Dědičnost diabetes mellitus 1. typu

Titulní obrázek

Cílem tohoto článku je podat stručný přehled o nejdůležitějších genetických faktorech přispívajících k rozvoji diabetu 1. typu…

Klíčová slova

diabetes mellitus 1. typu • autoimunitní inzulitida • HLA molekuly • inzulínové gen

Cílem tohoto článku je podat stručný přehled o nejdůležitějších genetických faktorech přispívajících k rozvoji diabetu 1. typu.

Jak diabetes vzniká – co se děje s ostrůvky

Diabetes mellitus 1. typu (T1DM, dříve též inzulín dependentní diabetes mellitus, IDDM) vzniká následkem destrukce beta-buněk Langerhansových ostrůvků autoimunitním zánětem, inzulitidou.(1) Je charakterizován absolutním deficitem inzulínu, náhlou manifestací se závažnými symptomy, sklonem ke ketóze a celoživotní závislostí na exogenním inzulínu.

Diabetes je znak kvalitativní – buď jej pacient má, nebo nemá – ale autoimunitní inzulitida, která jej způsobila, je proces o mnoha tvářích, jehož uchopení a definování je podstatně komplikovanější. Autoimunitní inzulitida způsobující destrukci beta-buněk ostrůvků začíná zpravidla měsíce až léta před manifestací diabetu.

Není známo, co autoimunitní inzulitidu spouští – její iniciace je složitý proces, na němž mají podíl genetické vlivy i vlivy prostředí. Inzulitida postupně ničí beta-buňky a snižuje jejich celkovou masu. K manifestaci diabetu dochází pak v okamžiku, kdy zbývající beta-buňky nejsou schopny funkčně dostát nárokům organismu.

U dětí je to obvykle tehdy, když celková masa beta-buněk poklesne pod 10-15 % původního množství – ale tato kvantita se spíše traduje. Proces postupné destrukce beta-buněk lze sledovat imunologickými a funkčními testy -je doprovázen autoprotilátkami jako markery destrukce a v pozdějších stadiích je porušena též glukózová tolerance. Inzulitida je tkáňově specifický autoimunitní proces.

Jak je známo z myšího modelu (NOD, non-obese diabetic mouse, standardní animální model autoimunitního diabetu), tento proces je dokonce buněčně specifický: iniciální stadia inzulitidy ničí zejména beta-buňky, zatímco ostatní buněčné komponenty Langerhansových ostrůvků zůstávají zachovány – nejsou ničeny vůbec nebo až v pozdějších stadiích inzulitidy.

Ačkoli inzulitida je doprovázena autoprotilátkami proti četným složkám beta-buněk, není zatím k dispozici žádný důkaz o tom, že by se autoprotilátky chovaly destruktivně. Destrukce beta-buněk je způsobena útokem CD8-pozitivních cytotoxických T-lymfocytů, který je řízen CD4-pozitivními pomocnými (helper) T-lymfocyty(2), přičemž protilátková imunita a B-lymfocyty nejsou – alespoň u NOD myši – potřebné.

Je zřejmé, že Th1 způsobují intrainzulární destruktivní inzulitidu, zatímco Th2 mohou svým odlišným cytokinovým profilem destruktivní inzulitidu zpomalovat či blokovat. Mechanismem destrukce beta-buněk je patrně apoptóza, jakkoli je obtížné ji při pomalé a asynchronní progresi inzulitidy prokázat.

Jakmile byla zčásti známa podstata efektorových mechanismů destruktivní inzulitidy, mnoho studií se zaměřilo na identifikaci autoantigenu či spíše autoantigenů, proti kterým je namířena T-lymfocytární odpověď. Většina z nich se zaměřila na inzulín a jeho prekurzory, dále na enzym GAD (dekarboxylázu kyseliny glutamové), na protein IA-2 (ICA 512) a na fogrin (IA-2b).

Odhalení primárního autoantigenu by skýtalo možnosti zejména pro ustavení specifické tolerance a tím pro prevenci diabetu. Přes léta intenzívního výzkumu však není stále jasné, která molekula se může chovat jako prvotní autoantigen a inzulitidu spouštět.

I jinde v mozaice poznání o autoimunitní inzulitidě zejí podstatné mezery. Neví se, jaké všechny geny modifikují riziko vzniku inzulitidy – je odhalena jen asi polovina genetického rizika. Neví se, jaké vlivy prostředí mohou inzulitidu nastartovat a urychlovat, ani jaké ji mohou brzdit. Neexistují spolehlivé testy ke kvantifikaci inzulitidy a na její přítomnost u pacienta lze usuzovat pouze z autoprotilátkových markerů.

Pokud je testována buněčná reaktivita proti vybraným autoantigenům, je nutné se spolehnout na testování lymfocytů, které cirkulují v periferii, protože lymfocyty přímo v ničeném ostrůvku nám nejsou přístupné. Je logické, že autoreaktivní lymfocyty jsou v periferní krvi vzácné a jejich repertoár může být podstatně odlišný od repertoáru přímo v místě ničeného ostrůvku.

Dlouhodobá sledování hladin autoprotilátek ukázala, že mnozí z jejich nositelů se jich zase spontánně zbaví – patrně se tedy zbaví i své inzulitidy. Co se s autoreaktivními klony stane, není známo – buď dojde k jejich deleci, nebo je dosaženo jakési rovnováhy, kdy jsou zadržovány regulačními mechanismy imunity.

Jak je diabetes dědičný

Diabetes mellitus 1. typu je typicky multifaktoriální, polygenní choroba. Multifaktoriální proto, že v patogenezi se setkávají jak genetické, tak negenetické vlivy, které spolu složitým a dosud ne zcela jasným způsobem interagují. Polygenní je proto, že na vnímavosti (míře rizika) se podílí okolo osmnácti poznaných genů či genových komplexů a bezpochyby i další geny dosud neodhalené.

Dědičnost predispozic k T1DM je nezpochybnitelná: konkordance mezi jednovaječnými dvojčaty se pohybuje v různých studiích od 23 % do 53 %(3, 4), zatímco u dizygotních dvojčat je to od 2,5 % do 11 %. Míra hromadění v rodinách (familální clustering) je poměr mezi rizikem rekurence choroby u sourozence dítěte s chorobou a kumulativní incidencí choroby v obecné populaci. Poměr závisí na incidenci choroby a na její heritabilitě.

Míra familiálního clusteringu je tedy dobrým indikátorem toho, do jaké míry jde variabilita mezi fenotypem jedinců na vrub jejich genotypu. Pro sourozence diabetických pacientů ( λs) v americké populaci je to 15: poměr mezi rizikem rekurence sourozenců (6 %) a kumulativní incidence T1DM v populaci (0,4 %).

Hodnota λs je populačně-specifická, protože populačně-specifická je i heritabilita a kumulativní incidence: u nás je riziko rekurence u sourozenců zhruba 2,5 %(5) a kumulativní incidence do 15 let věku je 0,1 %, takže bodový odhad λs je 25. Genetické riziko u příbuzných diabetického probanda souvisí s počtem alel sdílených s tímto probandem: nejvyšší riziko mají monozygotní dvojčata (sdílející vždy 100 % alel), nižší je pozorováno u dětí probanda (50 % alel) nebo u sourozenců probanda (průměrně 50 % alel).

S rostoucí vzdáleností diabetického probanda v rodokmenu strmě klesá i riziko diabetu. Na základě pozorování rizik byl navržen model, kde diabetes je vázán na jeden hlavní lokus s několika lokusy menšího významu, které působí epistaticky.(6)

HLA určuje okolo poloviny rizika T1DM

Hlavní histokompatibilní komplex (MHC, major histocompatibility complex; u lidí HLA, human leukocyte antigens) byl nejprve popsán jako soubor genů, jejichž produkty jsou klíčové pro histokompatibilitu, tedy schopnost transplantátu přihojit se v organismu jiného jedince. Později se termín rozšířil a nyní označuje celou genovou oblast, včetně genů s imunitou spjatých pouze vzdáleně nebo vůbec ne.

Struktura klasických HLA molekul

Klasické HLA molekuly (tedy ty, co prezentují antigen) jsou specializované receptory na buněčných membránách, které váží fragmenty peptidových antigenů a prezentují je T-lymfocytům. Ty je pak rozpoznávají pomocí svých TCR receptorů. Z hlediska funkce, výskytu a syntézy se molekuly HLA dělí na dvě třídy, první a druhou.

HLA molekuly I. třídy se skládají z α-řetězce zakotveného v buněčné membráně a z nekovalentně vázaného β2-mikroglobulinu, který v buněčné membráně zakotven není. HLA molekuly II. třídy se skládají z nekovalentně vázaných řetězců α a β, obou zakotvených v buněčné membráně a majících dvě extracelulární domény. Domény α1 a β1 spolu tvoří vazebné místo pro antigen. Struktura molekuly II. třídy je schematicky znázorněna na Obr. 1.

Krystalografické studie ukázaly, že struktura vazebného místa se dá přirovnat ke žlábku ze dvou α-helixů po stranách a osmi pruhů β-skládaného listu tvořících dno. Tato struktura je tvořena 1 a 2 doménou u HLA I. třídy, nebo 1 a 1 doménami u HLA II. třídy. Po stranách žlábku nebo na jeho dně je také většina aminokyselin, jimiž se jednotlivé alely HLA řetězců liší – to má přímé funkční důsledky pro míru afinity dané HLA molekuly k různým antigenům.

Vzhledem k tomu, že rozdílné alelické formy téhož řetězce se liší ve spektru peptidů, které s dostatečnou afinitou vážou, množina fragmentů prezentovaných po rozštěpení téhož proteinu se může podstatně lišit mezi HLA neidentickými jedinci.

Obr. 1 – Schematický nákres struktury HLA molekuly II. třídy. Jsou zachyceny domény molekuly společně s úseky odpovídajícími jednotlivým exonům (odděleny šipkami).

Funkce HLA molekul

Jakkoli je funkce HLA molekul v histokompatibilitě nejdůležitější z klinického hlediska, je to pouze vedlejší důsledek jejich primární funkce – prezentace antigenu. Molekuly HLA I. třídy prezentují peptidy zejména intracelulárního původu, a to CD8 (cytotoxickým) T-lymfocytům. Asociace HLA I. třídy s T1DM je omezená a často zpochybňovaná, a proto se jí dále zabývat nebudeme.

Molekuly HLA II. třídy prezentují peptidy CD4-pozitivním T-lymfocytům. Prezentují peptidy, které se dostaly do endocytických váčků buňky pomocí fagocytózy, receptory zprostředkované endocytózy či nespecificky pinocytózou; jedná se tedy o proteiny původu extracelulárního a membránového.

HLA II. třídy jsou konstitutivně exprimovány pouze na profesionálních antigen prezentujících buňkách, tedy na makrofázích, dendritických buňkách a B-lymfocytech; jejich exprese může však být indukována i na jiných buňkách, jako jsou např. aktivované T-lymfocyty. Exprese HLA-DR molekuly je obecně asi o řád vyšší než HLA-DQ, která má zase o řád vyšší expresi než HLA-DP.

Molekulární genetika HLA

Oblast kódující HLA molekuly se nachází na krátkém raménku 6. chromosomu (6p21.3). Definice jejího rozsahu není dodnes ujednocena: „klasicky“ udávaný rozsah je přibližně 3,6 Mbp, což je něco přes 1 % lidského genomu. Asi 40 % genů nalezených v této velmi hustě zaplněné oblasti má vztah k imunitnímu systému, zejména k prezentaci antigenů. Evolučně se toto nahromadění jeví účelně a není pravděpodobné, že by bylo náhodné.

Komplex HLA je rozdělen do 3 částí. HLA I. třídy (zejména geny HLA-A, -B a -C) leží telomericky, HLA II. třídy (HLA-DR, -DQ a -DP) na centromerickém konci komplexu a mezi nimi leží soubor genů různé funkce nepřesně shrnovaných pod pojem HLA III. třídy. Velmi zjednodušené schéma polohy vybraných genů v HLA II. třídy uvádí Obr. 2.

Obr. 2 – Organizace vybraných genů v oblasti MHC II. třídy. Fyzická vzdálenost genů je přibližně proporcionální, délka kódujících oblastí genů však neodpovídá skutečnosti. Na obrázku jsou zachyceny geny kódující jednotlivé molekuly HLA 2. třídy (červené obdélníčky), pseudogeny jim podobné (žluté obdélníčky) a geny TAP a LMP (modré obdélníčky).

HLA I. třídy obsahuje geny kódující α-řetězce klasických HLA-A, -B a -C i neklasických HLA-E, -F a -G (β2-mikroglobulin je kódován mimo HLA, nepolymorfním genem na 15. chromosomu). Mimo to obsahuje několik desítek dalších genů, z nichž velká část dosud není charakterizována.

HLA II. třídy obsahuje geny kódující α- i β-řetězce molekul HLA-DR, -DQ a -DP, z nichž geny pro HLA molekuly DQ a DR jsou zásadní pro výši rizika T1DM.

Geny pro příslušné α-řetězce jsou umístěny v bezprostřední blízkosti svých odpovídajících genů pro β-řetězce. Všechny tři molekuly mají jen jeden gen pro α-řetězec, v případě DP a DQ polymorfní, v případě DR bez signifikantního polymorfismu; β-řetězec je vždy polymorfní.

Gen pro β-řetězec je v případě DQ a DP jeden, v případě DRB je počet genů pro β-řetězec závislý na haplotypu: DRB1 je přítomen vždy, u některých haplotypů je přítomen i gen druhý (DRB3, DRB4 nebo DRB5), kódující další druh β-řetězce, jenž je na povrchu buněk také přítomen, ale zpravidla v nižším množství než genový produkt DRB1.

V oblasti mezi DMB a DQB1 se nalézají čtyři geny mající úzkou souvislost s přípravou antigenu pro prezentaci: TAP1 a TAP2 (transporter associated with antigen processing), LMP2 a LMP7 (low molecular weight proteasome). Geny TAP2, LMP2 a LMP7 jsou polymorfní (takže by teoreticky jejich polymorfismy mohly ovlivňovat repertoár peptidů prezentovaných na HLA), avšak asociace těchto polymorfismů s T1DM je pouze sekundární, díky vazebné nerovnováze s HLA II. třídy. (7, 8)

HLA III. třídy je rozsáhlá genová oblast ležící mezi HLA I. a II. třídy. Obsahuje geny, které mají imunologickou funkci, ale nepodílejí se na prezentaci antigenu (složkykomplementu C2, C4, faktor B), geny pro TNF (tumor necrosis factor), pro heat shock protein HSP 70. V oblasti jsou i další geny bez funkce v imunitním systému (CYP21, nadledvinová steroid 21-hydroxyláza) a podstatný počet pseudogenů i genů, kter é sice jsou exprimovány, ale není známa jejich funkce.

Polymorfismus genů HLA

Polymorfismus je takový druh alelické sekvenční variace, kdy se alespoň jedna sekvenční varianta vyskytuje s populační prevalencí vyšší než 1 %. HLA systém je nejpolymorfnější známou oblastí lidského genomu: v červenci 2005 bylo známo ve II. třídě HLA 413 různých alel HLA-DRB1, 28 HLA-DQA1, 66 HLA-DQB1, 23 HLA-DPA1 a 119 HLA-DPB1 alel (http://www.anthonynolan.com/HIG/).

V jednotlivé populaci se nevyskytují všechny tyto alely, kupř. pro lokus DRB1 bývá přítomno 20-30 různých alel. Přesto je míra polymorfismu mimořádná a má dalekosáhlé praktické důsledky pro transplantační medicínu, epidemiologii, antropologii a soudní lékařství.

Mimo popisované mnohotné alelie (vysokého počtu alel genu) je polymorfismus HLA charakteristický ještě dalšími jedinečnými rysy. Jedním z nich je neobvykle vysoká genetická vzdálenost mezi jednotlivými alelami HLA genů. Alely se zřídka liší jen v jednom nukleotidu, naopak nejčastější počet substitucí mezi dvěma náhodně vybranými alelami je 10-20.

Rozdělení polymorfismů uvnitř HLA genu navíc není rovnoměrné: polymorfismy se z největší části vyskytují v oblasti vážící antigen (tj. kódované 2. a 3. exonem α-řetězce u HLA I. třídy a 2. exonem α- či β-řetězce HLA II. třídy), kde jsou tzv. kapsy – v nich interagují postranní aminokyselinové řetězce antigenu s řetězcem HLA. Vzájemná kompatibilita rozhoduje o síle vazby. Polymorfismy tedy rozhodují o repertoáru peptidů prezentovaných na jednotlivých alelických formách HLA.

Po alelických polymorfismech na DNA úrovni je dalším potenciálním zdrojem různosti molekul HLA II. třídy kombinace α- a β-řetězců z odlišných haplotypů na peptidové úrovni – tedy při sestavování HLA molekuly. Alely HLA nesené spolu na tomtéž chromosomu (v haplotypu) kódují vždy řetězce schopné spolu vytvořit stabilní α – β dimer.

Mimo této cis kompletace řetězců je v některých případech stabilní i trans kompletace α-řetězce z jednoho s β-řetězcem z druhého chromosomu. Některé z takto vytvořených heterodimerů α – β jsou však nestabilní (tzv. nepermisivní kombinace), a proto jsou exprimovány výrazně méně než molekuly kódované cis kombinací. Teoreticky je dalším možným zdrojem diverzity HLA molekul II. třídy kombinace α- a β-řetězců různých genů (tj. např. DQ α1-DP 1), avšak ta se nezdá být funkčně významnou.

Poznatky o HLA asociaci T1DM

První údaje o asociaci některých antigenů HLA s „juvenilním“ diabetem byly publikovány před více než čtvrtstoletím. Tehdy několik studií ukázalo, že HLA-B15 a B8 jsou pozitivně asociovány s T1DM, kdežto B7 vykazuje negativní asociaci.(9-12) Tato asociace se později ukázala jako sekundární, přítomná díky vazebné nerovnováze s haplotypy HLA II. třídy DRB1 *04-DQB1*0302 a DRB1*03-DQB1*02.

Odhalení primárního etiologického faktoru v oblasti DRB1-DQA1-DQB1 bylo však velmi problematické vzhledem k silné vazebné nerovnováze, která v oblasti panuje. Vzdálenost mezi DQB1 a DQA1 je 12 kb, mezi DQB1 a DRB1 pak 175 kb, takže tyto geny tvoří vazebnou skupinu chovající se jako evoluční jednotka. Dnes přítomné haplotypy jsou výsledkem fixací náhodného repertoáru haplotypů během evoluce, tak jak probíhaly expanze, migrace a zakládání nových populací.(13)

K rozlišení primárních a sekundárních faktorů rizika T1DM v HLA II. třídy bylo tedy nutné podrobit analýze data z mnoha etnicky rozdílných populací. Ty alely, které vykazují konzistentně pozitivní asociaci v etnicky různých populacích (tj. i když jsou neseny na různých haplotypech), jsou etiologickými činiteli, kdežto alely, jejichž efekt mizí nebo se liší mezi populacemi, jsou asociovány pouze sekundárně díky vazebné nerovnováze.

Dnes je široce přijímán názor, že riziko diabetu je primárně určeno genotypem HLA-DQB1, -DQA1 s přispěním subtypů DRB1*04, pokud je alela DRB1*04 přítomna. V tomto smyslu shrnují dostupné poznatky i dva mezinárodní HLA workshopy.(14, 15)

V oblasti DQB1 jsou významnými rizikovými faktory především alely DQB1 *0302 (zejména v severských populacích) a DQB1*02 (zejména v jižních populacích). První hypotéza o možných příčinách rizikovosti nebo protektivity se zaměřila na oblast 57. aminokyseliny DQB1 řetězce. Zatímco protektivní molekuly nesou aspartát, rizikové nesou jinou aminokyselinu.(16, 17)

Ačkoli aminokyselina na 57. pozici je zásadní pro vazbu peptidu a jeho prezentaci(18), byla teorie dalšími poznatky vyvrácena: jednak proti ní mluví výsledky mezirasových studií (japonští pacienti mají zvýšenou frekvenci alel, které nesou 57Asp(19)), stejně jako existence četných 57Asp pozitivních pacientů v kavkazských populacích.(20) Do teorie nezapadají ani některé genotypy, které přes homozygozitu 57nonAsp/57nonAsp přinášejí velmi nízké riziko diabetu (DQB1 *0302/DQB1*02-DQA1*02, DQB1*02DQA1*02/DQB1*02-DQA1*02 a další).

Další studie ukazují jiný možný mechanismus rizika přinášeného HLA-DQ: riziko je přinášeno některými cis nebo trans kódovanými heterodimery HLA-DQ / , α/β přičemž jejich efekt nelze jednoduše vysvětlit přítomností či absencí jednotlivé aminokyseliny v daném řetězci.(21, 22) Po 11. HLA workshopu je akceptováno, že rizikovost nebo protektivita je přinášena celým heterodimerem DQ.(14) Silným protektivním faktorem v oblasti DQB1 je alela DQB1*0602. Tato alela je nesena v kavkazské populaci na haplotypu DQB1*0602-DQA1*0103-DRB1* 1501 (DR2).

Alela DQB1*0602 je jediná z alel běžných DR2 haplotypů, která je přítomna na silně protektivních haplotypech konzistentně v populacích kavkazských, asijských, afrických i mexických(15), což dokazuje její primární roli. Protektivita DQB1*0602 se jeví dominantní nad vlivem ostatních molekul a chrání před destruktivním průběhem inzulitidy: osoby s DQB1*0602 mohou mít autoprotilátky proti GAD65, ale tyto protilátky u nich mohou přetrvávat mnoho let, aniž by značily destrukci β-buněk.

DQA1 je stejně jako DQB1 primární faktor, ačkoli to není z analýz kavkazských populací ihned zřejmé. Jeden z důkazů může být mezirasové srovnání afro-karibské populace, kde DRB1*07-DQB1* 02 haplotyp přináší riziko T1DM, zatímco tento haplotyp nepřináší riziko u kavkazské rasy. Rozdíl mezi těmito dvěma haplotypy je právě v DQA1 alele: v afrokaribské populaci je to DQA1*0301, kdežto v kavkazské je to DQA1*02.

Efekt molekuly DQ je modifikován subtypem alely DRB1*04 nesené na DQB1 *0302-DQA1*03-DRB1*04 haplotypu. Různé subtypy DRB1*04 jsou asociovány s rizikem, které se navzájem zásadně liší. DRB1*0403 a DRB1*0406 jsou známy jako silně protektivní faktory (např. proto DQB1*0302 není v Japonsku rizikové: většina Japonců nesoucích DQB1*0302 nese též DRB1*0403 nebo *0406(23)), DRB1*0404 je neutrální a riziko stoupá v řadě DRB1*0402 – DRB1*0401 – DRB1* 0405.(24-27)

Neexistuje žádná aminokyselina v řetězci DRB1, která by výše uvedený fenomén vysvětlila, efekt je patrně výsledkem vzájemné kombinace aminokyselin v pozicích 37, 57, 71, 74 a 86. Rizikovost či protektivita některých z těchto alel není univerzální ani v rámci kavkazské rasy: v Evropě existují velké rozdíly v rozložení DRB1*04 subtypů jak v obecné, tak v diabetické populaci, a to i mezi sousedními národy.

Míra genetického rizika se odráží nejen v tom, zda jedinec diabetem onemocní, ale i v době manifestace diabetu. T1DM je v tomto ohledu klinicky heterogenní onemocnění. Je známo, že mezi pacienty manifestujícími se v raném dětství je více některých rizikových alel, haplotypů či genotypů než u pacientů manifestujících se později nebo v dospělosti.(15) Ani protektivní efekt alely DQB1*0602 není u pacientů manifestujících se v dospělosti tolik patrný.(28)

Na genetickém riziku T1DM se podílejí i geny uvnitř HLA, ale mimo oblast DQ a DR. Riziko modifikují zejména některé alely HLA-B(25), a dále geny vázané s mikrosatelity v oblasti HLA III. třídy(29, 30), i telomericky od HLA I. třídy.(31) Význam těchto nálezů zatím není zcela objasněn. Genetická asociace T1DM v české dětské populaci nevykazuje nijak zásadní odchylky od běžné situace jinde ve střední Evropě. Míru rizika asociovanou s jednotlivými alelami ukazuje Tab. 1.

T1DM a non-HLA geny

HLA (neboli gen IDDM1) dokáže vysvětlit cca 50 % nahromadění případů diabetu v rodinách.(33) Ačkoli bylo navrženo velké množství kandidátních genů s funkcí v imunitní odpovědi nebo v beta-buňce, pro žádný – mimo inzulínového genu -se nepodařilo dostatečně přesvědčivě prokázat jasnou roli konkrétního polymorfismu v etiologii T1DM a část z těchto studií nebyla ani publikována. Asociační studie jednotlivých genů tedy patrně nejsou schůdnou cestou k nalezení dalších genů modifikujících riziko T1DM.

V budoucnu, kdy znalost jednonukleotidových polymorfismů lidského genomu společně s vysokokapacitními čipovými technologiemi umožní skenování genomu na asociaci, bude možno odhalit s vysokou citlivostí i zbývající polymorfismy genů pozitivně nebo negativně asociovaných s diabetem.

V současné době je však jedinou možnou cestou skenování genomu hledáním vazby pomocí souborů párů diabetických sourozenců. V lidském genomu bylo takto nalezeno celkem cca 16 oblastí s možnou vazbou s T1DM (Tab. 2), ale u většiny z nich nedosahuje statistická signifikance hodnot odpovídajících signifikanci v celém genomu.(33-40)

Veliké množství odlišných lokusů odráží hlavní problém studií vazby: nedostatečná statistická síla menších studií má za následek množství navzájem zcela diskordantních výsledků. Například dvě rozsáhlé studie založené na analýze sourozeneckých párů s diabetem(39, 40), se neshodly na jediném lokusu mimo IDDM1. V pět let staré studii zahrnující 767 rodin s více než jedním diabetickým dítětem(38) byly nalezeny tři oblasti genomu se signifikantní vazbou s T1DM (LOD score > 4): 6p21 (IDDM1), 11p15 (IDDM2), 16q22-q24.

Čtyři další vykazovaly velmi pravděpodobnou vazbu (LOD score > 2,2): 10p11 (IDDM10), 2q31 (IDDM7, IDDM12, IDDM13), 6q21 (IDDM15) a 1q42. Úspěch hledání nových genů se vztahem k riziku T1DM je nejvíce závislý na velikosti souboru. Kombinace dat z různých studií je velmi komplikovaná, až nemožná. Efektivním přístupem je získat co největší vzorek z co nejvíce různých populací a otestovat jej jednou metodikou, jedním setem markerů.

K naplnění tohoto cíle bylo nedávno ustaveno genetické konsorcium (Type 1 diabetes genetic consortium, www.t1dgc.org). Konsorcium se snaží shromáždit co nejvíce vzorků od sourozeneckých párů s T1DM (dospělých i dětských). Pokud ve vaší ordinaci takové jsou, autor tohoto článku bude vděčný za upozornění. Za první dva roky práce jsme identifikovali a odebrali 44 takových rodin, přičemž recentní epidemiologické šetření ukazuje, že v naší zemi jich bude nejméně cca dvojnásobek.(5)

Logickým pokračováním po nalezení oblasti s vazbou je zpřesnění této oblasti – to se však nedá docílit za určitou mez, protože se nejedná o mendelovsky dědičnou chorobu. Následuje mapování pomocí vazbové nerovnováhy (asociace), lokalizace etiologického genu nebo genů a hledání etiologických polymorfismů uvnitř či blízko těchto genů, jak bylo již učiněno pro inzulínový gen a částečně též pro gen CTLA4.

Inzulínový gen

Podrobně se inzulínovému genu a jeho asociaci s T1DM v české i v jiných populacích věnujeme v jednom z předchozích článků naší skupiny.(32) Inzulínový gen je druhý gen, pro nějž byla asociace s T1DM identifikována. Má několik polymorfismů vně své kódující sekvence -po sérii studií, které vynaložily velké úsilí na mapování toho kauzálního z nich(41-44), se ukázalo, že kauzálním je variabilní počet tandemových opakování v promotoru. Ten ovlivňuje výši transkripce genu, a to nejen v beta-buňce, ale i v thymu.

Tím mění pravděpodobnost úspěšného ustavení centrální tolerance vůči inzulínu, a tak zvyšuje nebo snižuje riziko diabetu. Protektivní varianta inzulínového genu se chová dominantně nad alternativní variantou rizikovou. Přítomnost protektivní varianty přináší v naší populaci asi třikrát nižší riziko T1DM proti její nepřítomnosti (OR=0,34; 95%CI 0,240,48)(32) a obdobně se chová i v četných jiných populacích. Síla jeho asociace se dá srovnat se slaběji asociovanými HLA alelami (Tab. 1). Je tedy vhodné vyšetřování polymorfismu inzulínového genu zahrnovat do odhadů genetického rizika při predikci diabetu.

CTLA4

Molekula CTLA4 je povrchová molekula T-lymfocytů vysoce homologní s CD28. Funguje jako důležitý negativní regulátor imunitní odpovědi. Je exprimována zejména na aktivovaných T-lymfocytech. Stejně jako CD28 se váže na molekuly B7.1 (CD80) a B7.2 (CD86) antigen prezentující buňky, ale na rozdíl od CD28 suprimuje odpověď T-lymfocytů indukcí apoptózy. Geneticky upravené myši, kterým CTLA4 chybí, hynou na polyklonální aktivaci T-lymfoblastů.

Molekula CTLA4 je kódována genem na dlouhém raménku druhého chromosomu (2q33), pro jehož oblast byla prokázána asociace s T1DM (oblast IDDM12). V oblasti se nalézají dva kandidátní geny, kódující CTLA4 a CD28 molekuly. V oblasti jsou tři polymorfismy asociované v některých populacích s T1DM: +49*A/G polymorfismus v prvém exonu CTLA4, mikrosatelitový (AT)n repeat v 3'-netranslatované oblasti genu a epidemiologicky málo prozkoumaný dimorfismus -318 C/T.(45)

Polymorfismus +49*A/G je v různých populacích nejčastěji testován na asociaci s T1DM, následován testy (AT)n mikrosatelitu. Oba jsou však velmi pravděpodobně pouhými markery: závažným příspěvkem k diskusi o etiologickém polymorfismu uvnitř CTLA4 oblasti je práce na obrovském vzorku 3600 rodin, kterou Ueda et al. mapovali etiologickou variantu do 6,1 kbp nekódující oblasti genu.(46)

Rozsáhlá metaanalýza publikovaných studií asociace variant CTLA4 s T1DM ukázala, že alela +49*G je signifikantně s T1DM asociovaná (OR=1,45, 95%CI 1,28-1,65)(47), ale mezi studiemi je podstatná heterogenita též nepřímo dokládající, že alela je pouhým markerem. V naší populaci není s T1DM asociován ani tento marker.(48)

Co čekat od genetiky T1DM

Z praktického hlediska se nedá očekávat v genetice T1DM žádná revoluce. Tato choroba je totiž z multifaktoriálních chorob prozkoumána nejlépe a již dnes víme, že nikde v genomu se nemůže skrývat žádný gen podobně silně asociovaný s T1DM, jako je komplex HLA. Očekávat můžeme podstatný pokrok v mapování IDDM lokusů – jednak uvidíme pokrok po dokončení práce genetického konsorcia, jednak můžeme v nejbližších letech čekat počátky celogenomového mapování pomocí vazbové nerovnováhy.

Zatím to není možné – bylo by třeba typizovat tak vysoké počty jednonukleotidových polymorfismů, že ani čipové techniky na to zatím nestačí. Identifikace dalších genů asociovaných s T1DM patrně nijak překotně nezlepší naši schopnost predikovat T1DM. Co se od odhalení dalších genů dá tedy čekat? Je to především jejich funkce, která nám objasní další cesty patogeneze autoimunitní inzulitidy. Není vyloučeno, že na některé z těchto cest bude možné i zasáhnout efektivní preventivní strategií.

MUDr. Ondřej Cinek, Ph. D.

e-mail: Ondrej.Cinek@Lfmotol.cuni.cz

Univerzita Karlova v Praze, 2. LF, Pediatrická klinika, Laboratoř molekulární genetiky

www.Lmg.cz

*

Literatura

1. ATKINSON, MA., EISENBARTH, GS. Type 1 diabetes: new perspectives on disease pathogenesis and treatment. Lancet, 2001, 358, p. 221-229.

2. WANG, Y., et al. The role of CD4+ and CD8+ T cells in the destruction of islet grafts by spontaneously diabetic mice. Proc Natl Acad Sci U. S. A., 1991, 88, p. 527-531.

3. KYVIK, KO., GREEN, A., BECK-NIELSEN, H. Concordance rates of insulin dependent diabetes mellitus: a population based study of young Danish twins. BMJ, 1995, 311, p. 913-917.

4. KAPRIO, J., et al. Concordance for type 1 (insulin-dependent) and type 2 (non-insulin-dependent) diabetes mellitus in a population-based cohort of twins in Finland. Diabetologia, 1992, 35, p. 1060-1067.

5. MALCOVA, H., et al. Type I diabetes mellitus and associated autoimmune diseases in the first-degree relatives of diabetic children: questionnaire based study. Cas Lek Cesk, 2004, 143, p. 625-629.

6. RISCH, SS. Mapping genes in diabetes. Diabetes, 1990, 39, p. 1315-1319.

7. UNDLIEN, DE., et al. No independent associations of LMP2 and LMP7 polymorphisms with susceptibility to develop IDDM. Diabetes, 1997, 46, p. 307312.

8. RONNINGEN, KS., et al. Linkage disequilibrium between TAP2 variants and HLA class II alleles; no primary association between TAP2 variants and insulindependent diabetes mellitus. Eur J Immunol, 1993, 23, p. 1050-1056.

9. SINGAL, DP., BLAJCHMAN, MA. Histocompatibility (HL-A) antigens, lymphocytotoxic antibodies and tissue antibodies in patients with diabetes mellitus. Diabetes, 1973, 22, p. 429-432.

10. NERUP, J., et al. HL-A antigens and diabetes mellitus. Lancet, 1974, 2, p. 864-866.

11. CUDWORTH, AG., WOODROW, JC. Evidence for HL-A-linked genes in „juvenile“ diabetes mellitus. Br Med J, 1975, 3, p. 133-135.

12. CUDWORTH, AG., WOODROW, JC. HL-A system and diabetes mellitus. Diabetes, 1975, 24, p. 345349.

13. AYALA, FJ. The myth of Eve: molecular biology and human origins. Science, 1995, 270, p. 1930-1936.

14. RONNINGEN, K., et al. HLA class II associations in insulin-dependent diabetes mellitus among black, Caucasoids and Japanese. In TSUJI, K., AIZAWA, H., SASAZUKI, T. (Eds), Proceedings of the Eleventh International Histocompatibility Workshop and Conference. 1993, Oxford : Oxford University Press, p. 713722.

15. CAILLAT-ZUCKMAN, S., et al. Insulin dependent diabetes mellitus (IDDM): 12th International Histocompatibility Workshop study. In 12th International HLA workshop. 1997: EDK, Sevres, Paris.

16. TODD, JA., BELL, JI., McDEVITT, HO. HLA-DQ beta gene contributes to susceptibility and resistance to insulin-dependent diabetes mellitus. Nature, 1987, 329, p. 599-604.

17. MOREL, PA., et al. Aspartic acid at position 57 of the HLA-DQ beta chain protects against type I diabetes: a family study. Proc Natl Acad Sci U. S. A., 1988, 85, p. 8111-8115.

18. KWOK, WW., et al. HLA-DQB1 codon 57 is critical for peptide binding and recognition. J Exp Med, 1996, 183, p. 1253-1258.

19. AWATA, T., et al. High frequency of aspartic acid at position 57 of HLA-DQ beta-chain in Japanese IDDM patients and non-diabetic subjects. Diabetes, 1990, 39, p. 266-269.

20. RONNINGEN, KS., et al. The amino acid at position 57 of the HLA-DQ beta chain and susceptibility to develop insulin-dependent diabetes mellitus. Hum Immunol, 1989, 26, p. 215-225.

21. RONNINGEN, KS., et al. Particular HLA-DQ alpha beta heterodimer associated with IDDM susceptibility in both DR4-DQw4 Japanese and DR4-DQw8/DRw8-DQw4 whites. Diabetes, 1991, 40, p. 759-763.

22. RONNINGEN, KS., et al. Distribution of HLA-DRB1, -DQA1 and -DQB1 alleles and DQA1-DQB1 genotypes among Norwegian patients with insulin-dependent diabetes mellitus. Tissue Antigens, 1991, 37, p. 105-111.

23. AWATA, T., et al. Genetic analysis of HLA class II alleles and susceptibility to type 1 (insulin-dependent) diabetes mellitus in Japanese subjects. Diabetologia, 1992, 35, p. 419-424.

24. UNDLIEN, DE., et al. HLA-encoded genetic predisposition in IDDM: DR4 subtypes may be associated with different degrees of protection. Diabetes, 1997, 46, p. 143-149.

25. NEJENTSEV, S., et al. The effect of HLA-B allele on the IDDM risk defined by DRB1*04 subtypes and DQB1*0302. Diabetes, 1997, 46, p. 1888-1892.

26. REIJONEN, H., et al. HLA-DR4 subtype and B alleles in DQB1*0302-positive haplotypes associated with IDDM. The Childhood Diabetes in Finland Study Group. Eur J Immunogenet, 1997, 24, p. 357-363.

27. HARFOUCH-HAMMOUD, E., et al. Contribution of DRB1*04 variants to predisposition to or protection from insulin dependent diabetes mellitus is independent of dq. J Autoimmun, 1996, 9, p. 411-414.

28. GRAHAM, J., et al. Negative association between type 1 diabetes and HLA DQB1*0602DQA1 *0102 is attenuated with age at onset. Swedish Childhood Diabetes Study Group. Eur J Immunogenet, 1999, 26, p. 117-127.

29. MOGHADDAM, HP., et al. Genetic structure of IDDM1: two separate regions in the major histocompatibility complex contribute to susceptibility or protection. Belgian Diabetes Registry. Diabetes, 1998, 47, p. 263-269.

30. MOGHADDAM, PH., et al. TNFa microsatellite polymorphism modulates the risk of IDDM in Caucasians with the high-risk genotype HLA DQA1* 0501DQB1*0201/DQA1*0301-DQB1*0302. Belgian Diabetes Registry. Diabetes, 1997, 46, p. 15141515.

31. LIE, B., et al. A gene telomeric of the HLA class I region is involved in predisposition to both type 1 diabetes and coeliac disease. Tissue Antigens, 1999, 52, p. 162-168.

32. CINEK, O., et al. Asociace variant inzulinového genu s diabetes mellitus 1. typu v české dětské populaci. Čas Lék Česk, 2004, 143, s. 318-322.

33. DAVIES, JL., et al. A genome-wide search for human type 1 diabetes susceptibility genes. Nature, 1994, 371, p. 130-136.

34. TODD, JA., FARRALL, M. Panning for gold: genomewide scanning for linkage in type 1 diabetes. Hum Mol Genet, 1996. 5 Spec No: p. 1443-1448.

35. OWERBACH, D., GABBAY, KH. The search for IDDM susceptibility genes: the next generation. Diabetes, 1996, 45, p. 544-551.

36. LUO, DF., et al. Confirmation of three susceptibility genes to insulin-dependent diabetes mellitus: IDDM4, IDDM5 and IDDM8. Hum Mol Genet, 1996, 5, p. 693-698.

37. TODD, JA. Genetic analysis of type 1 diabetes using whole genome approaches. Proc Natl Acad Sci U. S. A, 1995, 92, p. 8560-8565.

38. COX, NJ., et al. Seven regions of the genome show evidence of linkage to type 1 diabetes in a consensus analysis of 767 multiplex families. Am J Hum Genet, 2001, 69, p. 820-830.

39. MEIN, CA., et al. A search for type 1 diabetes susceptibility genes in families from the United Kingdom. Nat Genet, 1998, 19, p. 297-300.

40. CONCANNON, P., et al. A second-generation screen of the human genome for susceptibility to insulin-dependent diabetes mellitus. Nat Genet, 1998, 19, p. 292-296.

41. JULIER, C., et al. Insulin-IGF2 region on chromosome 11p encodes a gene implicated in HLA-DR4dependent diabetes susceptibility. Nature, 1991, 354, p. 155-159.

42. BAIN, SC., et al. Insulin gene region-encoded susceptibility to type 1 diabetes is not restricted to HLA-DR4-positive individuals. Nat Genet, 1992, 2, p. 212-215.

43. BENNETT, ST., et al. Susceptibility to human type 1 diabetes at IDDM2 is determined by tandem repeat variation at the insulin gene minisatellite locus (see comments). Nat Genet, 1995, 9, p. 284-292.

44. UNDLIEN, DE., et al. Insulin gene region-encoded susceptibility to IDDM maps upstream of the insulin gene. Diabetes, 1995, 44, p. 620-625.

45. McCORMACK, RM., et al. Possible association between CTLA4 DNA polymorphisms and early onset type 1 diabetes in a UK population. Genes Immun, 2001, 2, p. 233-235.

46. UEDA, H., et al. Association of the T-cell regulatory gene CTLA4 with susceptibility to autoimmune disease. Nature, 2003, 423, p. 506-511.

47. KAVVOURA, FK., IOANNIDIS, JP. CTLA-4 gene polymorphisms and susceptibility to type 1 diabetes mellitus: a HuGE Review and meta-analysis. Am J Epidemiol, 2005, 162, p. 3-16.

48. CINEK, O., et al. The CTLA4 +49 A/G dimorphism is not associated with type 1 diabetes in Czech children. Eur J Immunogenet, 2002, 29, p. 219-222.

**

Dědičnost diabetes mellitus 1. typu
Ohodnoťte tento článek!