Nepodkročitelné minimum laboratorní diagnostiky invazívních mykotických infekcí – doporučení odborníků s podporou CELL a SLM JEP

V posledních letech významně stoupá počet invazívních mykóz v důsledku narůstajícího počtu rizikových pacientů. Zároveň se rozšiřuje spektrum jejich původců, nezřídka se sníženou citlivostí k antimykotikům. Důsledkem je častější selhávání léčby a vysoká mortalita. Klíčovou roli v úspěšném zvládnutí život ohrožujících mykóz tak stále více přebírá přesná a včasná diagnóza. Mykologická laboratoř musí disponovat základním vybavením a škálou metod, které umožňují jak rychlou diagnostiku, tak spolehlivou identifikaci na druhové (Candida, Cryptococcus, Aspergillus) nebo alespoň rodové (např. Mucor, Rhizopus, Fusarium) úrovni. Významné místo zastává zkušený a pravidelně se vzdělávající personál.

Summary

Buchta, V., Hamal, P., Mallátová, N., Kocmanová, I., Chrenková, V., Roubalová, M., Olišarová, P.

There are increasing numbers of invasive fungal infections due to a growing number of high-risk patients and expanding spectrum of pathogenic fungi. Due to their reduced susceptibility to antifungals, treatment failure is more frequent and mortality increased in the patients. Thus, accurate and early diagnosis is increasingly taking key position in the management of lifethreatening fungal infections. Mycological laboratory must have basic equipment and dispose of a spectrum of methods, which allows both fast diagnostics, and reliable identification at the species (Candida, Cryptococcus, Aspergillus) or, at least, generic level (e.g., Mucor, Rhizopus, Fusarium). Last but not least, and permanently educating staff represent an indispensable part of mycology diagnostics.

Pokrok v jednotlivých medicínských oborech, zavádění stále náročnějších a v řadě případů pacienty zatěžujících diagnostických a léčebných postupů způsobily výrazné změny v epidemiologii mnoha infekčních onemocnění. Trendy se projevují zejména ve změnách etiologie a klinické formy infekcí či rezistence mikrobů k antibiotikům, tyto potom významně ovlivňují celkovou morbiditu a mortalitu infekčních nemocí. To je i případ houbových onemocnění a mykologie, která ještě v 60. letech minulého století byla oborem, který se zabýval převážně kožními infekcemi (dermatofytózy), slizničními kandidózami a ve vymezených regionech také endemickými a subkutánními mykózami.
Současné změny ve spektru hub a klinických forem houbových infekcí představují výzvu nejen pro lékaře a farmaceuty, ale také pro mikrobiology, kteří se podílejí na diagnostice mykotických agens. S výše uvedenými trendy a vývojem se logicky mění nebo doplňují i požadavky na vybavení a metodologii mykologické laboratoře a odbornou erudici a vzdělávání jejich pracovníků. Klíčovým požadavkem se stává rychlost a přesnost diagnózy, která zejména u imunoalterovaných pacientů je rozhodujícím faktorem úspěšnosti terapie.

Základní požadavky na mykologickou laboratoř

Požadavky na personální i technické vybavení se odvozují zejména od spektra výkonů a houbových agens pravidelně izolovaných v dané laboratoři. Obojí významně ovlivňuje struktura pacientů daného nemocničního zařízení či spádu, zejména pokud se jedná o imunosuprimované osoby (transplantace, onkologičtí pacienti) a pacienty na jednotkách intenzívní péče.
Prostorové a technické vybavení Mykologická laboratoř je buď samostatná, nebo bývá součástí bakteriologického oddělení. Požadavky v základní vybavenosti se neliší od bakteriologické laboratoře, přičemž je však nutné zohlednit určitá specifika zpracování biologického materiálu, kultivace a identifikace hub. (Tab. 1).

Tab. 1 – Požadavky na technické a přístrojové vybavení mykologické laboratoře

Speciální požadavky na mykologickou laboratoř

Invazívní mykózy jsou v našich podmínkách vyvolávány oportunními houbami, jako jsou kvasinky rodu Candida a vláknité houby rodu Aspergillus, které napadají jen výrazně oslabené jedince a průběh těchto onemocnění je velmi závažný se špatnou prognózou. Proto je detekce houbových agens životně důležitá pro diferenciálnědiagnostickou rozvahu a rozhodování o způsomikrobiologická bu terapie. Navzdory pokročilé metodologii je stále více spojena s nejednoznačnou interpretací. To vyžaduje nejen hluboké znalosti a povědomí o houbových infekcích a jejich původcích, ale také klinický přesah – posouzení rizikových a predispozičních faktorů. V neposlední řadě i schopnost vést věcný dialog s ošetřujícím lékařem, protože jistota správného výsledku a závěru je obvykle jen relativní.

Hlavními požadavky na laboratorní diagnostiku invazívních mykóz jsou: * detekce houby (s důrazem na citlivost metody), * identifikace houby (s důrazem na přesnost a citlivost metody), * rychlost a spolehlivost diagnostických procedur.

Diagnostické minimum mykologické laboratoře

Mikroskopie

Východiska Mikroskopie je v mykologii nepostradatelná technika, která slouží nejen k rychlé diagnostice, ale rovněž k ověření validity vzorku a přítomnosti zánětu. Uplatňuje se jako:
* Přímá metoda k rychlému a předběžnému určení možné houbové etiologie v biologickém materiálu včetně bioptických a nekroptických vzorků. V případě podezření na invazívní mykózu se v praxi osvědčuje zejména při vyšetření respiračních vzorků (detekce vláknitých hub a pneumocysty) a likvoru (opouzdřené buňky kryptokoků). U predisponovaných pacientů je vhodné mikroskopickému vyšetření podrobit všechny relevantní materiály, zvláště z primárně sterilních lokalit.
* K posouzení validity vzorku, zejména pokud jde o přítomnost (kolonizaci, kontaminaci) přirozené mikrobioty a zánětlivých buněk (leukocyty).
* K identifikaci vláknitých hub a částečně kvasinek. Přímé pozorování morfologických struktur hub in situ u mikrokultur a různých preparátů.
Mykologické minimum Světelný mikroskop vybavený suchými (10x, 20x a 40x) a imersním objektivem (100x).
Doporučené techniky: Nativní/louhový preparát – vzorky kůže a kožních adnex, vaginální sekret Barvený nativní/louhový preparát (Lugolův roztok, Myco-Ink) Gramovo barvení Gram-Weigertovo barvení – alternativní průkaz cyst Pneumocystis jiroveci
* Negativní znázornění pouzder čínskou tuší – mikroskopické vyšetření likvoru na kryptokoky Giemsovo barvení – základní technika pro mikroskopický průkaz Pneumocystis jiroveci
* (trofozoity) a dimorfních hub (Histoplasma) Barvení podle Grocotta – mikroskopický průkaz Pneumocystis jiroveci* (cysty)
* mikroskopie je často falešně negativní (citlivost < 75 %), proto jako primární metoda detekce není spolehlivá a je nutná konfirmace PCR Doporučení Citlivost nativní mikroskopie lze zvýšit používáním fluorescenčních barviv (Calcofluor, Blankophor, Rylux BSU), vyžadujících fluorescenční mikroskop.

Tab. 2 – Spektrum houbových infekcí a etiologie komplexní mykologické laboratoře

Kultivace

Východiska

Kultivace hub, zvláště hemokultivace, je základní mikrobiologickou technikou používanou k detekci, izolaci a identifikaci původců invazívních mykóz a stanovení citlivosti k antimykotikům. Tzv. sklíčkové kultury (mikrokultury) představují metodu volby při pozorování mikroskopických struktur patogenních hub in situ v čase. Délka inkubace u většiny kvasinek je několik dnů, u většiny vláknitých hub, způsobujících systémové mykózy, mezi třemi až deseti dny. V případě vláknitých mikromycet je kritériem dostatečného nárůstu a zároveň základní podmínkou jejich identifikace sporulace. Doba potřebná na kultivaci je ve většině případů výrazně kratší než vlastní identifikace kmene (Tab. 3).

Tab. 3 – Doba potřebná na izolaci
a identifikaci patogenních hub

Mykologické minimum

Mykologické půdy

* Sabouraudův agar
* + Sabouraudův agar ± antibiotikum nebo chromogenní médium
* ± Sabouraudův bujón Pozn.: Použití chromogenního agaru pro primokultivaci je dáno spíše finančními možnostmi; přidání bujónu je silně doporučeno u relevantních materiálů, kde očekáváme malé množství houby nebo ztížený záchyt daný např. pomalým růstem nebo sníženou viabilitou, včetně souvislosti a přítomností antimykotika.

Teplota inkubace
* 36 ± 1 °C většina původců oportunních mykóz (kandidy, aspergily, zygomycety)
* + pokojová (cca 25 °C) pokud je žádoucí, při podezření na dimorfní houbu je nutná souběžná kultivace 25 a 37 °C
* ± jiná, podle potřeby, např. 30 °C u identifikačních souprav, např. ID 32 C nebo auxanogramů vlastní výroby

Délka kultivace – minimálně 7 dnů u materiálů poslaných k mykologickému vyšetření, v případě možného záchytu dimorfních hub a dermatofyt minimálně 3 týdny – minimálně 3 až 5 dnů u materiálů s požadavkem na mykologický monitoring (např. u hematoonkologických pacientů) Imunologické metody

Východiska

Průkaz protilátek má v mykologii jen omezené uplatnění, protože není spolehlivý nebo jsou k dispozici jiné, vhodnější metody. V praxi se používá zejména v diagnostice alergických forem infekcí (astma, alergická bronchopulmonální aspergilóza, aspergilom) a endemických mykóz. V diagnostice invazívních mykóz mají hlavní uplatnění metody, detekující specifické komponenty buněčné stěny hub. Laboratoře, které zpracovávají biologický materiál odebraný od imunosuprimovaných pacientů, zejména transplantovaných, by měly být schopny diagnostikovat invazívní aspergilózu a kryptokokovou meningitidu.

Mykologické minimum
* Detekce a stanovení aspergilového galaktomananu (metoda ELISA) – kritérium v diagnostice invazívní aspergilózy * Detekce kapsulárního glukuronoxylomananu (latexová aglutinace) – diagnostika kryptokokové meningitidy Pozn.: Lze akceptovat smluvně vázanou spolupráci s jiným pracovištěm, které tato vyšetření provádí za podmínek splňujících základní požadavky na preanalytickou fázi, transport materiálu a odborně kompetentní osobu interpretující výsledky.

Doporučení:
* Detekce panfungálního beta-glukanu, která je však rodově nespecifická (např. kandidóza, aspergilóza, pneumocystóza) a neprokáže kryptokokózu a zygomykózu.
* Detekce kandidového mananu v kombinaci se stanovením antimananových protilátek v diagnostice invazívní kandidózy.
* Imunohistochemické barvení na aspergily lze využít v případě negativního kultivačního nálezu pro diskriminaci aspergilózy od ostatních hyalohyfomykóz.
* I munohistochemické barvení na pneumocystu lze použít jako alternativní metodu detekce pneumocystózy, ale doporučuje se konfirmace PCR.

Molekulárněbiologické metody

Mezi molekulárněbiologické metody lze zahrnout techniky analyzující mikrobiální genom pomocí PCR (polymerázová řetězová reakce), FISH (fluorescenční hybridizace in situ), NASBA (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification), případně proteom pomocí hmotové spektrometrické analýzy proteinových map (MALDI-TOF – Matrix Assisted Laser Desorption /Ionisation – Time of Flight). Všechny lze využít k detekci hub, zejména v přirozeně sterilních materiálech, monitorování terapie (např. u aspergilózy), ale především k identifikaci a typizaci houbových kmenů. Jsou vhodné jako doplněk ostatních testů a i přes kolísavou specificitu a senzitivitu se lze u většiny z nich spolehnout na negativní prediktivní hodnotu a využít ji v rámci diferenciální diagnostiky. Molekulárněbiologické metody lze považovat za doplňující součást diagnostického armamentária mykologických metod, v případě Pneumocystis jiroveci je PCR konfirmační metodu.

Metody identifikace hub

Východiska Zvláště u imunoalterovaných a jinak kriticky nemocných se stále častěji uplatňují v etiologii invazívních mykóz méně obvyklé a nové druhy hub. Tyto houby se často vyznačují sníženou citlivostí k řadě antimykotik. Výsledkem je požadavek na přesnější a rychlejší laboratorní diagnostiku patogenních hub (Tab. 4). U relevantních izolátů z materiálů od pacientů s pravděpodobnou/prokázanou invazívní mykotickou infekcí se doporučuje identifikace nebo potvrzení identifikace pomocí molekulárněbiologických metod (PCR, MALDI TOF).

Tab. 4 – Minimální požadavek na druhovou a rodovou identifikaci patogenních hub v mykologické laboratoři

Testování citlivosti na antimykotika prodlužuje vydání konečného výsledku řádově o dny, proto se identifikace, zejména u vysoce rizikových skupin pacientů, stává pravidelně podkladem tzv. etiologické léčby, což jen umocňuje její význam. Identifikační metody můžeme hrubě rozdělit na předběžné, rychlé (s relativně menší spolehlivostí výsledků), a na specifické, podrobné, které mají vysokou míru přesnosti a spolehlivosti. Většina rychlých testů se soustřeďuje na nejfrekventovanější agens izolovaná v mykologických laboratořích – kandidy (Tab. 5).

Tab. 5 – Identifikace potenciálně patogenních hub pro člověka

Mykologické minimum


O autorovi:
1Doc. RNDr. Vladimír Buchta, CSc.,
2doc. MUDr. Petr Hamal, Ph. D.,
3MUDr. Naďa Mallátová,
4Mgr. Iva Kocmanová,
5MUDr. Vanda Chrenková,
6MUDr. Markéta Roubalová,
7MUDr. Petra Olišarová

1Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Hradec Králové, Ústav klinické mikrobiologie

2Univerzita Palackého v Olomouci, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice, Ústav mikrobiologie

3Nemocnice České Budějovice, a. s., Centrální laboratoře, Laboratoř lékařské parazitologie a mykologie

4Fakultní nemocnice Brno, Oddělení klinické mikrobiologie

5Univerzita Karlova v Praze, 2. lékařská fakulta a Fakultní nemocnice v Motole, Ústav lékařské mikrobiologie
6Institut klinické a experimentální medicíny, Pracoviště laboratorních metod

7Všeobecná fakultní nemocnice, Ústav klinické biochemie a laboratorní diagnostiky

e-mail: buchta@fnhk.cz

Ohodnoťte tento článek!