Čipové technologie v genetickém testování

Molekulární biologie a genetika je v současnosti spojena s rychlým rozvojem technologií umožňujících rychlejší a obsáhlejší testování lidského genomu. K tomuto rozvoji bezpochyby přispěl Projekt lidského genomu, který vedl k nárůstu poznatků o sekvenci lidského genomu…

Mgr. Hana Bruchová, prof. MUDr. Radim Brdička, DrSc.

Ústav hematologie a krevní transfúze, Praha, Oddělení molekulární genetiky

Klíčová slova

typy biočipů • aplikace • výrobní technologie

Biočipy

Molekulární biologie a genetika je v současnosti spojena s rychlým rozvojem technologií umožňujících rychlejší a obsáhlejší testování lidského genomu. K tomuto rozvoji bezpochyby přispěl Projekt lidského genomu, který vedl k nárůstu poznatků o sekvenci lidského genomu. Je samozřejmé, že na dokončené sekvenační analýzy musí navazovat funkční testování nejen známých genů, ale i dalších DNA oblastí, u kterých není zatím známa funkce či uplatnění v biologických procesech (v signálních drahách). Dosavadní klasické metody molekulární biologie se zaměřují na studium malého počtu genů či lokusů. Avšak většina biologických a patologických procesů je velmi komplexní a jsou charakteristické vzájemnou interakcí většího počtu genetických faktorů, což standardními metodami nelze postihnout. Tyto vzájemné interakce budou hrát stále větší roli v porozumění celkového genetického (molekulárního) pozadí řady onemocnění a umožní hledání dalších terapeutických přístupů. A právě biočipové technologie usnadní řešení těchto otázek, neboť umožňují simultánní testování tisíce genů v rámci jednoho vzorku. Ačkoliv čipy jsou stále poměrně drahou záležitostí, rozšiřování biočipového trhu bude zcela jistě tento jejich hlavní nedostatek postupně odbourávat.

Termín čip je především spojován s výpočetní technikou a ve výkladovém slovníku je definován jako soubor integrovaných obvodů na jednom krystalu polovodiče. Při přenesení tohoto výrazu do molekulární biologie pod pojmem „biočip“ rozumíme uspořádání velkého počtu funkčních jednotek biologické povahy do jednoho celku (v angličtině se používá výstižný výraz „array“). Klasifikace biočipů není zatím příliš jednotná a závisí na přístupu autora. Na základě počtu pracovních jednotek a velikosti lze rozdělit biočipy na „makročipy“ (macroarrays) a „mikročipy“ (microarrays). Makročipy se obecně vyznačují nízkou hustotou nanesených sond a „relativně“ (ve srovnání například s podložním sklíčkem) velkými rozměry. Převážně jde o nylonové membrány, jejichž velikost se většinou pohybuje v desítkách centimetrů a nesou řádově stovky sond. Typickým příkladem mikročipů je klasické podložní sklíčko o velikosti 75x 25 mm, přičemž nanesená plocha je mnohem menší. Nejběžnější mikročipy nesou na svém povrchu tisíce až desetitisíce jednotek (1000–60 000). Podle možnosti ovladatelnosti jednotlivých pracovních ploch můžeme biočipy rozdělit na tzv. pasívní a aktivní. S pasívními biočipy lze pracovat pouze jako s jedním celkem (všechna pracovní místa jsou ovládána najednou a stejným způsobem), zatímco u aktivních čipů mohou jednotlivé jednotky fungovat samostatně, nezávisle na sobě(1). Další dělení čipů se může týkat nanášecích technik, kdy u mikrosetů jsou sondy syntetizovány mimo nosič a až následně jsou navázány na povrch. U čipů v pravém slova smyslu syntéza probíhá přímo v místě lokalizace sondy pomocí litografické metody(2).

Aplikace

Díky velké vazebné kapacitě a možnosti navazování různých biomolekul na povrch nosičů jsou biočipové techniky využívány v nejrůznějších odvětvích molekulární biologie. V molekulární genetice lze tyto metody použít pro genotypizaci neboli detekci mutací (mutovaná forma genu versus nemutovaná), SNP (single nucleotide polymorphism) a STR (short tandem repeat) polymorfismů, což nabízí řadu uplatnění (DNA diagnostika, populační screening, určování otcovství, forenzní genetika, HLA typizace, evoluční studie, mapování atd.). Obzvláště u nemocí s velkým počtem popsaných kauzálních mutací (např. cystická fibróza) představují biočipy velmi užitečnou metodiku umožňující záchyt i vzácných mutací, které nejsou rutinně testovány. Asi jednou z hlavních aplikací biočipů v molekulární biologii je sledování genové exprese. Testování transkripční aktivity genů v jednotlivých vývojových stadiích, odlišných tkáních, normálních a patologických stavech či modifikovaných in vitro podmínkách může vést k objasnění úlohy studovaných genů v daných procesech (experimenty jsou založeny na porovnání expresních profilů). Tato aplikace má uplatnění i v poměrně novém oboru, farmakogenomice, při studiu vlivu léku na jedince. Je velmi běžné, že pacienti se stejným onemocněním reagují na stejné dávky určitého léku zcela odlišně a analýzou jejich expresních profilů lze hledat geny, které tuto variabilitu způsobují (či další potenciální terapeutické cíle). Analogické využití se týká detekce genetických polymorfismů, které mohou, jak se v poslední době ukazuje, představovat důležité genetické determinanty pro citlivost na nejrůznější látky či faktory, které jsou nedílnou součástí našeho životního prostředí a mohou vést k rozvoji určitého onemocnění (genetická toxikologie). Biočipy lze využít i pro sekvenování, kdy jsou na čip naneseny všechny možné sekvence testovaného úseku DNA. Avšak tento způsob sekvenování je oproti běžně používaným technikám mnohem složitější, neboť zahrnuje syntézu všech sekvenčních variant. V neposlední řadě lze čipy použít i pro testování protein-protein (NK-protein) interakcí. Zvláště v současné době proteomika prožívá značný „boom“ a nabídka proteinových čipů se začíná rozrůstat. Dalším stupněm ve vývoji čipových technologií jsou první buněčné čipy, které umožňují rychlou charakterizaci analyzovaných buněk.

Zavedení čipových technik do laboratorní praxe přispělo ke značnému rozvoji oboru bioinformatiky, neboť tyto moderní přístupy poskytují nepřeberné množství informací, jejichž zpracování a interpretace představuje nejsložitější krok celé metodiky. Proto jsou výsledky týkající se jednotlivých aplikací shrnovány do databází, které nám mohou sloužit jako informační zdroje.

Výrobní strategie

Pokrok v oblasti biočipů dospěl do stadia, kdy již všechny informační makromolekuly (DNA, cDNA, RNA, proteiny) mohou sloužit jako sondy pro nanášení na čipové nosiče. Pro výrobu nosičů jsou nejčastěji používány nylonové membrány, plastikové a skleněné materiály. Hlavní předností plastikových a skleněných čipů je uniformní neporézní povrch, který umožňuje efektivní nanášení sond nejen co se počtu týče, ale i kvality (např. lepší morfologie bodů). Neporézní materiály minimalizují pozadí, a proto nevyžadují tak důkladné posthybridizační odmývání, jaké je nutné u nylonových membrán kvůli vyšší absorpční schopnosti. Taktéž manipulace s nimi je snadnější a je zde možnost automatizace. Na druhou stranu nylonové membrány mohou být používány opakovaně, což je činí finančně dostupnější.

U „klasických“ čipů existují dvě strategie pro přípravu oligonukleotidových sond. Jednou z možností je syntéza oligonukleotidů mimo nosič, na který jsou až následně kovalentně připojeny. Kovalentní připojení sond je zajištěno ošetřením povrchu nosičů látkou (např. poly-L-lysin, modifikovaný silan – aminosilan, epoxysilan atd., aminodextran a další), která poskytne reakční skupiny (-NH2, -OH, -C=O) pro navázání modifikovaných oligonukleotidů (nesoucích většinou aminové nebo thiolové skupiny). Oligonukleotidy mohou být navíc připojovány k modifikovanému nosiči prostřednictvím chemických spojek, tzv. linkerů (např. na bázi polyetylén glykolu), které mohou zvyšovat efektivitu hybridizace a přístup oligonukleotidů k enzymům(3). Pro indukci tvorby kovalentních vazeb lze také použít UV záření. Druhou strategii představuje fotolitografická metoda, kdy syntéza oligonukleotidů probíhá přímo na nosiči v místě lokalizace sondy („in situ“).

Existují tři „základní“ techniky pro nanášení sond na čipové nosiče. Nejběžněji jsou používány mechanické mikromanipulátory, které tisknou pre-syntetizované sondy na základě kontaktu s povrchem pomocí různých „jehel“, kapilár či pinzet. U fotolitografie spočívá nanášení sond v jejich syntéze přímo na nosiči. Tato metoda je založena na selektivním osvětlování a zastiňování pracovních jednotek pomocí speciální fotolitografické masky. V místě osvětlení dojde k fotoaktivaci substrátu (uvolnění funkční skupiny) a příslušný nukleotid se naváže pouze v tomto místě, neboť ostatní oblasti jsou zastíněny. Poslední technologie je obdobou inkous-tové tiskárny využívající piezoelektrický efekt. Kapalině v nanášecí trubičce je udělen náboj a změny náboje na jejím povrchu regulují tisk kapek bez kontaktu s nosičem(3).

Metodika

Podstatou většiny čipových technik je hybridizace studovaného vzorku k sondě na základě komplementarity. Detekce navázaných molekul pak závisí na způsobu jejich značení. U nukleových kyselin lze použít radioaktivní, fluorescenční či chemické značení (založené na detekci chemiluminiscence). Pro radioaktivní značení se nejčastěji používají radioizotopy fosforu (32P, 33P). Radioaktivní záření může být detekováno buď autoradiograficky (u čipů s nízkou hustotou nanesených sond), či pomocí přístrojů typu fosforimager. U fluorescenčního značení se především využívají cyaniové barvy, které jsou vysoce fluorescenční a rozpustné ve vodě. Nejvíce populární jsou barvy Cy3 a Cy5, mající odlišná, úzká emisní spektra, a proto jsou velmi vhodné pro duální fluorescenční značení. Při duálním značení jsou srovnávané vzorky označeny odlišnými fluorescenčními barvami a jsou současně hybridizovány na jeden čip. Detekce a analýza je pak prováděna na základě výsledné barvy signálů, proto je velmi důležitá volba vhodných barev (Obr. 1). Při jednoduchém fluorescenčním zna-čení jsou vzorky označeny stejnou barvou a hybridizovány na separátní biočipy. Pro detekci fluorescence je nezbytné vybavení laboratoře fluorescenčním skenerem (s dostatečnou rozlišovací schopností a kanály pro použité barvy). Je nutné si uvědomit, že zatímco radioaktivita je jev spontánní, fluorescence musí být indukována zářením o určité vlnové délce. Chemické značení s následnou detekcí chemiluminiscence zahrnuje inkorporaci biotinylovaných nukleotidů do řetězců testovaných molekul. Po hybridizaci se na biotin naváže streptavidin konjugovaný s enzymem (např. peroxidáza), který po přidání specifického substrátu katalyzuje chemickou reakci doprovázenou luminiscencí v místě hybridizace. Zatímco čipy pro genotypizaci nesou na svém povrchu DNA sondy, na expresní biočipy je nanášena cDNA (RNA). U proteinových čipů jsou sondy navazovány na nosiče na základě kovalentních nebo nekovalentních (např. hydrofobní, elektrostatické) interakcí.

Existuje řada modifikací čipových technologií, které umožňují studium specifických sekvencí. Pro určování mutací či SNP lze využít APEX (arrayed primer extension) metodu (Obr. 2A), kdy po hybridizaci cílové sekvence na sondu je použita DNA polymeráza, která prodlouží sondu podle DNA templátu pouze o jeden nukleotid, neboť jako substrát pro syntézu slouží dideoxynukleotidy (ddNTP)(každý typ ddNTP je označen jinou fluorescenční barvou). Po navázání dideoxynukleotidu již není možné další prodlužování řetězce, protože ddNTP nemají 3´OH skupinu, pak následuje denaturace a detekce typu ddNTP dle jeho barevného označení(4). V současnosti lze čipy použít už i pro detekci počtu repetic, jako jsou STR (short tandem repeat). Tato metoda využívá DNA ligázu, která je schopná připojit reportérský (fluorescenčně označený) oligonukleotid pouze při 100% komplementaritě v DNA duplexu. Po denaturaci je detekován signál pouze v místě sondy se stejným počtem repetic jako měla studovaná DNA (Obr. 2B)(3).

Příklady výrobců a jejich produktů

Širokou paletu expresních (cDNA) nylonových membrán s nízkou hustotou sond (100–1000) o délce 200–600b nabízí firma Clontech. Membrány jsou specializované pro určitý biologický proces (buněčný cyklus, apoptóza, onkogeneze, stres…) nebo obsahují geny s charakteristickou funkcí či vlastností (onkogeny/tumor supresorové geny, cytokiny/receptory…). Firma taktéž začala vyrábět skleněné mikročipy, avšak počet testovaných genů je poměrně malý (Atlas Human 7.6 Microarray-7600 genů, Human RNA Chip – 110 sond ). Zajímavým produktem tohoto výrobce je plastikový čip s 8300 sondami (Atlas Plastic 8K Microarray), u kterého byly zkombinovány hlavní přednosti nylonových membrán (opakované použití) a „sklíček“ (uniformní neporézní povrch), avšak je zde možné pouze radioaktivní značení cDNA(5). Pro sledování tkáňově-specifické exprese u nádorů je zde k dispozici několik membrán, jako např. Cancer Profiling Array obsahující 240 párů cDNA, přičemž každý pár reprezentuje gen odvozený z normální a nádorové tkáně konkrétního pacienta (Obr. 3)(5).

Dalším výrobcem expresních membránových biočipů je firma Research Genetics (Invitrogene Corporation). Pozitivně nabité nylonové membrány o velikosti 5 x 7 cm nesou okolo 5000 lidských genů (GeneFilter Releases I-IX)(6). Taktéž membrány pro testování myších a krysích genů jsou k dispozici. Pro tkáňově specifické testování firma nabízí skleněné mikročipy VastArrays obsahující až 100 různých tkání nanesených na parafilm, které jsou vhodné pro studium exprese proteinů a screening protilátek(6).

Předním výrobcem skleněných mikročipů je americká firma Affymetrix, která v roce 2000 zaujímala 40 % veškerého biočipového trhu(7). Tato firma nabízí několik čipů pro sledování genové exprese u člověka (HumanGenom U133Set, HumanGenom U95Array atd. zahrnující více než 30000 známých genů a řadu EST) a dalších modelových organismů (krysa – 24 000 sond, myš – 36 000 sond, Drosophila melanogaster –13 500 sond, Arabidopsis thaliana – 8200 sond, S. cerevisiae – 6400 sond, E. coli – 4200 sond)(8). Délka fragmentů je 25 nukleotidů a jsou nanášeny litograficky („in situ“). Pro genotypizaci jsou zde k dispozici čipy pro určování SNP (cca 1500 polymorfimů), mutací (včetně jednonukleotidových delecí) kódující oblasti genu p53 a 18 známých mutací genů CYP2D6 a CYP2C19 (izoenzymy cytochromu P450)(8).

Firma TeleChem vyvinula univerzální Next Generation Screening mikročipovou platformu umožňující detekci mutací, delecí, inzercí, SNP a virových sekvencí (tuberkulóza, HIV, antrax a další patogeny), která má všestranné využití (9).

Výrobou proteinových biočipů se zabývá například firma Ciphergen Biosystems používající speciální SELDI (Surface-Enhanced Laser Desorption/Ionization) detekční technologii, kterou si nechala patentovat. V tomto případě jsou sondy (protilátky, receptory, ale i DNA pro studium DNA-protein interakcí) nanášeny na hliníkové nosiče. Vazba proteinů může být realizována prostřednictvím hydrofobních vazeb (aminokyseliny, jako je alanin, valin, leucin atd.), dipól-dipól interakcí (hydrofilní aminokyseliny, jako je serin, threonin atd.) nebo na základě elekrostatických sil (negativně nabité aminokyseliny – kyselina asparágová a glutamová, pozitivně nabité aminokyseliny – lysin, histidin, arginin). Další možností je využití afinity některých peptidů ke kovům a v neposlední řadě kovalentní navázání přes reakční skupiny substrátů pokrývající povrch nosiče(10). Proteinové čipy jsou vhodné pro charakteristiku proteinů (mapování míst fosforylace, hledání nových ligandů a epitopů)(Obr. 4), studium exprese proteinů (hledání „biomarkerů“ specifických pro určité onemocnění) a taktéž mají své uplatnění i v toxikologii.

Doposud byly uvedeny příklady pouze „pasívních“ biočipů (reakční podmínky jsou pro celou plochu stejné), které na trhu převažují. Avšak další zajímavou a výkonnou technologii přestavují tzv. elektročipy, které lze řadit mezi „aktivní“ systémy (Obr. 5). Tento typ čipů pracuje na základě elektrických obvodů a využívá přirozených nábojů biologických molekul. Každé testované místo je spojeno s elektrodou a pohyb DNA, RNA či dalších molekul se děje na základě změn elektrického náboje a napětí, které mohou ovlivňovat reakční podmínky jednotlivých míst individuálně (např. koncentraci vzorku, dobu odmývání atd.). Další výhodou této technologie je možnost mnohonásobného použití. Jeden z prvních výrobců tohoto druhu čipů je firma Nanogen, která v současné době nabízí mikroelektročip o velikosti 0,7 cm2 s 99 testovacími místy. Povrch testovacích míst obsahuje streptavidin, na který se vážou biotinylované sondy (streptavidin má vysokou afinitu k biotinu)(11). Analyzovaná DNA putuje do testovacího místa na základě přitahování pozitivním nábojem, který je zde navozen. Po hybridizaci je polarita elektrického pole změněna a nenavázaná a nespecificky navázaná (slabá vazba) DNA je odmyta. Doposud je tento čip používán pro detekci SNP a STR, ale firma počítá s jeho využitím i pro sledování genové exprese a „on-chip“ amplifikace(11).

Dalším typem biočipů jsou tzv. průtokové (mikrofluidní) čipy, které jsou složeny z velkého počtu kanálků, na jejichž vnitřní straně jsou ukotveny sondy a testovaný vzorek skrz ně protéká. Citlivost této metody je velmi vysoká, a proto je vhodná i pro testování molekul zastoupených ve vzorku v malém počtu(2). Firmy nabízející tento typ biočipů jsou například Caliper, DiagnoSwiss, Micronit, Microlyne(7).

Zajímavý přístup pro výrobu mikročipů zvolila firma Luminex, která jako nosiče sond používá „kuličky“ (mikrosféry) z polystyrenu. Mikrosféry jsou interně fluorescenčně zbarveny na základě smíchání dvou fluorescenčních barev. Každá mikrosféra má tedy charakteristické zbarvení dané určitým poměrem použitých barev. Sondy (nukleové kyseliny, proteiny) jsou na modifikovaný povrch mikrosfér ukotveny kovalentně (přes karboxy-skupiny či prostřednictvím avidin-biotin interakce). Po hybridizaci vzorku na sondu je použita reportérská molekula označená další fluorescenční barvou (lišící se od barev použitých pro interní zbarvení mikrosfér), která se váže na testované molekuly (Obr. 6). Detekce probíhá laserovým snímáním fluorescence uvnitř (identifikace jednotlivých mikrosfér) a na povrchu (kvantifikace testovaných molekul) kuliček(12). Tento systém byl již použit jak pro genotypizaci(13, 14), tak i pro proteinové analýzy(15). Dále například firma Illumina nabízí tyto tzv. „kuličkové čipy“ (BeadArrays)(16).

Firma Cellomics se zabývá vývojem buněčných mikrofluidních čipů, které umožňují rychlou charakterizaci buněk a procesů v nich probíhajících (diferenciaci, morfologické změny, změny cytoskeletu, mezibuněčné interakce, chemotaxi, apoptózu, prostorové změny jako např. shlukování receptorů atd.)(17). Firma také nabízí systémy pro detailní sledování apoptózy (Multiparametr Apoptosis 1 assay – testované parametry: morfologie jádra, obsah f-aktinu, množství mitochondrií), buněčné viability (Cell Viability Assay – rychlá kvantifikace živých a mrtvých buněk) a toxických účinků různých látek na buněčné vlastnosti jako např. velikost a morfologie jádra, propustnost membrány, funkce lyzosomů atd. (Multiparametr Cytotoxity 1 Assay)(17).

Literatura

1. BRDIČKA, R. Biočipová revoluce v DNA laboratořích? Vesmír, 1998, 77, s. 447–449.

2. RAJSKÁ, G. Biočipy. Čas Lék Čes, 2000,139, č. 21, s. 647–651.

3. SCHEMA, M. DNA microarrays – a practical approach. New York : Oxford Univerzity Press, 2000.

4. TOSNISSON, N., KURG, A., KAASIK, K., et al. Unravelling genetic data by arrayed primer extension. Clin Chem Lab Med, 2000, 38, no. 2, p. 165–170.

5. http://www.clontech.com

6. http://www.resgen.com

7. PROVENCE, M. The European bioCHIP market. EuroBioChips, 2001, Mnichov 6-8.6., Německo.

8. http://www.affymetrix.com

9. http://www.arrayit.com

10. http://www.ciphergen.com

11. http://www.nanogen.com

12. http://www.luminexcorp.com

13. DUNBAR, SA., JACOBSON, JW. Application of the luminex LabMAP in rapid screening for mutations in the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene: A pilot study. Clin Chem, 2000, 46, 9, p. 1498–1500.

14. TAYLOR, JD., BRILEY, D., NGUYEN, Q., et al. Flow cytometric platform for high-throughput single nucleotide polymorphism analysis. Biotechniques, 2001, 30, no.3, p. 661–666, 668–669.

15. PRABHAKAR, U., EIRIKIS, E., DAVIS, HM. Simultaneous quantification of proinflammatory cytokines in human plasma using the LabMAP assay. J Immunol Methods, 2002, 260, no. 1–2, p. 207–218.

16. http://www.illumina.com

17. http://www.cellomics.com

e-mail: Hana.Bruchova@uhkt.cz

Ohodnoťte tento článek!