soupravách, hodnoty jsou udávány v pikogramech ml. Rozdílnost detekčních souprav a jejich interpretačních kritérií může být jedním z důvodů rozdílných výsledků a náhledů na tento test. Obayashi et al. při použití japonské soupravy FungiTec G (Seikagaku Kogyo Corp., Tokio, Japonsko) udává na souboru 200 pacientů s febrilní neutropenií senzitivitu 90 %, specificitu 100 % a vysokou NPV (97 %). To by znamenalo, že při negativním výsledku je fakticky vyloučena kandidová infekce.(41) Jiní autoři však tato optimistická čísla nepotvrzují.(42, 43) Vzhledem k tomu, že se pracuje s velice malým množstvím materiálu (5 µl), je metoda zatížena i větší možností chyby.

Falešně pozitivní reakce jsou popsány při hemodialýze s celulózovou membránou, při podání antibiotik, některých krevních derivátů nebo při bakteriémii.(42, 43, 44) Pickering et al. detekoval u pacientů na JIP pozitivní (1-3)-ß-D–glukan i u nemocných s prokázanou grampozitivní i gramnegativní sepsí a proto metodu označil jako nevhodnou pro použití na JIP.(43) Ráčil et al. vyšetřil (1-3)-ß-D–glukan v 1154 vzorcích séra od 91 pacientů s hematologickými malignitami. Incidence invazívních fungálních onemocnění v souboru byla 8,6 %. Z výsledků je zřejmé, že specificita i senzitivita testu jsou závislé na zvoleném cut off. Maximální senzitivita (88,9 %) byla dosažena při cut off > 80 pg/ ml, avšak při relativně nízké specificitě (40,7 %). Za klinicky přínosnější označili autoři uznání konsekutivní pozitivity (2 vzorky) při cut off > 60 pg/ml, kdy senzitivita byla 66,7 % při specificitě 47,7 %. Relativně nízká PPV (13,6 %) svědčí pro vysoké procento falešných pozitivit. Jejich zdroj se však nepodařilo objasnit. Autoři neprokázali ani vztah mezi výsledky a podáním empirické antimykotické léčby, antibiotik či infúzních roztoků, ani závislost na přítomnosti a stupni mukozitidy či kolonizaci kvasinkami. Metodu hodnotili jako přínosnou spíše v kombinaci s detekcí galaktomananu při průkazu aspergilových infekcí.(45) Pro detekci kandidových infekcí je její využití omezeno nejen tím, že se jedná o průkaz nespecifického houbového antigenu, ale i poměrně vysokým procentem falešných pozitivit. Metoda je v současnosti využívána spíše k experimentálním účelům než v běžné praxi.

Molekulárněgenetické metody

Metody založené na detekci nukleové kyseliny kandid jsou velice nadějnou cestou v diagnostice invazívních kandidových infekcí. Od počátku 90. let je patrná snaha o vývoj obecně akceptovatelného standardizovaného postupu. Je zřejmé, že se jedná o vysoce senzitivní metody, schopné poměrně rychle – ve srovnání s klasickými technikami – detekovat minimální množství buněk v různých druzích klinického materiálu (krev, tkáň, mok, moč, punktáty z dutin), ale i např. v hemokultivačních médiích. Prvním krokem je získání co nejčistší houbové nukleové kyseliny, která by mohla být v další fázi specifikována buď přímou hybridizací (FISH metoda – fluorescenční hybridizace in situ), nebo namnožena (amplifikována) pomocí primerů (PCR – polymerázová řetězová reakce). PCR je dnes prováděna v různých modifikacích. Zvolené primery mohou být společné pro více druhů hub, a pak mluvíme o tzv. panfungální detekci vhodné pro stavy nejasné etiologie – nebo se jedná o primery úzce specifické pro jednotlivé druhy. Z tohoto pohledu se jeví jako ideální dvoustupňový proces (multiplex PCR), kdy v první fázi je amplifikován nespecifický úsek DNA a následně jsou použity druhově specifické primery. Tyto vysoce senzitivní metody jsou ale, bohužel, více ohroženy kontaminací, a tím falešnou pozitivitou.(46) Rozdílné jsou i způsoby postamplifikační detekce. Nestandardnost provedení a nedostatečná reprodukovatelnost metod je v současné době stále staví do pozadí – i přes jejich zjevný diagnostický potenciál. PCR je využívána nejen pro přímou detekci v klinických vzorcích, ale také např. pro identifikaci druhů, řešení epidemiologických studií, identifikaci nozokomiálních kmenů, výskytu rezistence nebo zkoumání schopnosti invazivity hub.(47)

Závěr

Každý laboratorní nález je nutné hodnotit vždy s ohledem na ostatní výsledky, validitu vzorku zaslaného na vyšetření a klinický stav pacienta. I přes značný pokrok v diagnostice invazívních kandidových onemocnění je stále základem hemokultivační vyšetření. Histologické, mikroskopické či kultivační vyšetření z infikované tkáně je často omezeno obtížnou dostupností příslušného biologického materiálu. Proto sledování kolonizace pacienta, sérologické metody či PCR metody jsou – i přes své limitující faktory ve smyslu falešné pozitivity a/nebo negativity, nestandardnosti provedení či nejednoznačné interpretace výsledku – dalšími velmi hodnotnými střípky do mozaiky při rozhodování o včasném zahájení antimykotické terapie.


O autorovi: 1MUDr. Naďa Mallátová, 2MUDr. Karel Mencl, CSc.
1Nemocnice České Budějovice, a. s., Centrální laboratoře, Laboratoř lékařské parazitologie a mykologie

2Pardubická krajská nemocnice, a. s., Oddělení klinické mikrobiologie

e-mail: mallatova@nemcb.cz

Laboratorní diagnostika invazívní kandidózy
Ohodnoťte tento článek!
1 (20%) 1 hlas/ů