Mikrobiologická diagnostika infekční endokarditidy

Hemokultivační vyšetření má v diagnostice infekční endokarditidy dvojí úlohu. Slouží především k zjištění etiologie nemoci a při znalosti konkrétní citlivosti izolovaného agens i k určení nejúčinnější antibiotické léčby. Kromě toho však výsledky hemokultivačního vyšetření hrají velmi významnou úlohu při samotném stanovení diagnózy.

Souhrn

Hemokultivace je choulostivé vyšetření, které při nesprávném postupu může snadno přinést falešně negativní nebo falešně pozitivní výsledky. Je proto potřeba naučit se hemokultivaci správně indikovat i správně provádět, a umět také získané výsledky správně interpretovat.
Klíčová slova

Summary

Beneš, J. Microbiologic diagnostics of infective endocarditis

Primary role of blood culturing is to recognize the etiologic agent and with knowledge of its sensitivity/resistance pattern to establish the optimal antibiotic treatment. In infective endocarditis, results of blood culturing are very important for identification and/or verification of the disease as well.
Blood culturing is a very sensitive examination. With non-correct practice, there can be obtained false-negative or false-positive results easily. This article should help to better understanding the method, collecting blood cultures properly, and interpreting the results of cultivation.

Klinická diagnostika infekční endokarditidy se zakládá na dvou základních pilířích. Jedním z nich je echokardiografický průkaz vegetací na chlopních nebo na nástěnném endokardu, druhý spočívá v průkazu etiologického agens pomocí mikrobiologických metod (Tab. 1). Mezi mikrobiologickými metodami zaujímá klíčové postavení hemokultivace. Standardní hemokultivační postupy jsou jednoduché, poměrně levné a všeobecně dostupné. Jsou přitom velmi citlivé – k získání pozitivního výsledku teoreticky stačí jediný životaschopný mikrob, který se v médiu namnoží do koncentrace, jež umožní detekci. Hlavním cílem hemokultivace je určení etiologie nemoci a zjištění citlivosti původce vůči antibiotikům.

Tab. 1 – Metody mikrobiologické diagnostiky u infekční endokarditidy(2)

Etiologie a patogeneze infekční endokarditidy

Endokard pokrývající chlopně i vnitřní stěny srdce je za fyziologických podmínek značně odolný vůči bakteriální infekci. Předpokládá se, že teprve při poškození endokardiální výstelky se na povrchu chlopní objeví molekuly, na nichž se mikrobi dokáží zachytit. (Poškození chlopní může být trvalé (různé anatomické vady) i přechodné (léze v místě silného krevního proudění, léze po nárazech nerozpuštěných částeček drogy u intravenózních toxikomanů apod.). Léze endotelu mohou mít mikroskopické rozměry a nemusejí tedy být zjevně patrné. Jde o látky, které jsou součástí mezibuněčné vazivové tkáně (kolagen), nebo o expresi molekul, které produkuje poškozená endoteliální buňka a které podporují adhezi trombocytů (fibronektin). Jak Staphylococcus aureus, tak viridujícístreptokoky mají receptory pro tyto struktury, naopak jiné druhy streptokoků nebo enterobaktérie (E. coli) je postrádají. Míru afinity různých baktérií k srdečním chlopním ukazuje Tab. 2. Baktérie přichycené na povrchu chlopní následně překryje vrstva trombocytů a vláken trombinu. Množením baktérií a apozicí nových a nových vrstev trombinových vláken a trombocytů se vytvoří charakteristický patologický útvar – vegetace.

Tab. 2 – Zjištěné diagnózy při pozitivní bakteriémii(3)

Endokarditida tedy vzniká po adhezi mikrobů na místa poškozeného endotelu. Ukazuje se však, že místa pokrytá trombem už nepředstavují vhodné místo pro zachycení baktérií. Pro potvrzení tohoto faktu svědčí pozorování, že u mnoha nemocných v hyperkoagulačním stavu se objevují drobné přisedlé tromby na srdečních chlopních, aniž by se tak zvýšila náchylnost k rozvoji infekční endokarditidy. Typicky se jedná o pacienty s onkologickými nebo autoimunitními chorobami a nález takových trombů – ať už při echokardiografickém vyšetření nebo při pitvě – se obvykle označuje termínem „nebakteriální trombotická endokarditida“, zkráceně NBTE. Histologický rozbor ukázal, že NBTE není předstupněm infekční endokarditidy, naopak jde o zcela různé a navzájem nesouvisející diagnostické jednotky.(1)

Nízká afinita baktérií k již vytvořenému trombu má jeden praktický důsledek – vysvětluje, proč u infekční endokarditidy nedochází k sekundárním infekcím vegetace, ačkoli je známo, že k tranzientním bakteriémiím dochází i u zdravých lidí několikrát denně při běžných činnostech, jakými jsou čištění zubů, žvýkání, defekace apod. Tímto způsobem je možné pochopit, proč je infekční endokarditida prakticky vždy monobakteriální.

Shrnutí

Infekční endokarditidu může vyvolat prakticky kterákoli baktérie nebo houba schopná vyvolat invazívní onemocnění. Nicméně různí mikrobi se velmi liší ve své afinitě k endotelu a subendoteliálním strukturám. Největší afinitu mají viridující streptokoky a S. aureus, naopak poměrně nízkou afinitu mají beta-hemolytické streptokoky (Streptococcus pyogenes) a gramnegativní tyčinky. Koaguláza-negativní stafylokoky (S. epidermidis, S. hominis a další) mají afinitu k umělohmotným povrchům a jsou proto hlavními původci endokarditidy u pacientů s mechanickou chlopenní náhradou nebo s defibrilátorem/kardiostimulátorem.

Vývoj bakteriémie při endokarditidě, načasování odběru hemokultur

Baktérie ve vegetacích jsou ve zvláštní situaci: odebírají živiny, které se k nim z cirkulující krve dostávají difúzí, a přitom jsou skryty za sítí trombinových vláken a nedostupné pro fagocytující leukocyty. Za těchto okolností se mikrobi v centru vegetace postupně pomnoží do koncentrací dosahujících až 1010/ml a nadále pak perzistují v metabolicky málo aktivním stavu. Naproti tomu mikrobi žijící při povrchu vegetace, kteří mají větší dodávku živin, zůstávají metabolicky aktivní a stále se dělí. Mohou tak způsobit růst vegetace, hlavně však se plynule uvolňují a vyplavují do krevního řečiště. Při endokarditidě – na rozdíl od běžné sepse – má proto pacient trvalou bakteriémii. Tato bakteriémie bývá velmi nízká, obvykle se pohybuje v rozsahu 1–100 živo1taschopných mikrobů v 1 ml krve.(3, 4) (Pro srovnání: v témže objemu krve se nachází 4–10 miliónů leukocytů!)

Občas dochází k natržení vegetace nebo odlomení její části. Pak se do krevního řečiště najednou dostane velké množství baktérií a organismus na tento stav reaguje vyplavením prozánětlivých cytokinů, což se klinicky projeví zimnicí, třesavkou, rychlým vzestupem tělesné teploty a mnohdy i oběhovou nestabilitou nebo dokonce septickým šokem. Tento průběh nemoci je častý u endokarditid vyvolaných zlatými stafylokoky a pravděpodobně se na něm podílí fakt, že S. aureus produkuje účinné trombolytické enzymy.

V rozporu s tradovanou představou se baktérie v cirkulující krvi nemnoží. (Výjimku z tohoto pravidla představují jen opouzdřené kmeny pneumokoků, meningokoků a některé kmeny Streptococcus pyogenes.) Cirkulující krev obsahuje lysozym, bílkoviny komplementu, protilátky, beta-lyzin a další antibakteriálně působící substance, takže pro baktérie vytváří poměrně nepřátelské prostředí. Baktérie v oběhu, zejména jsou-li označeny protilátkami, jsou velmi rychle odstraněny fagocytujícími buňkami přítomnými zejména ve slezině, v játrech, ale i v plicích. Naděje na záchyt baktérií v hemokultuře je proto největší bezprostředně po jejich uvolnění do krevního řečiště, tj. na vzestupu teploty nebo ještě lépe při úvodní třesavce, která je prvním klinicky zjevným signálem, že k vyplavení baktérií došlo (Obr.).

Obr. – Vznik horečky po vyplavení mikrobů do krevního řečiště
Vyplavení baktérií do krevního řečiště zaregistrují prostřednictvím svých receptorů makrofágy a signalizují tuto skutečnost prostřednictvím n. vagus a cytokinů (zejména interleukinu 1) do termoregulačního centra hypotalamu. Zde se skokem změní nastavení teplotního optima. Organismus reaguje nejprve třesavkou, poté následuje
vzestup tělesné teploty. Mezitím stále klesá množství baktérií přítomných v krvi. Obrázek ukazuje, že největší naděje na záchyt baktérií je v době prvních klinických projevů bakteriémie – tj. při třesavce.

Shrnutí

U infekční endokarditidy je trvalá bakteriémie, krev na kultivaci tedy může být odebrána kdykoli, i v afebrilním období. To platí zejména pro chronické formy nemoci (endocarditis lenta). U akutně probíhající endokarditidy, která se klinicky manifestuje jako sepse, je bakteriémie také trvalá, ale kromě toho dochází k občasnému nárazovému vyplavení velkého množství baktérií do oběhu. Pak je výhodnější odebírat krev v době vysoké bakteriémie, tj. při třesavce nebo na začátku vzestupu teploty.

Hemokultivační systémy

Pro záchyt baktérií z krevního řečiště se ve většině nemocnic na území České republiky až do počátku 90. let používaly dva typy hemokultivačních nádobek. Prvním z nich byly hromadně vyráběné transportní nádobky (Hemotest D, Hemotest I), které obsahovaly jen protisrážlivé činidlo. Zdrojem substrátů pro růst baktérií v těchto nádobkách byla samotná odebraná krev. Druhou možnost představovaly nádobky s tekutou nebo bifázickou kultivační půdou, které pro vlastní okruh odběratelů připravovaly jednotlivé mikrobiologické laboratoře. (Nádobky s bifázickou kultivační půdou obsahovaly jednak tekuté kultivační médium (tekutá fáze), jednak pevné médium – agarový klín, na němž byl dobře patrný růst jednotlivých mikrobiálních kolonií.)

V obou případech se nádobky po vstříknutí standardního množství krve (obvykle 10 ml) inkubovaly v termostatu a růst mikrobů v nich se zjišťoval jednak vizuálně, jednak opakovaným mikroskopickým a kultivačním vyšetřováním vzorků obsahu nádobky. Toto testování se provádělo několikrát v průběhu 5–10 dnů inkubace. Nevýhodou všech těchto metod byla velká pracnost a také značná náchylnost ke kontaminaci.(5)

V průběhu 90. let byl popsaný způsob hemokultivace vystřídán používáním automatizovaných hemokultivačních systémů (Bactec, BacT/ALERT). Při tomto způsobu kultivace se používají přístroje o kapacitě 60–240 nádobek. V každé nádobce se každých 10–20 minut měří neinvazívně (fotometricky) množství oxidu uhličitého. Detekce množení mikrobů se zakládá na faktu, že každá bakteriální metabolická aktivita ve svém důsledku zvyšuje tvorbu CO2. Přístroj tak umožňuje časné zjištění růstu mikrobů a současně odstraňuje předchozí pracnost a riziko kontaminace při opakovaném vyočkovávání vzorků.

Po vstříknutí krve obsahující vitální baktérie do hemokultivační nádobky se nejprve neděje nic – baktérie obvykle potřebují několik desítek minut k adaptaci na nové prostředí. Pak nastupuje období rychlého množení mikrobů, které trvá několik hodin. Později se některé růstové faktory spotřebují a množení mikrobů ustává. Mikrobiální populace tak přechází do tzv. stacionární fáze.

Analyzátor v hemokultivačním přístroji rozpozná růst baktérií nejlépe ve fázi rychlého množení. V souhlase s tím se doba potřebná k detekci růstu baktérií nejčastěji pohybuje v rozsahu 18–36 hodin.(6, 7) U některých pomalu rostoucích druhů nicméně může být zvýšená tvorba CO2 patrná až po několika dnech, proto se nádobky obvykle ponechávají v analyzátoru po dobu 5–6 dní, 1než se prohlásí za negativní. (Celá problematika je poněkud komplikovanější, neboť čas potřebný k detekci záleží i na dalších faktorech, zejména na počáteční koncentraci mikrobů v odebrané krvi a také na vitalitě mikrobů, která může být negativně ovlivněna předchozí antibiotickou léčbou.) V minulosti se doporučovalo prodlužovat dobu kultivace u subakutně či chronicky probíhající endokarditidy až na 10 dní,(5) při použití automatizovaných systémů se však hemokultury běžně inkubují 5–6 dní.(8)

Pro praxi je zejména důležité vědět, že pozdní dodání hemokultivační nádobky do přístroje, které se uskuteční až po skončení rychlého množení mikrobů, zhoršuje podmínky pro úspěšnou detekci. Některé studie ukazují, že již při transportu trvajícím déle než 12 hodin může analyzátor generovat falešně negativní výsledky.(9) Byla publikována i práce ukazující, že po transportu delším než 24 hodin klesla záchytnost mikrobů až o 50 %.(10)

Z téhož důvodu se doporučuje uchovávat hemokultivační nádobky před odběrem i po něm při pokojové teplotě. Umístění nádobek po odběru do termostatu (což bylo doporučováno u manuálně zpracovávaných hemokultur) není žádoucí, protože roste riziko, že nádobky budou vloženy do přístroje až poté, co ustane období rychlého množení. Naopak umístění nádobek v chladničce by mohlo způsobit úhyn některých choulostivějších druhů baktérií.

Shrnutí

Automatizované hemokultivační systémy (Bactec, BacT/ALERT) umožňují záchyt většiny lékařsky významných baktérií přítomných v krevním řečišti. Doba potřebná k detekci růstu baktérií činí obvykle 18–36 hodin. Nádobky se po odběru krve ponechávají při pokojové teplotě, doba od odběru krve do vložení nádobky do analyzátoru by měla být co nejkratší (< 12 hodin).

V době, kdy přístroj hlásí pozitivitu některé z inkubujících se nádobek, je koncentrace mikrobů v nádobce tak velká, že umožňuje při mikroskopickém vyšetření určit základní morfologii a barvitelnost baktérií. Tím je míněno rozlišení na úrovni grampozitivní kok, gramnegativní tyčinka atd. Přesné určení druhu mikroba a jeho citlivosti k antibiotikům si zpravidla vyžádá ještě několik dnů – nicméně je zřejmé, že první orientační informaci, kterou lze přímo využít pro základní nasměrování antibiotické léčby, je možné při dobré spolupráci mezi klinikem a mikrobiologem získat již během 1–2 dnů po odběru hemokultur.

Výběr hemokultivačních nádobek

Hemokultivační nádobky používané u automatizovaných systémů (Bactec, BacT/Alert) obsahují kvalitní tekuté kultivační médium a často i další přísady, které usnadňují růst baktérií. Každý výrobce uvádí na trh několik typů nádobek. Aerobní a anaerobní nádobky slouží k záchytu mikrobů z krve u dospělých pacientů i u větších dětí. Většina lékařsky významných baktérií (Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Escherichia coli, Salmonella enterica atd.) vyroste stejně spolehlivě a stejně rychle v aerobní i v anaerobní nádobce.(6, 7) Aerobní nádobka je však vhodnější pro záchyt striktně aerobně rostoucích baktérií (např. Pseudomonas aeruginosa) nebo kvasinek (Candida spp.). Naopak anaerobní nádobky jsou nezbytné pro izolaci striktních anaerobů, například fusobaktérií, peptostreptokoků či Bacteroides fragilis. V anaerobních nádobkách se lépe množí i některé druhy streptokoků, které mohou být původci infekční endokarditidy.

Do aerobních i anaerobních nádobek se standardně odebírá 10 ml krve. Pro tento objem krve je upraveno složení kultivačního média. Je-li množství vstříknuté krve menší než 3 ml, změní se poměr krve a kultivačního média a některé choulostivější baktérie nevyrostou. Pediatrické nádobky jsou určeny především pro novorozence, kojence a batolata. Nádobky jsou kalibrovány na odběr menšího množství krve (1–3 ml). U pediatrických nádobek se počítá se dvěma specifickými rysy raného dětského věku, tj. přirozeně nižší baktericidní schopností krve ve srovnání s dospělou populací a s tím související řádově vyšší bakteriémií v průběhu sepse. Pro lepší pochopení si lze představit, že při sepsi je v 1 ml krve novorozence nebo kojence přítomno více baktérií než v 10 ml krve dospělého pacienta.

Použití pediatrických nádobek v situaci, kdy se u dospělého pacienta podaří odebrat pouze několik ml krve, je sice možné, výtěžnost hemokultury je však nižší. Další typy nádobek byly vyvinuty pro záchyt mykobaktérií (při podezření na miliární tuberkulózu) nebo hub (při podezření na mykotickou etiologii sepse), eventuálně pro spolehlivější izolaci jiných méně obvyklých agens (Abiotrophia, Brucella aj.).

Shrnutí

U dospělých pacientů se při jednom odběru krve zpravidla doporučuje odebírat 20 ml krve, kterými se naplní jedna aerobní a jedna anaerobní nádobka. Není-li krve dostatek, doporučuje se u nemocných s klinickým obrazem akutní sepse a u pacientů hospitalizovaných na JIP používat přednostně aerobní nádobky, neboť je zde poměrně velká pravděpodobnost pseudomonádové nebo kandidové infekce. Naopak použití anaerobních nádobek je preferováno u nemocných se subakutní či chronickou endokarditidou nebo u pacientů, kde je podezření na anaerobní etiologii (peritonitida, mediastinitida apod.).

Počet odebíraných hemokultur, místa vhodná k odběru krve

Pro sjednocení užívané terminologie je nutné předeslat, že pojem „hemokultura“ označuje všechny hemokultivační nádobky, které byly naplněny krví při jednom odběru. Jednu hemokulturu tedy mohou tvořit jedna, dvě nebo i tři nádobky. Záchytnost hemokultury je úměrná množství odebrané krve, přinejmenším v rozsahu 5–20 ml. Při odběru 10 ml krve je tedy významně větší naděje na izolaci mikroba než při odběru 5 ml, odběr 20 ml přináší lepší výsledky než odběr 10 ml.(4) Proto je zvykem odebírat u dospělých pacientů najednou 20 ml krve. Touto krví se zpravidla naplní jedna aerobní a jedna anaerobní nádobka.(11) Existují však i autoři, kteří odebírají při jedné venepunkci krev do dvou stejných aerobních nádobek;(12) tímto postupem se omezí spektrum zachytitelných mikrobů, avšak stoupne citlivost vyšetření.

Sami tento přístup nepodporujeme, uvádíme ho zde jen pro úplnost. Hledáním optimálního počtu hemokultur se zabývalo několik autorů již v 60. letech minulého století. V klasické, dosud citované studii provedené na 80 bakteriémických nemocných činila výtěžnost jedné hemokultury 80 %, dvou hemokultur 89 % a tří hemokultur 99 %.(4) Podobné výsledky byly publikovány i z jiných pracovišť.(3) Dodnes se proto doporučuje odebírat při sepsi nebo při endokarditidě standardně tři hemokultury. Jednotlivé odběry by přitom měly být provedeny z různých žil, aby byla vyloučena možnost, že případný pozitivní nález je důsledkem lokální infekce v místě odběru. Současně platí i požadavek na časové oddělení jednotlivých odběrů, aby se vyloučila možnost, že jde o jednu náhodnou bakteriémickou1epizodu. Doporučovaný odstup mezi odběry by proto měl činit přinejmenším jednu hodinu.

Uvedené zásady bývají v praxi často modifikovány podle aktuálních podmínek. Dostával-li nemocný v předchozích dnech antibiotika, jde-li o chronickou endokarditidu nebo jedná-li se dokonce o horečku nezjištěné etiologie, je vhodné odebrat hemokultur více a ve větších časových rozestupech (čtyři nebo pět hemokultur v průběhu 24–72 hodin). Naopak při perakutním průběhu endokarditidy nebo sepse, kdy nemocný je přijímán k hospitalizaci v septickém šoku a se zahájením antibiotické léčby nelze otálet, se doporučuje odebrat aspoň dvě hemokultury, z různých žil, s odstupem 20–30 minut. Většina autorů se shoduje na tom, že odběr pouze jediné hemokultury je nevhodný, protože nedává podklady pro interpretaci případných nejasných výsledků (viz bod H).

Krev na hemokultivaci se optimálně odebírá z periferní žíly. Nedoporučuje se používat k odběrům centrální žilní katétr, protože ten může být infikován.(3, 8) Odběr krve z centrálního žilního katétru se jako nouzové opatření připouští pouze u nemocných, kde není možné najít žádnou žílu k venepunkci. Případný pozitivní nález se však mnohem obtížněji hodnotí.

V šedesátých letech byla formulována zdánlivě logická hypotéza, podle níž hemokultury odebrané z arteriálního řečiště měly mít vyšší výtěžnost než hemokultury odebrané ze žíly.(13) Tato hypotéza se však nepotvrdila, naopak zdá se, že hemokultury odebrané z artérie mají vyšší riziko falešné pozitivity.(14, 15) Nadále je tedy preferován odběr krve z periferních žil.(8)

U infekcí, které postihují přednostně lymfatické tkáně (břišní tyfus, tuberkulóza, brucelóza, viscerální leishmanióza), je pro záchyt agens výtěžnější odběr kostní dřeně než standardní hemokultura. Pro kultivaci stačí získat 1–5 ml sternálního punktátu. Punkce kostní dřeně však nemá žádné opodstatnění u endokarditidy nebo u běžné sepse.

Shrnutí

Pojem „hemokultura“ zahrnuje všechny hemokultivační nádobky, které byly naplněny při jedné venepunkci. Hemokulturu tedy obvykle tvoří dvojice nádobek – aerobní a anaerobní.
Většina současných doporučení se shoduje, že při podezření na infekční endokarditidu u pacienta dosud neléčeného antibiotiky stačí odebrat 3 hemokultury. Krev však musí být odebrána pokaždé z jiné žíly. Časový interval mezi jednotlivými odběry by pokud možno měl být větší než 1 hodina.

Technika odběru hemokultur

Hemokultivační vyšetření je vysoce citlivé. Za tuto výhodu však platíme daň v podobě snadné kontaminace a falešné pozitivity výsledků. Veškerá manipulace s hemokultivačními nádobkami musí být proto vedena tak, aby riziko kontaminace bylo sníženo na nejmenší možnou míru. Na rozdíl od rutinního odběru krve je především nutná důkladná dezinfekce kůže v místě odběru. Kůže se nejlépe dezinfikuje aplikací 70% alkoholu a následně roztokem jódu. Po každé aplikaci dezinfekčního roztoku se kůže musí nechat zaschnout, což znamená počkat 1–2 minuty.(11) V praxi se tato zásada často opomíjí. Roztokem 70% alkoholu se ošetří i gumová zátka v ústí hemokultivační nádobky. Roztoky kvarterních amoniových solí nejsou pro dezinfekci kůže dostatečně účinné. Dezinfikované místo nesmí být znovu kontaminováno při palpaci žíly, proto se doporučuje, aby osoba provádějící streptokovenepunkci měla obličej chráněný rouškou a aby měla navlečené sterilní rukavice. Ideální je provést venepunkci jediným vpichem.

Moderní hemokultivační nádobky jsou podtlakové, samy tedy nasají potřebné množství krve. Jestliže se krev nasává nejprve do stříkačky a pak teprve vstřikuje do hemokultivační nádobky, doporučuje se nevyměňovat jehlu.(11) Ukázalo se totiž, že riziko kontaminace povrchu jehly během venepunkce je při správně provedené dezinfekci kůže menší než riziko, že se hemokultura zkontaminuje při manipulacích s jehlou. Jestliže se při jedné venepunkci odebírá krev na kultivaci a současně i na jiné vyšetření, vždy by měla být nejprve odebrána krev na kultivaci, protože i výměna nádobek při zavedené jehle zvyšuje pravděpodobnost kontaminace. Nebezpečí kontaminace hemokultury vzrůstá také při opakování vpichů v rámci jednoho odběru.

Na některých pracovištích je zvykem provádět po dezinfekci kůže ještě kontrolní stěr z místa určeného k venepunkci. Tento krok však není obecně doporučován a na naší klinice jej neprovádíme. Neposkytuje totiž dostatečně spolehlivou informaci o tom, zda eventuální pozitivní nález je či není kontaminací, zato však komplikuje a prodražuje celý výkon a odvádí pozornost sestry od důležitějších věcí. Samozřejmou a často podceňovanou součástí odběru hemokultury je vypsání průvodky. Je třeba znovu a znovu připomínat, že kromě běžných identifikačních dat musí každá průvodka i každá nádobka obsahovat informaci o přesném čase a místě odběru. Každá nádobka musí mít vlastní průvodku. Údaje o odběru zahrnující čas a místo odběru krve, typ použitých nádobek a průběh výkonu musejí být zaznamenány i v chorobopisu. Bez těchto údajů není možné provést dodatečnou interpretaci nejistých či sporných nálezů (viz bod H).

Shrnutí

Odběr hemokultury je něco jiného než prostá venepunkce. Je nutné všemi dostupnými prostředky omezit riziko kontaminace. Zároveň je potřeba pečlivě zaznamenat čas a místo odběru krve na žádanky, na nádobky i do dokumentace pacienta.

Hemokultury a předchozí antibiotická terapie

Antibiotická terapie může velmi citelně snížit výtěžnost hemokultivací. Platí to i v případech, kdy podání antibiotik nebylo klinicky účinné. V krvi je totiž koncentrace většiny antibiotik vyšší než v ložisku infekce a navíc zde působí různé inhibující a baktericidní faktory zmíněné výše (bod B). Je logické, že podání antibiotik zabrání především záchytu vysoce citlivých mikrobů, jako jsou viridující streptokoky nebo baktérie skupiny HACEK. Záchyt stafylokoků nebo enterokoků, které jsou mnohem odolnější, není tolik ovlivněn. Tuto skutečnost ukazují i výsledky národních studií.(16, 17) Je-li vysloveno podezření na infekční endokarditidu u nemocného, který již dostává antibiotika, doporučuje se většinou tato antibiotika vysadit a po několika dnech začít nabírat hemokultury.(7, 8)

V praxi však velmi záleží na tom, jak intenzívní byla předchozí léčba a jak dlouho trvala. (U pacienta, který byl již týden léčen vysokými dávkami baktericidních antibiotik, sice ještě pravděpodobně není celá mikrobiální populace vybita, nicméně čas potřebný k úplné regeneraci baktérií, která dovolí jejich izolaci z krevního řečiště, může trvat týden i déle. Terapie by se v takovém případě musela vrátit znovu na začátek, navíc je zde i riziko, že v mikrobiální populaci se mezitím vyselektuje rezistentní klon.) Dále je významná i farmakokinetika antibiotika a způsob jeho účinku. Je velký rozdíl mezi penicilinem nebo oxacilinem, jejichž biologický poločas při zachovalé funkci ledvin činí pouhých 30 minut, a azitromycinem nebo teikoplaninem, které se vylučují z organismu několik týdnů. Důležitá je i otázka, jestli použité antibiotikum má či nemá postantibiotický efekt. Kromě odhadování, zda je možné očekávat rychlé zotavení mikrobů a jejich izolaci z krevního řečiště, je nutné brát v úvahu i stav pacienta – nakolik je možné ponechat ho bez antibiotik. U endocarditis lenta to obvykle nečiní problém, při akutně probíhající endokarditidě může být i 12hodinový odklad léčby příliš dlouhý. Rozhodování o přerušení antibiotické léčby je proto vždy zcela individuální záležitostí.

Někteří autoři soudí, že u pacientů s již zahájenou antibiotickou terapií je možné získat agens i bez přerušení léčby, jestliže se krev na kultivaci odebere těsně před podáním další dávky antibiotika, tj. v době, kdy hladina antibiotika v séru je nejnižší.(7) Podle našich zkušeností je takové opatření přínosné jen tehdy, jestliže od zahájení léčebné kúry uplynulo teprve několik dní, pacient je dosud febrilní a infekce je tedy stále aktivní. I tak zůstává naděje na izolaci agens dost omezená.

Shrnutí

Předchozí antibiotická léčba často způsobí negativitu hemokultur. Neznáme-li agens, je terapie endokarditidy mnohem náročnější, delší, dražší a přitom méně spolehlivá. Jediným řešením je změnit preskripční návyky. U nemocných, kde existuje riziko endokarditidy nebo sepse, je nutné nejprve odebrat 2–4 hemokultury (třeba i ambulantně) a pak teprve předepsat antibiotika. U pacientů, kteří jsou rozléčeni antibiotiky, avšak infekce je dosud aktivní, je možné pokusit se o izolaci agens tak, že se antibiotika vysadí na 1–2 dny a na konci této pauzy se odeberou hemokultury.

Interpretace výsledků hemokultivací

Hemokultivace může přinést falešně pozitivní i falešně negativní výsledky. Alespoň část z nich však poučený lékař dokáže rozpoznat a eliminovat ze svého rozhodování. Interpretace může vycházet z následujících pravidel:
a) Infekční endokarditidu obvykle vyvolává jediné agens. Ve velkých sestavách může být malý podíl případů (< 5 %) označen jako polymikrobiální endokarditida, obvykle však jde spíše o neschopnost autorů určit spolehlivě pravého původce nemoci. Kazuistiky, v nichž by bylo přesvědčivě dokumentováno, že nemoc způsobilo více mikrobů současně (např. mikroskopický či PCR průkaz rozdílných baktérií ve vegetaci), jsem v dostupném písemnictví neobjevil.
b) U infekční endokarditidy by vzhledem k výše popsané trvalé bakteriémii měly být všechny odebrané hemokultury pozitivní.

Nálezy, které jednoznačně podporují klinické podezření na infekční endokarditidu (nebo které nutí o této diagnóze uvažovat), můžeme seřadit do tří skupin:
1. Záchyt baktérií, které jsou málo patogenní, mají však vysokou afinitu k patologicky změněným srdečním chlopním: mezi tyto baktérie patří klasické viridující streptokovenepunkci vyšetky
(S. mitis, S. mutans, S. sanguis, S. salivarius a další, viz Tab. 2), spolu s příbuznými druhy a rody (Streptococcus bovis, Abiotrophia spp., Granulicatella spp., Gemella spp. aj.), dále baktérie skupiny HACEK (především hemofily jiné než Haemophilus influenzae). Izolace těchto baktérií z krve je ve většině případů projevem infekční endokarditidy.
2. Záchyt baktérií, které mají vysokou afinitu k srdečním chlopním, avšak mohou vyvolat i různé jiné nemoci provázené bakteriémií: do této skupiny lze zařadit Staphylococcus aureus a enterokoky. U každé bakteriémie s nálezem těchto mikrobů je nutné na endokarditidu pomyslet a doplnit echokardiografické vyšetření, které ji prokáže nebo vyloučí. I když je infekční ložisko primárně situováno jinde (stafylokoková osteomyelitida nebo ranná sepse, enterokoková intersticiální nefritida apod.), není vyloučeno, že srdeční chlopně jsou infekcí rovněž zasaženy.
3. Opakovaný záchyt jakýchkoli jiných baktérií, není-li známo jiné ložisko infekce: v tomto případě se uplatňuje pravidlo o trvalé bakteriémii v průběhu endokarditidy. Za projev svědčící pro pravděpodobnou endokarditidu se považuje izolace stejné baktérie ve třech ze tří odebraných hemokultur anebo při vyšším počtu odebraných hemokultur nález stejného mikroba ve většině z nich – tj. alespoň tří ze čtyř nebo pěti, čtyř ze šesti atd.(18, 19)

Naopak nálezy, které nepodporují diagnózu endokarditidy nebo dokonce svědčí proti ní, zachycuje Tab. 3.

Tab. 3 – Nálezy svědčící proti diagnóze infekční endokarditidy

Nejvíce problémů bývá s interpretací nálezu Staphylococcus epidermidis. Tento mikrob se běžně vyskytuje na kůži a při nesprávně provedeném odběru je nejčastější příčinou kontaminace hemokultury; na druhou stranu je hlavním původcem infekcí různých umělých povrchů (endokarditida mechanických chlopenních protéz, infekce implantovaných kardiostimulátorů/defibrilátorů, infekce obturátorů, shuntů a konduitů, infekce centrálních žilních katétrů apod.). Vzácně může tento mikrob způsobit i endokarditidu nativní chlopně, proto je nutné jeho nález brát v úvahu – i když pravděpodobnost, že je v konkrétním případě skutečně původcem tohoto onemocnění, bývá velmi malá.

Shrnutí

Pozitivní výsledek kultivace ještě nemusí být důkazem, že izolovaný mikrob je skutečně původcem nemoci. Interpretace hemokultivačních nálezů je možná jen za tří podmínek: a) jsou odebrány přinejmenším dvě hemokultury, b) všechny hemokultivační nádobky jsou dobře označené, tak aby bylo možno jednoznačně určit, které z nich patří ke kterému odběru, c) existuje dobrá spolupráce mezi klinikem a mikrobiologem.

Mikrobiologické metody jiné než hemokultivace

Všechny ostatní metody uvedené v Tab. 1 mají jen omezenou hodnotu. Jedním z hlavních nedostatků těchto metod je nemožnost určit citlivost mikroba k antibiotikům. V úvahu připadají následující možnosti.
Mikroskopické a/nebo kultivační vyšetření vegetací nebo postižené srdeční tkáně: tyto tkáně lze získat pouze při operaci nebo při pitvě. Možnosti kultivace mikrobů jsou však v obou případech velmi omezené v důsledku současné nebo předchozí antibiotické léčby. Pozitivní výsledek kultivace peroperačně získaného materiálu je vždy alarmující a znamená dosud vysoce aktivní infekci. U pacienta s takovým nálezem je nutné pokračovat po operaci v plně účinné antibiotické terapii po dobu 4–8 týdnů.(8, 20) Vždy je však nutné vyloučit kontaminaci vzorku při odběru či transportu.

Riziko kontaminace je podstatně vyšší při pokusu o kultivaci pitevního materiálu. Kromě kontaminace nesterilním pitevním nářadím zde existuje i možnost sekundární kolonizace vegetací při bakteriémii způsobené střevní flórou, která může provázet terminální stav některých nemocí. Veškeré kultivační nálezy je proto vhodné ověřit mikroskopickým vyšetřením s obarvením vnitřních částí tkáně podle Grama. Jsou-li baktérie skutečně viditelné v centru vegetace nebo v zánětem postižených tkáních, je to důkaz, že byly příčinou nemoci. Toto mikroskopické vyšetření může provést mikrobiolog nebo histopatolog.

Průkaz mikrobů ve vegetacích nebo v srdeční tkáni pomocí izolace a sekvenace nukleových kyselin (DNA nebo RNA): tato metoda je slibná, ale pro svoji nákladnost omezeně dostupná. Používá se pro výzkumné účely, není součástí běžné praxe u nás ani v zahraničí. Při interpretaci nálezů je třeba si uvědomit, že mikrobiální nukleové kyseliny jako součást rozpadlých mikrobů mohou zůstat v tkáních i po úspěšném vyléčení. Jejich nález tedy potvrzuje etiologii, ale nevypovídá nic o stadiu nemoci nebo efektu terapie.

Průkaz mikrobiální DNA v cirkulující krvi pomocí polymerázové řetězové reakce (PCR): nejznámějším a nejpoužívanějším systémem je SeptiFast, který vyvinula firma Roche. Systém je koncipován tak, aby umožnil detekci a identifikaci mikrobů, které nejčastěji vyvolávají bakteriémii (Tab. 4). Metoda je schopná prokázat v krvi gramnegativní baktérie, Staphylococcus aureus, enterokoky a kvasinky již při koncentracích kolem 30 mikrobů/ml. Koaguláza-negativní stafylokoky a streptokoky mohou být detekovány při koncentracích kolem 100 baktérií/ml.

Hlavní předností této metody je rychlejší záchyt etiologického agens – vyšetření trvá jen několik hodin. Důležitá je i skutečnost, že záchyt není závislý na vitalitě mikroba, čili agens lze v krvi prokázat i po zahájení antibiotické léčby. Naopak mezi nevýhody patří podstatně vyšší cena ve srovnání s kultivací, omezený počet rozeznávaných mikrobů a rovněž nemožnost určit citlivost mikrobů na antibiotika. Výsledky získané pomocí tohoto vyšetření tedy nemohou nahradit standardní hemokultivaci, protože neumožňují přesné vedení antibiotické léčby.

Průkaz tvorby specifických protilátek: na rozdíl od všech předchozích vyšetření jde o tzv. nepřímý průkaz, kdy se zjišťuje nikoli agens, nýbrž odpověď organismu na jeho působení. Diagnostika má proto některá omezení – protilátky se tvoří až po několika týdnech trvání nemoci, je možná zkřížená reaktivita mezi různými druhy mikrobů atd. Nicméně tato vyšetření jsou poměrně levná a snadno proveditelná. Používají se v situacích, kdy jde o podezření na patogeny nekultivovatelné běžnými postupy, např. Coxiella burnetii (původce Q horečky), Bartonella henseleae (původce tzv. horečky z kočičího škrábnutí), Brucella spp. nebo Chlamydia psittaci. Pravděpodobnost endokarditidy vyvolané těmito patogeny je v našich podmínkách velmi malá. Relativně největší incidenci z uvedeného výčtu by mohla mít bartonelová endokarditida. Její podíl na celkovém počtu endokarditid ve Francii činí asi 3 %.(21) V Tunisu, kde je vysoká incidence bartonelových infekcí, se tato etiologie podílí na celkovém počtu endokarditid téměř 10 procenty.(22)

Shrnutí

Klinik by se měl vždy zajímat o to, zda byl proveden pokus o mikroskopický průkaz baktérií v peroperačně nebo sekčně získaném materiálu. Výsledky mikroskopického vyšetření by měly korelovat s etiologií endokarditidy zjištěnou pomocí hemokultivace. U kultivačně negativních endokarditid, zejména mají-li subakutní až chronický charakter, je třeba pátrat po možném kontaktu s atypickými patogeny (bartonely, brucely, coxiely apod.) a podle okolností indikovat odpovídající sérologická vyšetření.

Závěr

Hemokultivační vyšetření má v diagnostice infekční endokarditidy dvojí význam. Především slouží k rozpoznání etiologického agens a určení jeho citlivosti na antibiotika – bez hemokultivace není možné provádět cílenou antibiotickou terapii. Je sice pravzánětlivá da, že vyléčení je často možné dosáhnout i necílenou terapií, tento postup je však podstatně dražší a přitom méně spolehlivý. Druhým cílem hemokultivace je přispět k samotnému stanovení diagnózy. Od přijetí Durackových diagnostických kritérií(18) platí zásada, že výsledky hemokultivace spolu s výsledky echokardiografie jsou pro klinický průkaz nemoci rozhodující. I když původní systém diagnostických kritérií byl posléze poněkud modifikován,(19) zůstaly principy rozhodování zachovány.

Splnění obou jmenovaných rolí hemokultivačního vyšetření je podmíněno dodržováním správných postupů a rovněž správnou interpretací získaných nálezů. Vybavení mikrobiologických laboratoří v České republice je na velmi dobré úrovni, tohoto potenciálu však klinici někdy neumějí dostatečně využít, protože jsou přetíženi jinými úkoly. Bez základních znalostí klinické mikrobiologie a bez spolupráce ošetřujících lékařů s mikrobiology se však diagnostika i léčba infekční endokarditidy nemůže obejít.


O autorovi: Doc. MUDr. Jiří Beneš, CSc.
Univerzita Karlova v Praze, 3. lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Na Bulovce, Infekční klinika

e-mail: benes.infekce@seznam.cz

Ohodnoťte tento článek!