Využití molekulárněbiologické diagnostiky v detekci invazívních zygomykóz

V následujícím sdělení předkládáme popisy případů dvou nemocných s akutní leukémií, u kterých došlo během imunosupresívní hematoonkologické léčby k rozvoji invazívní zygomykózy, plicní formy v prvním případě a rinocerebrální formy v druhém případě.

Souhrn

Použití metody polymerázové řetězové reakce vedlo v obou případech k významnému zrychlení diagnostiky a zahájení léčby této závažné invazívní mykózy.

Summary

Weinbergerová, B., Hrnčířová, K., Lengerová, M., Ráčil, Z., Kocmanová, I., Bohatá, Š., Moulis, M., Jedlička, V., Mayer, J. Use of molecular biologic diagnostics in detecting invasive zycomycosis

We present two case reports of patients with acute leukemia who developed invasive zygomycosis, pulmonary form in the first case and rhinocerebral form in the second case, after immunosuppressive hematooncological treatment. Polymerase chain reaction method led in both cases to the distinct acceleration of diagnostic and treatment of this life-threatening invasive mycosis.

Invazívní zygomykóza (IZ) představuje život ohrožující infekci u závažně imunokompromitovaných nemocných. Klinicky nejvýznamnější jsou zygomycety řádu Mucorales, přičemž většina infekcí je způsobena rody Rhizopus, Mucor, Rhizomucor a Absidia. K nákaze dochází nejčastěji inhalací mykotických spór.(1) Incidence IZ u nemocných s hematologickou malignitou je nízká, kolem 0,1 %.(2) U pacientů s hematologickou malignitou však přesahuje mortalita navzdory agresívní chirurgické a antimykotické (ATM) léčbě polyeny 65 %, resp. u příjemců krvetvorné hematopoetické tkáně 90 %.(4, 5, 6, 7)

Nejčastější forma infekce u nemocných s malignitou je plicní v 60 % a rinocerebrální včetně paranazálních dutin (PND) v 19 %. Celkové přežití činí 3 % u neléčených nemocných a 70 % při použití kombinované chirurgické a ATM léčby.(4) Úspěšnost léčby IZ závisí na 4 krocích: časné diagnóze, odstranění predisponujících rizikových faktorů, chirurgickém odstranění nekrotických tkání a časném zahájení ATM léčby.(3) Velkou naději posledních let představuje vývoj metodiky pro detekci zygomycet pomocí molekulárněbiologických metod, které umožňují významné zrychlení diagnostiky IZ.(8, 9)

Zygomycety způsobená cévní trombotizace a následný rozvoj tkáňové nekrózy zapříčiňuje nízký průnik ATM do místa infekce, proto je chirurgické odstranění nekrotických hmot velmi důležitou součástí komplexní léčby IZ. V současnosti doporučovaná ATM v primární léčbě IZ představují lipidové formy amfotericinu B (AMFO B), které zvyšují celkové přežití nemocných na 60 %.(4) Kombinovaná léčba polyeny s posakonazolem (POSA) není v současnosti doporučována v souvislosti s nedostatečným efektem na zvířecích modelech a absencí dostupných klinických dat. V záchranné léčbě je možné použití POSA s udávanou léčebnou odpovědí kolem 60 %.(10, 11)

Vlastní popisy případů

Plicní forma invazívní zygomykózy

57letá pacientka byla přijata na naše pracoviště pod obrazem hyperleukocytózy, hemoragické diatézy a koagulopatie. Diagnostikovali jsme Ph pozitivní common B akutní lymfoblastickou leukémii. Den +13 1. části indukční chemoterapie (CHT) – prednizon, vinkristin, daunorubicin, imatinib – dochází k rozvoji febrilní neutropenie na podkladě kanylové infekce s koaguláza negativním stafylokokem jako etiologickým agens, kterou jsme zaléčili kombinovanou antibiotickou (ATB) terapií (cefepim, vankomycin). Již tehdy je však patrný na rentgenovém vyšetření (rtg) plic nález suspektní zánětlivé infiltrace v horním laloku levé plíce.

Den +32 se objevuje septický stav s následným záchytem Klebsiella pneumoniae s produkcí širokospektré betalaktamázy v hemokultuře zaléčený cíleně ATB. Na kontrolním rtg snímku plic v období restituce hodnot neutrofilů (den +35) je však náhodně zachycena dutinová formace velikosti 37 mm v místě původně popisované zánětlivé infiltrace (Obr. 1). Vysoce rozlišovací počítačová tomografie (high resolution computer tomography, HRCT) potvrdila v S3 levé plíce kulovitou formaci o velikosti 36 mm se solidním obsahem a částečně v dolní části i obsahem vzduchu s opacitami charakteru mléčného zkalení v okolí léze (Obr. 2).

Obr. 1 – Dutinová formace v levém horním plicním laloku při postižení invazívní zygomykózou na zadopředním rtg snímku plic – z archívu Radiologické kliniky LF MU a FN Brno

Obr. 2 – Ložisko při postižení invazívní zygomykózou na HRCT plic –
z archívu Radiologické kliniky LF MU a FN Brno

Vzhledem k nálezu galaktomanan-negativního ložiskového plicního procesu jsme zahájili preemptivní antimykotickou léčbu POSA. V rámci profylaktické ATM léčby byla pacientka do té doby krytá pouze flukonazolem. Den +39 byla provedena bronchoalveolární laváž (BAL) z oblasti B3 s makroskopickým nálezem hnědozeleného sekretu v bronchu. Pomocí metody polymerázové řetězové reakce (polymerase chain reaction, PCR) byla den +42 v lavážní tekutině diagnostikována zygomyceta Rhizopus microsporus. ATM léčbu jsme tedy změnili na cílenou lipidovým komplexem AMFO B v dávce 5 mg/kg/den.

V následujícím odstavci je stručně popsána metodika provedení PCR. Ze 2 ml lavážní tekutiny byla izolována deoxyribonukleová kyselina (deoxyribonucleic acid, DNA) pomocí ZR Fungal/Bacterial DNA Kit™ (Zymo Research, USA). Zygomycetová DNA byla detekována metodou specifické seminested real-time PCR s použitím primerů převzatých z publikace Bialek a kol.(12) Amplifikace byla prováděna v přítomnosti interkalační barvy EvaGreenTM (SensiMix HRM™, Quantace, UK) a zařazení do rodu a druhu bylo provedeno pomocí následné High Resolution Melt analýzy (HRM, analýza křivek tání s vysokým rozlišením). Ve vyšetřovaném vzorku byl na základě srovnání s křivkami pozitivních kontrol (DNA izolovaná ze zygomycetových kultur) identifikován druh microsporus (Obr. 3).

Obr. 3 – Normalizované HRM křivky získané metodou seminested real-time PCR specifické pro zygomycety – z archívu Centra molekulární biologie a genové terapie při IHOK LF MU a FN Brno

Pro potvrzení výsledku byl vzorek testován jednokolovou home-made real-time PCR specifickou pro R. microsporus. I v tomto případě byl výsledek pozitivní, ve vzorku bylo nalezeno zhruba 14 000 kopií/ml lavážní tekutiny. Den +44 byla provedena extraanatomická plicní resekce mykotického ložiska (Obr. 4). Taktéž ve vzorku plicní tkáně byl potvrzen R. microsporus pomocí HRM metody (Obr. 3) a specifické PCR pro R. microsporus. PCR diagnóza byla podpořena den +49 též histologicky s nálezem větvících se mykotických vláken morfologicky odpovídajících zygomykóze s patrnou angioinvazí, a poté i kultivačně.

Obr. 4 – Resekát plicního zygomykotického ložiska (nativ) – z archívu I. chirurgické kliniky LF MU a FN u sv. Anny v Brně

Po třech týdnech léčby lipidovým komplexem AMFO B došlo u pacientky k rapidnímu zhoršení renálních funkcí s těžkou iontovou dysbalancí a my jsme byli nuceni léčbu ukončit. Sekundární profylaxe zygomycetové infekce nebyla možná, jelikož na POSA byla daná zygomyceta in vitro rezistentní. Vzhledem k dosažení kompletní remise IZ i akutní leukémie jsme den +66 pokračovali 2. částí indukční CHT. Pacientka po 3 konsolidačních CHT žije dodnes v kompletní cytogenetické remisi hematoonkologického onemocnění.

Rinocerebrální forma invazívní zygomykózy

63letý muž s akutní myeloidní leukémií s multilineární dysplazií byl přijat na naši kliniku pro febrilní neutropenii v období dřeňového útlumu den +9 po reindukční CHT v režimu 5+2 (mitoxantron + cytosinarabinozid). I přes širokospektrou ATB léčbu (cefepim, amikacin) však febrilie pokračovaly a den +12 se u nemocného rozvinul otok levé tváře s bolestivou flegmónou sliznice tvrdého patra a vestibula v rozsahu 1. až 4. zubu v horní čelisti vlevo. Na panoramatickém rtg snímku horní čelisti byl patrný kolem kořenu 3. zubu v této oblasti jemný lem projasnění. CT PND prokázalo patologický nástěnný obsah v levé maxilární a frontální dutině a etmoidech s prosáknutím měkkých tkání levé poloviny obličeje (Obr. 5).

Obr. 5 – Invazívní zygomykóza v oblasti PND na CT – z archívu Radiologické kliniky LF MU a FN Brno

Empirickou léčbu jsme změnili na kombinaci meropenemu, vankomycinu, metronidazolu a konvenčního AMFO B. Stomatologové opakovaně prováděli sanaci flegmonózního ložiska s excizemi nekrotických tkáňových hmot a extrakcemi uvolněných zubů. Vzorky tkáně z afekce jsme odeslali na PCR, kultivační a histologické vyšetření, přičemž právě pomocí PCR byla nejdříve diagnostikována zygomyceta – Absidia corymbifera. ATM léčbu jsme tedy změnili na základě práce Burikové a kol. na cílenou POSA.(10) Zygomyceta byla následně potvrzena taktéž kultivačně a histologicky. V následujícím odstavci opět popisujeme metodiku naší PCR diagnostiky.

DNA jsme izolovali z části tkáně tvrdého patra o velikosti cca 1x 2 mm pomocí stejného kitu jako v předchozím případě, tkáň však byla v lyzačním roztoku ponechána přes noc. Pomocí HRM metody pro detekci zygomycet byla ve vzorku identifikována A. corymbifera (Obr. 3). Výsledek jsme potvrdili sekvenací.

Po reindukční CHT bylo dosaženo hraničně kritérií kompletní remise AML. Sourozenci nemocného dárcovství krvetvorných kmenových buněk odmítli, proto jsme pokračovali konsolidační CHT (cytosinarabinozid 100 mg/m2/ den 5 dní). Den +17 po konsolidační léčbě se objevily v období dřeňového útlumu i přes léčbu POSA znovu febrilie s recidivou otoku levé tváře, přičemž na CT byla prokázána progrese mykózy v dutině ústní a levostranných PND s destrukcí skeletu a rozvojem oronazální komunikace. Po konsolidační léčbě jsme zjistili relaps AML a další onkologickou léčbu jsme již neindikovali. Pacient záhy zemřel.

Diskuse

Možnost promptního zahájení komplexní léčby IZ má velký vliv na celkové přežití imunokompromitovaných nemocných, což dokazuje Chamilos a kol. V této práci bylo zahájení léčby polyeny ? 5 dní od diagnózy IZ asociováno s vyšší mírou přežití nemocných ve srovnání se zahájením po ? 6 dnech od diagnózy (83 % vs. 49 %).(13) Velkou nadějí pro významné zrychlení diagnostiky této invazívní mykózy by mohlo být použití molekulárněbiologických metod. Jedná se totiž o metody vysoce citlivé, specifické a časově i finančně nenáročné. K jejich významnějšímu rozvoji však dochází až v posledních několika letech.(14)

PCR diagnostika zygomykóz (podobně jako ostatních houbových infekcí) je velmi komplikovaná a v současné době stále neexistuje žádný referenční postup pro izolaci fungální DNA ani pro vlastní PCR detekci. Většina doposud publikovaných prací využívá kvalitativní detekce ve spojení se sekvenací PCR produktu,(15, 16) popř. rozlišením délky fragmentů po štěpení PCR produktu restrikčními endonukleázami (restriction fragment length polymorphism, RFLP).(17, 18) Pomalu se však začínají objevovat také nové real-time PCR metody, které se zdají být pro použití v rutinní diagnostice vhodnější, protože umožňují v klinických vzorcích zygomycety také kvantifikovat, což může hrát významnou roli v případném odlišení kolonizace (popř. kontaminace) od aktivní infekce.(8, 9, 19)

Zde prezentovaná metoda v sobě spojuje primery specifické pro zygomycety publikované dříve pro použití při kvalitativní detekci(12) a kvantitativní real-time PCR. Umožňuje tak dostatečně specifickou detekci i kvantifikaci více druhů zygomycet v jedné reakci s následným stanovením konkrétního druhu pomocí HRM analýzy. Může tedy významně přispět k rychlejšímu určení patogenkazuistikyního druhu v klinickém materiálu, a tedy časnějšímu zahájení cílené terapie.

Závěr

Invazívní zygomykóza je pro imunokompromitované pacienty život ohrožující infekcí a snižuje jejich celkové přežití. Úspěšnost komplexní léčby této závažné invazívní mykózy závisí na její rychlé diagnostice a možnosti promptního zahájení cílené ATM léčby. Vývoj a zdokonalování molekulárněbiologických metod představují velkou naději pro zpřesnění a urychlení diagnostiky IZ, což bylo potvrzeno v obou našich kazuistikách.

Podpořeno grantem IGA MZ ČR: NS10442-3/2009.

O autorovi: 1MUDr. Barbora Weinbergerová, 2Mgr. Kristýna Hrnčířová, 2Mgr. Martina Lengerová, Ph. D., 1MUDr. Zdeněk Ráčil, Ph. D., 3Mgr. Iva Kocmanová, 4MUDr. Šárka Bohatá, 5MUDr. Mojmír Moulis, 6MUDr. Václav Jedlička, Ph. D., 1prof. MUDr. Jiří Mayer, CSc.
1Masarykova univerzita, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Brno, Interní hematoonkologická klinika
2Masarykova univerzita, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Brno, Interní hematoonkologická klinika, Centrum molekulární biologie a genové terapie
3Fakultní nemocnice Brno, Oddělení klinické mikrobiologie
4Masarykova univerzita, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Brno, Radiologická klinika
5Masarykova univerzita, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Brno, Ústav patologie
6Masarykova univerzita, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice u sv. Anny, I. chirurgická klinika

e-mail: bweinbergerova@fnbrno.cz

Ohodnoťte tento článek!