PCR vyšetření tekutiny z bronchoalveolární laváže pro detekci invazívních mykotických infekcí

5. 11. 2010 0:00
přidejte názor
Autor: Redakce
Detekce mikroskopických vláknitých hub jako původců invazívních mykotických infekcí v tekutině získané bronchoalveolární laváží pomocí molekulárněbiologických metod je velmi vhodným doplněním současných diagnostických možností.


Souhrn

Použití specifických PCR metodik umožňuje v relativně krátkém čase určit druh patogenu a vhodně zacílit antimykotickou léčbu. Přestože je PCR diagnostice mykotických infekcí již několik let věnována velká pozornost, stále neexistuje celosvětově standardizovaný postup pro izolaci DNA ani vlastní PCR detekci. Tento článek se zaměřuje zejména na přehled a srovnání doposud publikovaných metod.

Summary

Hrnčířová K., Lengerová M., Ráčil Z., Kocmanová I., Mayer J. Examination of bronchoalveolar lavage fluid for diagnostics of invasive fungal diseases

Detection of filamentous fungi in bronchoalveolar lavage using methods of molecular biology can be very helpful for diagnostics of invasive fungal diseases. Use of specific PCR methods allows to determine the causative agent in a relatively short time and can help to target the antifungal treatment. Great attention is paied to the PCR diagnostics of fungal infections for many years, but no standardized protocol is already available for DNA extraction or PCR detection. This article is focused mainly on a review and comparison of to date published methods.

Problematice diagnostiky invazívních mykotických infekcí pomocí molekulárněbiologických metod je v posledních letech věnována velká pozornost. Přesto však stále neexistuje jediný celosvětově standardizovaný protokol. Jednotlivé pracovní skupiny se neshodují na postupu pro izolaci fungální DNA ani na metodách používaných pro PCR amplifikaci. Přesto se detekce nukleových kyselin mikromycet v klinických vzorcích stává stále důležitější součástí diagnostických postupů.
Jednou z nejčastějších vstupních bran do organismu bývají pro vláknité houby (zejména Aspergillus spp.) dýchací cesty. Proto jsou plíce zpravidla nejčastěji primárně postiženým orgánem. Zatímco nález na HRCT (výpočetní tomografie s vysokým rozlišením) bývá zpravidla nespecifický a časově náročné kultivační vyšetření nám často nakonec neposkytne očekávaný výsledek, molekulární diagnostika z tekutiny získané bronchoalveolární laváží (BAL) – tedy z materiálu pocházejícího přímo z místa infekce – může v relativně krátkém čase umožnit určení druhu patogenu a včasnou volbu odpovídající antimykotické léčby.

Epidemiologie – jaké patogeny jsou ve vzorku detekovány

Při použití vysoce citlivých molekulárněbiologických metod je zapotřebí si uvědomit, že tekutina z BAL není primárně sterilní materiál. Kromě mikroorganismů z místa výplachu (infekce) je možné nalézt také kontaminující mikroorganismy z horních cest dýchacích nebo ústní dutiny a na to musíme brát při vyhodnocování výsledků ohled. Mezi vůbec nejčastější původce plicních infekcí u hematoonkologických nemocných patří vláknité houby rodu Aspergillus. V posledních několika letech je však zaznamenáván stále vyšší nárůst počtu infekcí způsobených dříve vzácnými mykotickými patogeny – zejména zygomycetami a některými dalšími vláknitými houbami – např. Fusarium spp., Scedosporium spp. atd.(1, 2) Běžnou flórou ústní dutiny a také velmi často kolonizujícím organismem v dýchacích cestách je Candida spp. Častý nález těchto kvasinek v tekutině z BAL tak zpravidla reprezentuje kolonizaci nebo kontaminaci, nikoliv aktivní infekci a nelze jej proto považovat za diagnostické kritérium. Ani kvantifikace nálože ve vzorku není v tomto případě dostačující. V tekutině z BAL je pomocí molekulárněbiologických metod často detekována také DNA vláknitých hub z prostředí, které ovšem infekci způsobují jen velmi zřídka – jedná se zejména o Penicillium spp., Cladosporium spp., Acremonium spp. a další. Naopak nález vysokého množství DNA Aspergillus spp., zygomycet nebo jiných klinicky významných vláknitých hub v BAL hematoonkologických nemocných je významným faktorem predikujícím plicní infekci.(3)

Izolace fungální DNA z BAL

Izolace DNA z klinického vzorku je naprosto zásadním krokem pro úspěšnou PCR diagnostiku. Izolační metoda musí být velmi účinná, aby umožnila rozrušení odolné buněčné stěny mikromycet, avšak musí být rovněž jednoduchá a časově a finančně nenáročná, aby byla vhodná pro rutinní diagnostiku. Dále je zapotřebí v co nejvyšší míře zamezit kontaminaci vzorku konidiemi mikromycet přítomnými v okolním prostředí. Izolaci je vhodné provádět v laminárním boxu pravidelně sterilizovaném germicidní UV lampou a používat izolační soupravy, chemikálie, zkumavky a další potřebné vybavení prosté vláknitých hub nebo jejich DNA. Mezi nejúčinnější a nejčastěji používané postupy pro izolaci fungální DNA patří enzymatická nebo mechanická lýza buněk. Enzymatická lýza byla použita u několika publikovaných real-time PCR metod (kvantitativní PCR v reálném čase) pro detekci Aspergillus spp.,(4–7) pro svou časovou náročnost (je nutná několikahodinová inkubace vzorku s enzymem) však není pro použití v rutinní diagnostice příliš vhodná.

Velmi účinná a časově nenáročná je metoda mechanické disrupce pomocí vortexování vzorku se skleněnými nebo zirkoniovými kuličkami. Osvědčila se pro izolaci fungální DNA z vláknitých hub v několika studiích, zabývajících se srovnáním různých metodik(8–11) a je doporučována také EAPCRI (European Aspergillus PCR Initiative) – pracovní skupinou, jejímž hlavním cílem je standardizace PCR diagnostiky Aspergillus spp.(12) Pro izolaci fungální DNA z tekutiny z BAL pro real-time PCR diagnostiku je ve studiích nejčastěji používán jako výchozí materiál pelet z 1,5 ml tekutiny z BAL.(4–7, 13) V práci Khot et al. byly testovány rozdíly v použití jednotlivých frakcí z prováděných laváží po centrifugaci. Bylo zjištěno, že mnohem vyšší záchyt aspergilové DNA je při izolaci DNA z peletu, technika využívající pouze supernatant poskytovala horší výsledky. Izolace DNA z peletu i supernatantu zároveň podle autorů není nutná, protože zhruba odpovídá výsledkům izolace DNA ze samotného peletu.(14)

PCR diagnostika z BAL Výběr vhodného cíle, panfungální versus specifická PCR

Vzhledem k tomu, že i při invazívní infekci je množství houbového patogenu ve vzorku zpravidla velmi nízké, je vhodné pro molekulární diagnostiku mykotických infekcí používat tzv. multikopiové geny, které se v genomu nacházejí ve více kopiích. Jedním z nejčastěji používaných cílových úseků je ribosomální DNA (rDNA), která se v genomu mikromycet vyskytuje zhruba ve 100 kopiích.(15) Tento gen se skládá ze tří konzervovaných podjednotek (18S, 58S a 28S) a dvou variabilních oblastí (ITS1 a ITS2). Přestože je podjednotka 18S rDNA mezi mikromycetami velmi konzervovaná, což s sebou nese riziko zkřížené reaktivity v PCR reakci mezi jednotlivými klinicky významnými druhy (např. Aspergillus spp.) a kontaminantami z prostředí (Penicillium spp., Cladosporium spp.), stále je často jako cíl PCR metodik používána.(13, 14, 16) Zvláště pro diagnostiku z nesterilních materiálů se však jako vhodnější jeví méně konzervované úseky (např. ITS2 rDNA nebo gen pro mitochondriální DNA [mtDNA]), které umožňují navržení specifičtějších postupů.(4–6, 17) Je také zřejmé, že ze stejných důvodů není pro diagnostiku IFD vhodné použití panfungálních metod.

Tyto metody sice umožňují detekci širokého spektra vláknitých hub v jedné reakci, ale PCR produkt je pro ověření výsledku a určení druhu vždy nutné sekvenovat, což může analýzu zdržet až o dva a více dní. Vzhledem k časté přítomnosti kolonizujících/kontaminujících druhů ve vzorku dochází také ke kompetici jejich DNA s DNA infekčního agens o primery, což může mít za následek snížení senzitivity reakce nebo získání falešně pozitivních výsledků. Podobný problém může nastat také při použití panfungálních primerů, byť ve spojení se specifickou sondou. Na Obr. 1 je znázorněn výsledek srovnání dvou real-time PCR metod pro detekci Aspergillus fumigatus. V PCR reakci bylo amplifikováno desítkové ředění DNA A. fumigatus (2x 106–2x 101) samostatně (křivky červené barvy) a ve směsi s DNA Penicillium brevicompactum (křivky modré barvy). Stejný pokus byl proveden metodou využívající panfungální primery ve spojení se sondou specifickou pro A. fumigatus (A) a metodou využívající A. fumigatus specifickou sondu i primery (B). Účelem tohoto pokusu bylo simulovat prostředí v klinickém vzorku, kde se kromě DNA patogenu nachází také DNA kontaminant z prostředí. Jak z obrázku názorně vyplývá, při použití panfungálních primerů dochází ke kompetici mezi DNA A. fumigatus (patogen) a P. brevicompactum (kontaminanta), což vede k výraznému snížení senzitivity reakce – u ředění A. fumigatus 2krát 103 je zřetelná horší amplifikace PCR produktu (amplifikační křivka je skloněná a posunutá doprava), u dalších ředění nedochází k amplifikaci vůbec (A). Naopak u metody používající primery specifické pro A. fumigatus k žádnému ovlivnění reakce přítomností DNA P. brevicompactum nedochází.

Obr. 1 – Srovnání dvou real-time PCR metod pro detekci Aspergillus fumigatus – metody využívající sondu specifickou pro A. fumigatus, ale panfungální primery (A), a metody využívající A. fumigatus specifickou sondu i primery (B). V PCR reakci bylo amplifikováno desítkové ředění DNA A. fumigatus (2x 106– 2x 101) samostatně (křivky červené barvy) a ve směsi s DNA Penicillium brevicompactum (křivky modré barvy). Při použití panfungálních primerů dochází ke kompetici mezi DNA A. fumigatus (patogen) a P. brevicompactum (kontaminanta), což vede k výraznému snížení senzitivity reakce – u ředění A. fumigatus 2x 103 zřetelná horší amplifikace PCR produktu (amplifikační křivka je skloněná a posunutá doprava), u dalších ředění nedochází k amplifikaci vůbec (A). Naopak u metody používající primery specifické pro A. fumigatus k žádnému ovlivnění reakce nedochází a amplifikace probíhá beze změny i u nižších ředění DNA A. fumigatus (B).

Kvantifikace nálože fungální DNA

Jak už bylo řečeno, vzorek získaný BAL není primárně sterilním materiálem. Kromě DNA etiologického agens infekčního procesu se v něm může nacházet také DNA plísní kolonizujících horní cesty dýchací nebo DNA mikromycet z okolního prostředí inhalovaných pacientem nebo zavlečených při odběru nebo zpracování vzorku. Z toho vyplývá, jak důležitou roli může hrát kvantifikace nálože fungální DNA ve vzorku. Proto by měly být pro PCR diagnostiku mykotických infekcí jednoznačně upřednostňovány kvantitativní metody – tedy real-time PCR. Jednoduchost a relativně rychlé získání výsledku (není nutná sekvenace PCR produktu ani jiná post-amplifikační manipulace se vzorky) jsou dalšími výhodami použití real-time PCR.(18) Kontroly správného provedení a pra pra pra průběhu PCR a izolace DNA Pro získání validních výsledků je vždy zapotřebí monitorovat průběh izolace DNA i PCR amplifikace. Velmi vhodné je při izolaci DNA společně se vzorky zpracovávat i tzv. negativní kontrolu izolace – tedy vzorek vody, který projde stejným procesem jako všechny ostatní vzorky a pomůže nám odhalit případnou kontaminaci v průběhu izolačního procesu. Podobnou kontrolu – NTC (no template control, kontrola bez templátu, kdy je do reakční směsi místo DNA přidán pouze adekvátní objem sterilní vody) je ideální použít i pro samotnou PCR amplifikaci.(13, 14, 17)

Dále je vhodné použití tzv. interní kontroly amplifikace. V tomto případě je do reakční směsi pro PCR se vzorkem přidána exogenní DNA o známém množství a je srovnávána její amplifikace samostatně a ve směsi se vzorkem. Horší amplifikace kontroly ve směsi se vzorkem pak ukazuje na inhibici PCR reakce. V publikovaných pracích bylo takto použito např. známé množství genomové DNA A. fumigatus(4, 13, 17) nebo umělý templát odvozený z genu pro ekvorin (z medúzy).(14) Bylo také zjištěno, že kvalitu lavážní tekutiny může reflektovat množství lidské DNA ve vzorku. Fréalle et al.(17) ve své práci ve vzorcích z BAL kvantifikovali lidskou DNA pomocí real-time detekce beta-globinu a poukázali na fakt, že ve vzorcích pozitivních na Aspergillus spp. bylo detekováno vyšší množství betaglobinu než u vzorků na Aspergillus spp. negativních. Měřením množství lidské DNA v tomto materiálu se zabývali ve své práci také Khot et al., kteří detekovali gen pro lidskou 18S rDNA.(14) Další možností sledování množství lidské DNA ve vzorku je také např. kvantitativní detekce genu pro lidský albumin. Je zřejmé, že nález vysokého množství lidské DNA ve vzorku může potvrdit skutečnou negativitu vzorku na Aspergillus spp. Naopak při zjištění nízké kvantity lidské DNA v tekutině z BAL je při interpretaci negativních výsledků nutná určitá obezřetnost.(14)

Možnost ovlivnění PCR diagnostiky tekutiny z BAL probíhající antimykotickou léčbou I přes použití všech dostupných kontrol pro monitoring správného průběhu izolace DNA a PCR amplifikace je při hodnocení výsledku vyšetření zapotřebí brát v potaz také další faktory – např. možnost ovlivnění výsledku PCR probíhající antimykotickou léčbou. Na tuto skutečnost jsou však názory rozporuplné. Velkou roli hraje zejména malý počet doposud uskutečněných a publikovaných studií. Zatímco Fréalle et al.(17) tvrdí, že výsledky jejich real-time PCR tekutiny z BAL nebyly probíhající antimykotickou léčbou významně ovlivněny, Francesconi et al.(7) u zvířecího modelu invazívní aspergilózy zaznamenali výrazný pokles senzitivity jejich real-time PCR metody – a to na 50 %, zatímco specificita se nezměnila. Zcela jinou zkušenost mají Musher et al.,(13) kteří naopak zaznamenali zvýšení senzitivity jejich real-time PCR v průběhu antimykotické léčby. Není tedy vyloučené, že může vlivem probíhající antimykotické léčby docházet k ovlivnění výsledků PCR metod a je proto vhodné brát při hodnocení výsledků na tuto skutečnost ohled.

Publikované real-time PCR metody pro detekci Aspergillus spp. z tekutiny z BAL Pro PCR diagnostiku invazívní aspergilózy bylo v posledních letech publikováno velké množství různých metod. Jen malé množství z nich však splňuje vysoké nároky na detekci z primárně nesterilního materiálu, jakým je tekutina získaná BAL. Jak už bylo řečeno, není vhodné v tomto případě použít metody, které amplifikují příliš konzervativní úsek DNA (z důvodu možné souběžné amplifikace DNA vláknitých hub přítomných v prostředí), ze stejného důvodu není vhodné ani použití panfungálních metod a samozřejmou nutností je kvantifikace nálože aspergilové DNA ve vzorku pro odlišení případné kolonizace/kontaminace od aktivní infekce. Dále pak metoda nesmí detekovat lidskou DNA, která je ve vzorku ve velkém nadbytku.

Dalším významným faktem je nutnost validace metody na dostatečném množství klinických vzorků. Velmi častým problémem – vzhledem k obecně nízkému výskytu invazívních mykotických infekcí a také celkově obtížné diagnostice – bývá právě získání dostatečného počtu vzorků od pacientů s prokázanou nebo pravděpodobnou invazívní aspergilózou, což zavádění nových metod značně komplikuje. Další možností pro validaci metod tak může být použití zvířecích modelů invazívní aspergilózy. Jejich hlavní nevýhodou oproti skutečným klinickým vzorkům je ale to, že zvířata bývají zpravidla infikována velmi vysokým množstvím houbových konidií a míra pozitivity takto získaných vzorků může být proto výrazně vyšší a ne zcela odpovídající běžným klinickým vzorkům lidských pacientů.

Přehled nejvýznamnějších doposud publikovaných real-time PCR metod pro detekci Aspergillus spp. nebo Aspergillus fumigatus v tekutině získané bronchoalveolární laváží shrnuje Tab. Jak je na první pohled zřejmé, publikované práce jsou velmi heterogenní. Srovnání těchto metod a vyvození jednoznačných závěrů o možnostech jejich využití v rutinní laboratorní diagnostice je prakticky nemožné. Některé práce bohužel vůbec neuvádí údaje o specificitě nebo senzitivitě metod, velmi rozdílné jsou hraniční hodnoty pro interpretaci vzorku jako pozitivního a liší se také údaje o náloži aspergilové DNA u pozitivních vzorků. Ve většině prací chybí údaje o limitu detekce dané metody. Žádnou z těchto metod tak nelze jednoznačně doporučit ani zavrhnout, bohužel je zde znát, jak potřebná by byla standardizace PCR diagnostiky aspergilóz. Z komerčních souprav určených pro detekci Aspergillus spp. v tekutině z BAL je momentálně dostupná pouze nová verze diagnostického kitu MycAssay™ Aspergillus britské firmy Myconostica. Sám výrobce však uvádí, že tento test kromě širokého spektra druhů Aspergillus spp. detekuje také Penicillium spp., častou kontaminantu z prostředí.(19)

Tab. – Přehled nejvýznamnějších publikovaných real-time PCR metod pro detekci Aspergillus spp.
nebo Aspergillus fumigatus v tekutině získané bronchoalveolární laváží

PCR metody pro detekci ostatních vláknitých mykotických patogenů v tekutině z BAL

Infekce způsobené ostatními vláknitými houbami stály dlouhou dobu v pozadí, teprve v posledních asi deseti letech byl zaznamenán postupný zvyšující se nárůst infekcí způsobených zejména zygomycetami a vzácněji některými dalšími druhy (Fusarium spp., Scedosporium spp.) Proto také molekulární diagnostice těchto vzácných infekcí nebyla věnována zdaleka taková pozornost jako diagnostice invazívní aspergilózy. V posledních několika letech se však již začínají objevovat publika prvních real-time PCR metod pro detekci zygomycet(20–22) a dokonce i Scedosporium spp.(23) Jedná se ale zpravidla o diagnostiku ze vzorků tkání z postižených míst, kde bývá nálož fungální DNA nejvyšší a tak je tento materiál pro PCR diagnostiku nejsnadnějším cílem. V případě diagnostiky vzácných mykóz z lavážní tekutiny nebyl doposud publikován dostatek informací. Vzhledem ke vzácnosti těchto onemocnění je velmi obtížné získat dostatečný počet vzorků od pacientů s prokázanou nebo alespoň pravděpodobnou zygomykózou nebo ostatními vzácnými mykózami, což zavádění nových metod velmi komplikuje. K dispozici jsou zatím jen údaje z testování na zvířecích modelech – Kasai et al. publikovali dvě metody pro specifickou detekci Rhizopus spp., Mucor spp., Rhizomucor spp. (PCR1) a Cunninghamella spp. (PCR2) cílené do úseku 28S rDNA.(21)

Těmito metodami bylo testováno 22 (PCR1) a 15 (PCR2) vzorků z BAL ze zvířecích modelů invazívní zygomykózy, z nichž všechny byly PCR pozitivní. Limit detekce byl stanoven na 10 fg pro Rhizopus oryzae, Rhizopus microsporus a Mucor circinelloides a 10 pg pro Rhizomucor pusillus. U dalších real-time PCR metod bohužel prozatím nebyly publikovány údaje o detekci vzácných mykotických patogenů z tekutiny z BAL, avšak v blízké době je určitě možné je očekávat, podobně jako u metod pro diagnostiku invazívních aspergilóz.

Návrh postupu pro vyšetřování tekutiny z BAL pacientů s podezřením na mykotickou infekci

Na základě zkušeností s molekulární diagnostikou mykotických infekcí na Interní hematoonkologické klinice Fakultní nemocnice Brno byl navržen a zaveden do rutinní diagnostické praxe následující postup pro vyšetřování tekutiny z BAL pomocí PCR (Obr. 2). V prvním kole je vzorek testován na nejčastější patogeny ze skupiny vláknitých mikroskopických hub – Aspergillus fumigatus specifickou seminested real-time PCR metodou a seminested real-time PCR metodou s High Resolution Melt (HRM) analýzou specifickou pro zygomycety.(22) V dalším kole v případě potřeby následuje rozšířené testování na další klinicky významné druhy rodu Aspergillus a specifické real-time PCR metody pro konkrétní zygomycety (pro potvrzení výsledků HRM a přesnější kvantifikaci nálože DNA zygomycet ve vzorku). Pokud u pacienta existuje vážné podezření na mykotickou infekci a patogen se přesto nepodařilo odhalit, následuje panfungální PCR cílená do variabilního úseku ITS2 spojená s určením druhu pomocí sekvenace PCR produktu. Tento poslední krok však již reprezentuje spíše výzkumnou část práce.

Obr. 2 – Navrhovaný postup používaný pro vyšetřování tekutiny z BAL pacientů s podezřením na mykotickou infekci na IHOK FN Brno. V prvním kole je vzorek testován na nejčastější patogeny ze skupiny vláknitých mikroskopických hub – Aspergillus fumigatus a zygomycety. Ve druhém kole podle potřeby následují navazující PCR vyšetření – na další klinicky významné druhy Aspergillus (v případě pacientů pozitivních na galaktomannan) a v případě pozitivního výsledku na zygomycety pak specifické metody pro konkrétní druh zygomycety (pro potvrzení výsledku a přesnější kvantifikaci nálože fungální DNA ve vzorku). Pokud se přes významné podezření na mykózu ve vzorku patogen nepodaří odhalit, následuje panfungální PCR cílená do variabilního úseku ITS2 spojená s určením druhu pomocí sekvenace PCR produktu. V tomto posledním kroku se již jedná spíše o výzkumnou část práce, kvalitativní panfungální metoda není z mnoha důvodů popsaných v článku vhodná pro rutinní diagnostické použití a neumožňuje nám získat dostatečně validní výsledky.

Závěr

Přestože se PCR diagnostika mykotických infekcí stále vyvíjí a není doposud nijak standardizovaná, hraje velmi významnou roli a je vhodným doplněním stávajících diagnostických metod. Molekulárněbiologické metody v sobě spojují předpoklady vysoké citlivosti a specificity a umožňují konkrétní patogen určit v relativně krátkém čase. Vysoká citlivost je bohužel spojena také s vysokým rizikem kontaminace vzorků mikromycetami z prostředí v průběhu celého procesu od izolace DNA až po vlastní PCR amplifikaci. Je tedy důležité používat specifické metody, dbát ve vysoké míře na dodržování protikontaminačních opatření a v neposlední řadě používat pro diagnostiku kvantitativní metody, které umožňují stanovit nálož fungální DNA ve vzorku, což je důležité pro odlišení případné kolonizace/kontaminace od aktivní infekce. Veškeré výsledky získané pomocí PCR metodik je zapotřebí vždy interpretovat v kontextu s výsledky ostatních diagnostických metod.

Tato práce byla podpořena granty Ministerstva zdravotnictví České republiky č. NS10441-3/2009 a NS10442-3/2009, grantem Masarykovy univerzity č. MUNI/A/1012/2009 a grantem Ministerstva průmyslu a obchodu České republiky č. FR–TI2/254.


O autorovi: 1Mgr. Kristýna Hrnčířová, 1Mgr. Martina Lengerová, Ph. D., 2Mgr. Iva Kocmanová, 3MUDr. Zdeněk Ráčil, Ph. D., 3prof. MUDr. Jiří Mayer, CSc.
1Masarykova univerzita, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Brno, Interní hematoonkologická klinika, Centrum molekulární biologie a genové terapie

2Fakultní nemocnice Brno, Oddělení klinické mikrobiologie

3Masarykova univerzita, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Brno, Interní hematoonkologická klinika

e-mail: khrncirova@fnbrno.cz

  • Žádné názory
  • Našli jste v článku chybu?

Byl pro vás článek přínosný?