Úloha PCR v diagnostice invazívní aspergilózy

Včasná diagnostika invazívní aspergilózy (IA) a zahájení odpovídající terapie je klíčové pro prognózu nemocných. Tento článek shrnuje dosavadní poznatky s využitím PCR pro diagnostiku IA u imunokompromitovaných pacientů. Důraz je kladen zejména na výběr klinického materiálu, metody izolace DNA, PCR metodiky a korelaci výsledků PCR s dalšími markery a na jejich interpretaci.

Summary

Lengerová, M., Bolehovská, R., Hrnčířová, K., Žák, P., Ráčil, Z., Kocmanová, I., Mayer, J. Role of PCR in diagnostics of invasive aspergillosis

Early diagnostics of invasive aspergillosis (IA) is crucial for patient’s favorable outcome. This article summarizes advances in PCR diagnostics of IA in immunocompromised patients. Type of clinical material, DNA isolation methods, PCR target genes and correlation of PCR results with other markers of IA are discussed.

Invazívní aspergilóza (IA) je častou a stále život ohrožující infekcí hematoonkologických pacientů(1) a včasná diagnostika je pro další prognózu pacienta zcela zásadní. V současné době je rutinní diagnostika založena na kombinaci klinických příznaků, radiologického nálezu a výsledků mikrobiologických testů. Dušnost, horečka, kašel a bolest na hrudi jsou časté, ale velmi nespecifické klinické příznaky. Radiologický nález na HRCT (High Resolution Computed Tomography, výpočetní tomografie s vysokým rozlišením) hrudníku (jako nejčastějšího místa postižení) se ukázal pro diagnostiku IA jako velmi přínosný.

Bohužel obraz halo-sign, typický pro aspergilózu, je přítomen pouze dočasně a air-crescent sign je pro změnu přítomen až ve velmi pokročilých stadiích infekce.(2) Histologický průkaz mykotických elementů v postižené tkáni a pozitivní kultivace z primárně sterilních míst jsou nadále „zlatým standardem“ metod klasické mikrobiologie. Bohužel u hematoonkologických pacientů jsou kultivace pozitivní jen velmi zřídka – většinou kvůli časnému zahájení empirické antimykotické terapie, která ovlivní viabilitu plísní in vitro, a bioptické vzorky je většinou obtížné získat, zejména jedná-li se o pacienty s trombocytopenií.

Nekultivační metodiky se zaměřují na detekci komponent buněčné stěny hub, které se uvolňují do krevního řečiště. Galaktomanan (GM) je povrchový antigen buněčné stěny a jeho detekce v séru, bronchoalveolární laváži nebo likvoru je důležitým diagnostickým markerem,(3, 4) který je také součástí kritérií Evropské organizace pro výzkum a léčbu rakoviny (EORTC, European Organization for Research and Treatment of Cancer) pro diagnostiku IA.(5) Nově je součástí těchto kritérií také další sérologický marker, 1,3-betaD-glukan (BG), i když větší prospektivní studie týkající se přínosnosti detekce BG zatím nejsou k dispozici.

C.albicans (sputum) barveno dle Grama
Autor: Mgr. Iva Kocmanová, Fakultní nemocnice Brno, Oddělení klinické mikrobiologie

Detekce fungální DNA v klinických vzorcích metodou PCR je další metodikou, která se nabízí. PCR diagnostika má dnes svou nezastupitelnou úlohu v mnoha oblastech lékařské mikrobiologie(6) (zejména detekce virů nebo obtížně kultivovatelných baktérií), ale její použití pro rutinní diagnostiku mykotických infekcí je dosud velmi diskutovaným tématem.(7, 8) Hlavními úskalími jsou:
1. fungální buňky jsou velmi odolné (mají silnou buněčnou stěnu, podobající se svým složením spíše buňkám rostlinným než živočišným), a proto není možné použít běžně používané metody izolace DNA;
2. v současné době máme omezené poznatky o vlastní biologii mykotických infekcí (kdy je uvolňována fungální DNA);
3. množství fungální DNA je podle dostupných údajů v klinických vzorcích velmi nízké;
4. je proto nutné používat velmi citlivé a zároveň specifické metody, protože detekce plísní z primárně nesterilních materiálů (bronchoalveolární laváž) může být komplikována kontaminací vzorku nebo kolonizací pacienta.

Do současnosti bylo publikováno několik desítek prací, které popisují použití PCR k testování klinických vzorků od pacientů v různém riziku nebo s různou pravděpodobností diagnózy IA. Bohužel doposud neexistuje žádná standardizovaná metodika a víceméně každá z laboratoří používá svůj vlastní originální přístup. Standardizací metodiky PCR pro diagnostiku IA se zabývá mezinárodní pracovní skupina EAPCRI (European Aspergillus PCR Initiative, Evropská iniciativa pro PCR detekci Aspergillus spp.) při ISHAM (International Society for Human and Animal Mycology, Mezinárodní společnost pro humánní a veterinární mykologii), která v minulých letech zorganizovala několik testů pro kontrolu kvality, kterých se mohly zúčastnit laboratoře se svými in-house metodami a na simulovaných klinických vzorcích (vzorky krve se zaočkovaným definovaným počtem aspergilových konidií) si ověřit jejich účinnost. Ani z této iniciativy však dosud nevzešla jednoznačná doporučení. Cílem této práce je shrnout dosavadní literární poznatky, na základě vlastních zkušeností autorů diskutovat ty nejpodstatnější a navrhnout optimální postup při diagnostice.

Vyšetřovaný materiál

Pomocí molekulárněbiologických metod, nejčastěji PCR, je možné vyšetřovat téměř jakýkoliv biologický materiál – krev, bronchoalveolární laváž (BAL), sputum či jiné vzorky z dýchacích cest, likvor, tkáně, sklivec a další. Výběr materiálu tedy závisí zejména na klinických projevech aspergilové infekce. Zároveň je však nutné myslet na to, že u méně obvyklých materiálů může být interpretace jak pozitivního, tak negativního výsledku složitá. Mezi nejčastěji vyšetřované materiály patří periferní krev a BAL. V případě krve se jedná o vzorek relativně snadno získatelný, s možností častých opakovaných odběrů.

Doposud ale není jasné, která frakce krve (plná krev, sérum nebo plazma) je pro detekci aspergilové DNA optimální.(9) Existuje studie, která dokazuje stejnou výtěžnost DNA ze séra, plazmy a pelety leukocytů.(10) Jiné naopak popisují lepší výtěžnost z plné EDTA krve než z plazmy nebo ze séra než z plazmy.(9) Nedávno McCulloch a spol.(11) zjistili, že signifikantně vyšší výtěžnost aspergilové DNA je v krevní sraženině než v plné EDTA krvi nebo séru. V případě séra je možné nižší senzitivitu záchytu vysvětlit tím, že hyfy a fagocytované houbové elementy (živé nebo usmrcené) jsou odstraněny spolu s krevní sraženinou.

Otázkou také je, jakou formu plísňové buňky obsahující DNA v krvi detekujeme. Jde uvolněné konidie, neviabilní fragmenty plísňových hyf, fagocytované části nebo volnou DNA? Přítomnost konidií v krvi je velmi nepravděpodobná, protože prostředí v krevním řečišti je pro jejich tvorbu zcela nevhodné. Navíc v krvi cirkuluje při systémové aspergilové infekci velmi malé množství, které odpovídá přibližně 1 CFU/ml (colony forming unit/ml), tzn. u většiny metod pod hranicí, event. na hranici detekce PCR metod.

Vzorky BAL se zdají být velmi vhodné, protože aspergilové infekce vznikají primárně jako vzdušné plicní infekce a pouze sekundárně se rozšiřují do krevního řečiště v závislosti na imunokompetenci hostitele.(12)Při porovnání PCR výsledků ze vzorků krve a BAL pacientů s hematologickými malignitami zjistil Buchheidt a kol.(12) o něco vyšší senzitivitu a specifitu ve prospěch BAL. Nevýhodou vzorků BAL je riziko kontaminace vzdušnými spórami nebo kolonizace dýchacích cest aspergily, jejichž důsledkem jsou poté falešně pozitivní výsledky PCR.

Kontaminace během samotného procesu přípravy DNA a PCR reakce je v případě optimalizovaných podmínek v laboratoři zanedbatelná.(12) Obecně lze říci, že čím blíže je odebraný vzorek místu postižení, tím je větší šance na pozitivní výsledek PCR reakce. V případě plicního postižení (které je nejčastější) je vhodný vzorek BAL nebo bioptované tkáně, neboť negativní výsledek z periferní krve bohužel nemůže infekci vyloučit.

Izolace DNA z klinických vzorků

Běžným postupem izolace DNA pro účely molekulární mikrobiologie je lýza buněk přítomných ve vzorku, nanesení lyzátu a následná separace DNA na kolonkách (obsahují membránu, která je schopna selektivně zachytit molekuly DNA, které jsou při promývání zbaveny zbytků proteinů a jiných látek, jež by mohly inhibovat vlastní PCR amplifikaci). Buněčnou stěnu hub, která obsahuje velké množství složitých polysacharidů (např. galaktomanan, glukan, chitin), bohužel nelze rozrušit pomocí lyzačních roztoků, které jsou součástí běžných kitů pro izolaci DNA – je nutné ji narušit chemicky, mechanicky nebo enzymaticky.

Dosud neexistuje žádný doporučený postup pro izolaci fungální DNA z klinických vzorků a protokol se liší doslova publikaci od publikace. Některá pracoviště se spoléhají na komerční kity, např. ve spojení s automatickou extrakcí DNA, na jiných se před vlastní izolací používají různé preinkubace vzorků nebo se naopak komerční kity nevyužívají vůbec a dává se přednost klasickým postupům, např. fenol-chloroformové extrakci.

Výběr metody pro izolaci DNA musí splňovat následující požadavky – metoda izolace musí být dostatečně účinná, aby umožňovala izolaci i velmi malého množství DNA, a zároveň nesmí být příliš časově ani finančně náročná, aby se dala použít v rutinní diagnostice. Důležitým faktorem je také to, jak moc je nutné se vzorkem při extrakci DNA manipulovat – je nutné zabránit kontaminaci vzorku plísněmi z prostředí, proto je optimální zvolit co nejjednodušší postup.

Z prací, které srovnávají různé postupy izolace, bylo jasně prokázáno, že pro rozrušení rigidních buněčných stěn hub je nejvhodnější jejich mechanické rozbití.(13–15) Jako jednoduchý a velice účinný způsob, který se osvědčil v naší laboratoři, se ukázalo vortexování vzorku v přítomnosti skleněných kuliček.(16) Vzhledem k tomu, že PCR diagnostika je velmi citlivá na kontaminaci vzorku, je při zpracování vhodné vždy spolu s klinickým vzorkem zpracovat také alikvot sterilní injekční vody, který podrobíme všem izolačním krokům a následně testujeme spolu se vzorkem.

Polymerázová řetězová reakce

Pro detekci aspergilového agens pomocí molekulárněbiologických metod se nejčastěji používá amplifikace DNA pomocí PCR a senzitivita PCR reakcí, tj. schopnost záchytu aspergilových infekcí, je ovlivněna také výběrem cílových genů, resp. primerů. Nejčastěji se pro amplifikaci volí primery z oblasti tzv. multikopiových genů (v genomu přítomny v desítkách až ve stovkách kopií). Velice často se jedná o geny pro jadernou ribosomální DNA (rDNA) a mitochondriální DNA.

Genů pro rDNA je v genomu plísní obvykle několik desítek a skládají se ze tří podjednotek 18S rRNA, 5,8S rRNA a 28S rRNA a dvou oblastí ITS (internal transcribed spacer, ITS1 a ITS2). Mitochondriální geny většinou kódují některý z tRNA genů nebo cytochrom B. V případě detekce vícekopiových genů je PCR reakce velmi citlivá, v případě detekce vícekopiových genů je PCR schopná detekovat i méně než jeden genom. Senzitivita PCR s často používanými primery z oblasti 18S rRNA a PCR s primery detekující aspergilovou mitochondriální DNA je srovnatelná a pohybuje se mezi jednou až pěti CFU/ml.(17)

Primery navržené do konzervativních oblastí genomu (shodné u evolučně příbuzných druhů) na jedné straně umožňují výhodnou panfungální detekci (např. detekci několika druhů rodu Aspergillus v jedné PCR reakci), ale na druhé straně při použití těchto primerů může dojít ke cross-reaktivitě s jinými plísněmi, zejména s rodem Penicillium a Cladosporium, které patří k plísním z prostředí a jejichž přítomnost ve vzorku značí spíše kontaminaci než původce infekce. Pozitivní výsledek u panfungálních metod pouze říká, že ve vzorku je přítomna DNA plísní – pro určení konkrétního původce infekce je nutná např. sekvenace PCR produktu nebo dourčení pomocí druhově specifické PCR.

Detekce aspergilové DNA může probíhat také v různých amplifikačních formátech (např. nested PCR, real-time PCR, PCRNested formát je široce používán zejména z důvodu analytické ELISA apod.), z nichž každý může mít své výhody a nevýhody. citlivosti, ale na druhou stranu jeho velkou nevýhodou je náročnost provedení a reálné riziko kontaminace v důsledku manipulace s PCR produkty externího kola, tj. vzniku falešně pozitivních výsledků.(9) V dnešní době je nested PCR často nahrazována real-time PCR. Ta využívá pro amplifikaci aspergilové DNA kromě specifických primerů také specifické sondy. Její nespornou výhodou je rychlost a možnost kvantifikace množství aspergilové DNA, která je výhodná např. pro rozdělení pacientů do rizikových skupin nebo sledování účinnosti případné antimykotické terapie.

I přes rozvoj PCR metodik zůstává jejich nevýhodou nízká úroveň standardizace. Proto má každá laboratoř zaveden systém vnitřní kontroly kvality, jehož nedílnou součástí je pozitivní, negativní kontrola, ale i tzv. kontrola inhibiční. Pomocí ní je tak každý vzorek ověřen i na přítomnost inhibitorů DNA polymerázy, díky čemuž se minimalizuje riziko vydávání falešně negativních výsledků.

Kvantifikace nálože fungální DNA v klinických vzorcích

Jedním z možných přístupů, jak odlišit kolonizující, případně kontaminující druh plísně od toho, který je etiologickým agens infekčního procesu, je kvantifikace fungální nálože. Přechodná přítomnost nebo kolonizace dýchacích cest aspergily může být až u 25 % vzorků BAL zdrojem falešně pozitivních výsledků neboli neprobíhající infekce.(18) Dosud publikovaná data ukazují, že množství patogenu je ve vzorcích (zejména v krvi a v jejích frakcích) velice nízké a i v případě kultivačně prokázané aspergilózy se pohybuje na samém detekčním limitu real-time PCR.(19)

Stanovení hranice pozitivity, která odpovídá diagnóze IA, dosud není známé. Vzhledem k tomu, že incidence prokázané IA je ve sledovaných populacích velmi nízká (většinou se jedná o pravděpodobnou aspergilóPolymerázová existuje dosud poměrně málo údajů o fungální náloži v jednotlivých stadiích infekce, případně o korelaci nálože s dalšími markery, např. s hodnotou GM nebo glukanu. Při real-time reakci jsou spolu se vzorkem amplifikovány také tzv. standardy (DNA o známém počtu kopií), z těchto je připravena standardní křivka, ze které je vypočítána rovnice pro převod hodnot Ct na kopie v reakci (Obr.).

Obr. – A) Příklad výsledku real-time PCR při detekci fungální DNA v bronchoalveolární laváži. Barevné křivky označují ampli-
fikaci standardní DNA – 1 000 000 až 10 kopií plazmidové DNA se zaklonovaným cílovým genem. Oranžově je vyznačen pozitivní vzorek. B) Softwarové vyhodnocení standardní řady včetně rovnice pro výpočet počtu kopií ve vzorku.

Kvantitativní hodnota je většinou udávána jako množství patogenu na PCR reakci nebo po přepočtu např. na ml BAL nebo krve a séra, gram tkáně atd. Někdy není hodnota přepočítávána na konkrétní kopie, ale udává se pouze jako číslo cyklu PCR, ve kterém amplifikace ve vzorku protnula threshold (vyjádřeno zkratkou Ct = Cycle threshold, nebo Cp = crossing point). V takovém případě se udává, že čím je threshold nižší, tím větší je nálož patogenu. Tab. 1 ukazuje orientační přepočty množství fungální DNA na počet genomů, Ct hodnoty a kopie v real-time PCR reakci o 45 cyklech. V Tab. 2 jsou shrnuty výsledky ze šesti publikací,(19–24) které se zabývají kvantifikací houbové nálože ve vzorcích BAL.

Tab. 1 – Přibližné hodnoty Ct a kopií po real-time PCR amplifikaci
různého množství fungální DNA

Tab. 2 – Příklad dosud publikovaných údajů

Tato tabulka je názornou ilustrací toho, jak heterogenní data jsou v současné době publikována – jednotlivé studie se liší použitou metodou izolace DNA, cílovým genem pro PCR, vyjádřením kvantity ve vzorcích i senzitivitou a specificitou v dané populaci pacientů.
Vzhledem k tomu, že publikovaná nálož je i ve vzorcích BAL (tedy vzorcích, které jsou nejblíže místu infekce) velmi nízká, lze jen spekulovat o přínosnosti PCR detekce z krve a jejích frakcí.

Korelace výsledků PCR s výsledky jiných metod

Korelace PCR s výsledky dalších metod je vzhledem k velké heterogenitě publikovaných výsledků poměrně obtížná. Většina prací srovnává PCR jen s jednou další metodikou (např. kultivací nebo sérologickou detekcí galaktomananu). Srovnání kultivace a PCR je ale vzhledem k jejich řádově odmolekulárněbiologická citlivosti diskutabilní – teoreticky by každý vzorek, který je kultivačně pozitivní, měl být PCR pozitivní; pokud tomu tak není, je nutné hledat chybu v odběru, zpracování vzorku nebo morfologickém zařazení do druhu a rodu. Navíc vzhledem k velmi nízkému počtu vzorků získaných od pacientů s prokázanou IA (kultivačně nebo mikroskopicky z primárně sterilního materiálu), od kterých byly párové vzorky získány, je hodnocení značně subjektivní.

Jistým východiskem z této nejasné situace mohou být studie prováděné na zvířecích modelech IA. Experiment sice nesimuluje zcela přesně průběh IA u pacientů (např. iniciální množství patogenu je v případě inhalačního i intravenózního způsobu infekce řádově odlišné než u pacientů), ale pro srovnání účinnosti a citlivost jednotlivých metod je velmi vhodné a může upozornit na kritická místa použití PCR diagnostiky. Francesconi a kol.(25) ve své studii popsali, že citlivost PCR klesá až o 50 % v případě, že byla zahájena empirická antimykotická terapie.

Scotter a kol.(26) při srovnání GM a PCR uvádějí, že velké množství vzorků krve je negativní i několik dní od infekce, tj. existuje značná variabilita ve fungální náloži mezi jednotlivými pokusnými zvířaty infikovanými za stejných podmínek, která je pravděpodobně dána individuálním stavem imunitního systému. Podobně se mohou lišit také výsledky získané od imunokompromitovaných pacientů. Z práce Scotter a kol.(26) také vyplývá, že více pozitivních vzorků bylo získáno pomocí detekce PCR-ELISA metodou ve srovnání s real-time PCR (uvádějí, že PCR-ELISA je 100krát citlivější než real-time PCR) – to opět svědčí o velmi nízké fungální náloži ve vzorku, která musí být detekována pomocí velmi citlivých metod.

Závěr

PCR diagnostika pomalu, ale jistě získává svou pozici mezi nekultivačními metodami pro diagnostiku IA.
Na rozdíl od jiných aplikací PCR v lékařské mikrobiologii je nutné se při zavádění nových metod pro detekci plísní připravit na řazu), du úskalí. Je nutné ověření účinnosti izolace DNA, pečlivý výběr cílového úseku pro PCR amplifikaci, možnost ověření pozitivního výsledku sekvenací a zejména pečlivá interpretace výsledků s ohledem na výsledky testování GM, klinický stav pacienta a výsledek zobrazovacích metod.

Zkušenosti z našich pracovišť jednoznačně ukazují větší klinickou relevanci výsledků testování vzorků BAL než vzorků krve nebo jejich frakcí. Použití kvalitativních metod, PCR a nested PCR se již v současné době jeví jako nedostatečné – kvantifikace fungální nálože je nezbytná pro odlišení pozitivního výsledku aspergilové PCR v důsledku kolonizace dýchacích cest od pozitivního výsledku v důsledku aktivně probíhající aspergilové infekce.

Ukázalo se, že velmi důležitá je korelace výsledků PCR s detekcí GM. Vzhledem k technické náročnosti a pravděpodobné velké variabilitě mezi jednotlivými pacienty (i skupinami pacientů) je vhodné používat detekci GM jako screeningovou metodu a real-time PCR spíše jako metodu diagnostickou, u pacientů klinickými příznaky IA.

Tato práce byla podporována grantem IGA MZ ČR (NS104423/2009).

O autorovi: 1Mgr. Martina Lengerová, Ph. D., 2Mgr. Radka Bolehovská, 1Mgr. Kristýna Hrnčířová, 3doc. MUDr. Pavel Žák, Ph. D., 1MUDr. Zdeněk Ráčil, Ph. D., 4Mgr. Iva Kocmanová, 1prof. MUDr. Jiří Mayer, CSc.
1Masarykova univerzita, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Brno, Interní hematoonkologická klinika
2Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Hradec Králové, Ústav klinické biochemie a diagnostiky
3Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Hradec Králové, II. interní klinika – Oddělení klinické hematologie
4Fakultní nemocnice Brno, Oddělení klinické mikrobiologie

e-mail: mlengerova@fnbrno.cz

Ohodnoťte tento článek!