Diagnostika pneumocystové pneumonie molekulárněbiologickými metodami

infekce vyvolané Pneumocystis jirovecii

Souhrn

Pneumonie způsobená Pneumocystis jirovecii (PCP) je život ohrožující mykotickou infekcí, která se vyskytuje zejména u HIV-pozitivních a jinak imunokompromitovaných jedinců. Specifickou skupinu nemocných tvoří imunokompromitovaní pacienti s hematologickými malignitami, u kterých bylo prokázáno, že konvenčně používané metody, zejména mikroskopická analýza, jsou velmi specifické, ale nejsou dostatečně citlivé. U těchto pacientů je metodou volby detekce DNA Pneumocystis jirovecii v klinických vzorcích (nejčastěji v indukovaném sputu nebo v tekutině získané bronchoalveolární laváží) metodami založenými na PCR. První metody umožňující záchyt P. jirovecii v klinických vzorcích byly publikovány v 90. letech minulého století(1) a od té doby následovaly desítky prací, které využívaly různé PCR platformy (jednokolová, nested, semi-nested, real-time PCR) a byly zaměřeny do různých cílových genů. Cílem tohoto přehledového článku je popsat přednosti a úskalí PCR diagnostiky PCP u pacientů s hematologickými malignitami.

Klíčová slova pneumocystová pneumonie * PCR * real-time PCR * diagnostika Genetická výbava P. jirovecii P. jirovecii byla dlouhá léta mylně považována za protozoon, a to zejména na základě morfologických znaků, teprve molekulárněbiologické analýzy malé podjednotky ribosomální RNA ji přiřadily do říše hub.(2) V roce 2012 Cissé a kol.(3) provedli rozsáhlou analýzu genomu P. jirovecii metodami sekvenování nové generace. Z jejích výsledků vyplynulo, že genom pneumocysty je velký 8,1 Mb a obsahuje celkem 3878 kódujících sekvencí. Potvrdilo se, že stejně jako v případě P. carinii schází i tomuto mikroorganismu celá řada genů kódujících základní enzymy důležité pro základní metabolismus, zejména syntézu aminokyselin – tyto pravděpodobně získává přímo z prostředí v plicích. Další významnou odchylkou je skutečnost, že genom postrádá charakteristické enzymy glyoxylátového cyklu, které patří k důležitým faktorům virulence ostatních mykotických patogenů. Tyto poznatky podporují názor, že P. jirovecii je obligátní parazit, kolonizující lidské plíce, který způsobuje závažné a často smrtelné onemocnění u imunokompromitovaných nemocných. Nové poznatky o skladbě genomu, získané s pomocí nejnovějších technologií, jsou velmi cenné a mohou pomoci při: i) identifikaci nutričních doplňků pro kultivaci pneumocysty in vitro, ii) identifikaci nových cílů pro léčbu a vývoj nových terapeutik pro léčbu PCP, iii) identifikaci cílových proteinů pro vývoj vakcín.
Detekce P. jirovecii v klinických vzorcích molekulárněbiologickými metodami

VÝBĚR VHODNÉHO VZORKU

Dříve publikované studie prokázaly na zvířecích modelech přenos infekce P. carinii mezi jedinci nemocnými PCP a zdravými jedinci, proto je tento způsob přenosu velmi pravděpodobný i u lidí. Z aeroskopického měření a následné analýzy pomocí kvantitativní real-time PCR v okolí (zejména HIV pozitivních) pacientů s PCP bylo zjištěno, že velkou nálož pneumocyst lze detekovat i ve vzdálenosti několika metrů od nemocného (7x 102 až 5x 105 organismů na m3 vzduchu ve vzdálenosti 1 m).(4) Tím lze vysvětlit vysoké nálože nalezené ve vzorcích z dutiny ústní a nosohltanu u HIV-pozitivních pacientů a byla tak potvrzena možnost horizontálního přenosu P. jirovecii mezi pacienty. Alanio a kol.(5) ve své studii srovnávali nálož P. jirovecii ve vzorcích získaných od HIV-pozitivních a HIV-negativních imunokompromitovaných pacientů. Zjistili, že u obou skupin nemocných byla fungální nálož měřená pomocí kvantitativní real-time PCR ve vzorcích indukovaného sputa a v tekutině získané bronchoalveolární laváží (BAT) srovnatelná. Samuel a kol.(6) u pediatrických pacientů porovnávali výsledky získané testováním vzorků z horních cest dýchacích (nazofaryngeální aspirát) a dolních cest dýchacích (indukované sputum nebo BAT) a prokázali, že při použití real-time PCR lze pro diagnostiku PCP použít i neinvazívně získané vzorky z horních cest dýchacích.
Z literatury tedy vyplývá, že kromě tradičních a ověřených klinických vzorků (BAT, indukované sputum, plicní tkáň) lze pravděpodobně pro detekci pneumocysty využít i neinvazívní klinické vzorky (výplach dutiny ústní, nazofaryngeální aspirát). Možnost detekce pneumocysty ve vzorcích získaných neinvazívními metodami je vítána zejména u pacientů, kteří nemohou podstoupit BAL, případně dětských pacientů.

IZOLACE DNA Z KLINICKÝCH VZORKŮ

Jako výchozí materiál pro detekci P. jirovecii je většinou využíván sediment buněk z indukovaného sputa nebo BAT. V případě zpracování velmi viskózních vzorků (zejména sputa) se osvědčilo před vlastní izolaci zařadit krok, při kterém je ke vzorku přidán roztok mukolytika, jež napomůže rozvolnění hlenu a uvolnění buněk. K následné izolaci DNA jsou nejčastěji využívány komerční soupravy, které separují celkovou DNA na kolonce (např. QIAmp DNA Mini kit, Qiagen).

PCR METODIKA

Cílovými úseky pro detekci P. jirovecii pomocí PCR jsou nejčastěji gen pro: dihydropteroát syntázu (DHPS), dihydrofolát reduktázu (DHFR), oblasti ITS (internal transcribed spacer) genu pro rRNA, velká podjednotka genu pro mitochondriální rRNA (mitochondrial large subunit, mtLSU), beta-tubulin, hlavní povrchový glykoprotein (major-surface glycoprotein, MSG), kex-1 a cdc-2.(7) Obecně se soudí, že vyšší citlivost mají metody detekující tzv. multikopiové geny (nejčastěji MSG a a mtLSU). Většina doposud publikovaných metod pro detekci pneumocysty byla vyvinuta v přímo v laboratořích a jedná se tedy o tzv. in-house metody. Na trhu jsou již dostupné také komerční soupravy. Jejich nespornou výhodou je standardizace PCR metodiky, která by umožnila získat srovnatelné výsledky z různých pracovišť. První multicentrickou prospektivní studii využívající komerční soupravu od firmy Myconostica publikovali Hauser a kol.(8) Bohužel počet pacientů s hematologickou malignitou byl v této studii příliš nízký (9 ze 110 pacientů) a neumožňuje proto dělat větší závěry o možnosti použití soupravy u této skupiny pacientů. Stejnou soupravu použili také Seah a kol.(9) a McTaggart a kol.(10) Z obou těchto studií vyplývá, že metoda má excelentní negativní prediktivní hodnotu (99–100 %), a tudíž negativní výsledek může vyloučit diagnózu PCP.

Normalizace výsledků

Stejně jako v případě jiných patogenů detekovaných z BAL nebo jiných nehomogenních typů klinických vzorků (sputum, výplachy dutiny ústní) komplikuje snahu o porovnání výsledků celá řada preanalytických faktorů – standardizace provedení BAL, rozdílná návratnost BAL u různých pacientů, homogenizace materiálu (obzvláště vazkého) a další. Tyto faktory lze jen obtížně ovlivnit a jediným způsobem je zcela standardizovaný postup pro provádění odběrů klinických vzorků.(11) Abychom mohli porovnávat kvantitativní výsledky získané z různých analýz a různých vzorků, je důležité provádět normalizaci výsledků. Jedním ze způsobů je uvádět fungální nálož na mililitr výchozího vzorku (v tomto případě je vhodné při izolaci DNA vycházet vždy ze stejného množství klinického materiálu), dále je možná detekce přítomnosti lidské DNA (nejčastěji jako paralelní real-time PCR reakce detekující některý z lidských housekeeping genů) a normalizace na počet lidských genomických ekvivalentů (přeneseně množství DNA vložené do reakce). Ani jeden z těchto způsobů však není ideální, nejsprávnějším přístupem je použití externí kontroly, nejčastěji v podobě určitého množství DNA (plazmidové, genomové) nehumánního (například rostlinného) původu, která je přidána do vzorku před zpracováním, odizolována spolu s DNA obsaženou ve vzorku, a následně detekována v nezávislé real-time PCR reakci. Tento způsob není při použití in-house metod používán rutinně, protože je poměrně technicky náročný na vlastní provedení a optimalizaci. Taková kontrola by však měla být nutnou součástí komerčních souprav pro in vitro diagnostiku.

Stanovení hodnoty kritické nálože P. jirovecii ve vzorku Největším úskalím použití citlivých molekulárněbiologických metod je odlišení kolonizace (přítomnosti mikroorganismu nebo jeho DNA v plicích bez příznaků pneumocystové pneumonie) od aktivní infekce. Míra kolonizace u imunokompetentních jedinců je asi 20 %, může se ale lišit u různých skupin a např. i geograficky (Tab. 1). Protože bronchoalveolární laváž je prováděna u nemocných s horečkou a/nebo plicním postižením, nelze u žádného z pacientů jednoznačně hovořit o pouhém nosičství. Z tohoto důvodu se v současné době u imunokompromitovaných pacientů upouští od klasických kvalitativních metod PCR, které jsou velmi citlivé, avšak pouhý pozitivní výsledek není dostatečný pro automatické zahájení léčby. Na většině pracovišť je v současné době používána pro detekci P. jiroveci kvantitativní real-time PCR. Kvantifikace fungální nálože v klinických vzorcích umožňuje stanovit riziko PCP u jednotlivých pacientů. Nalezením vhodného cut-off pro zahájení terapie se zabývá řada recentně publikovaných prací (Tab. 2). Publikované hodnoty lze jen obtížně srovnávat mezi sebou, protože se liší jak způsob zpracování materiálu, metoda izolace DNA, metodika PCR (cílový gen [více- nebo jednokopiový] atd.), tak jednotka, v níž je pozitivita vyjádřena. Obecně lze ale říci, že se většina autorů shoduje v tom, že existují dvě hodnoty – dolní, která diagnózu PCP vylučuje, a horní, která je spojena s vysokou pravděpodobností PCP. Mezi nimi leží „šedá zóna“, kdy je při hodnocení nutné zvážit četné klinické faktory (základní onemocnění, podávání profylaxe, podávání steroidů a míru imunosuprese atd.). Cut-off pravděpodobně někde v oblasti 103–104 kopií/PCR reakci je spojen s vysokou pravděpodobností PCP.

Závěr

Protože kultivace P. jirovecii není za běžných podmínek možná a ostatní konvenční metody nejsou dostatečně citlivé, je použití molekulárněbiologických metod vhodnou alternativou těchto tradičních přístupů. Vzhledem k velkému procentu kolonizace u zdravých jedinců je pro stanovení rizika PCP u imunokompromitovaných nemocných nutná kvantifikace fungální nálože ve vzorku. Mnohé práce ukazují, že pro diagnostiku PCP je možné použít i neinvazívní klinické vzorky, tyto poznatky je však nutné ověřit na větší skupině pacientů.

Poděkování: Tato práce byla podpořena projekty MZ-RVO (FNBr, 65269705) a SV MUNI/A/0723/2012.
Prohlášení: autor v souvislosti s tématem práce nespolupracuje s žádnou farmaceutickou firmou.

Literatura

1. WAKEFIELD, AE., PIXLEY, FJ., BANERJI, S., et al. Detection of Pneumocystis carinii with DNA amplification. Lancet, 1990, 336, p. 451–453.
2. EDMAN, JC., KOVACS, JA., MASUR, H., et al. Ribosomal RNA sequence shows Pneumocystis carinii to be a member of the fungi. Nature, 1998, 334, p. 519–522.
3. CISSÉ, OH., PAGNI, M., HAUSER, PM. De novo assembly of the Pneumocystis jirovecii genome from a single bronchoalveolar lavage fluid specimen from a patient. MBio, 2012, 4, e00412–00428.
4. CHOUKRI, F., MENOTTI, J., SARFATI, C., et al. Quantification and spread of Pneumocystis jirovecii in the surrounding air of patients with Pneumocystis pneumonia. Clin Infect Dis, 2010, 51, p. 259–265.
5. ALANIO, A., DESOUBEAUX, G., SARFATI, C., et al. Real-time PCR assaybased strategy for differentiation between active Pneumocystis jirovecii pneumonia and colonization in immunocompromised patients. Clin Microbiol Infect, 2011, 17, p. 1531–1537.
6. SAMUEL, CM., WHITELAW, A., CORCORAN, C., et al. Improved detection of Pneumocystis jirovecii in upper and lower respiratory tract specimens from children with suspected pneumocystis pneumonia using real-time PCR: a prospective study. BMC Infect Dis, 2011, 11, p. 329.
7. REID, AB., CHEN, SC., WORTH, LJ. Pneumocystis jirovecii pneumonia in non-HIV-infected patients: new risks and diagnostic tools. Curr Opin Infect Dis, 2011, 24, p. 534–544.
8. HAUSER, PM., BILLE, J., LASS-FLÖRL, C., et al. Multicenter, prospective clinical evaluation of respiratory samples from subjects at risk for Pneumocystis jirovecii infection by use of a commercial real-time PCR assay. J Clin Microbiol, 2011, 49, p. 1872–1878.
9. SEAH, C., RICHARDSON, SE., TSUI, G., et al. Comparison of the FXG™: RESP (Asp+) real-time PCR assay with direct immunofluorescence and calcofluor white staining for the detection of Pneumocystis jirovecii in respiratory specimens. Med Mycol, 2012, 50, p. 324–327.
10. McTAGGART, LR., WENGENACK, NL., RICHARDSON, SE. Validation of the MycAssay Pneumocystis kit for detection of Pneumocystis jirovecii in bronchoalveolar lavage specimens by comparison to a laboratory standard of direct immunofluorescence microscopy, real-time PCR, or conventional PCR. J Clin Microbiol, 2012, 50, p. 1856–1859.
11. SAMPSONAS, F., KONTOYIANNIS, DP., DICKEY, BF., EVANS, SE. Performance of a standardized bronchoalveolar lavage protocol in a comprehensive cancer center: a prospective 2-year study. Cancer, 2011, 117, p. 3424–3433. 12. PONCE, CA., GALLO, M., BUSTAMANTE, R., VARGAS, SL. Pneumocystis colonization is highly prevalent in the autopsied lungs of the general population. Clin Infect Dis, 2010, 50, p. 347–353.
13. VARGAS, SL., PIZARRO, P., LÓPEZ-VIEYRA, M., et al. Pneumocystis colonization in older adults and diagnostic yield of single versus paired noninvasive respiratory sampling. Clin Infect Dis, 2010, 50, e19–e21.
14. MEDRANO, FJ., MONTES-CANO, M., CONDE, M., et al. Pneumocystis jirovecii in general population. Emerg Infect Dis, 2005, 11, p. 245–250.
15. NEVEZ, G., JOUNIEAUX, V., LINAS, MD., et al. High frequency of Pneumocystis carinii sp. f. hominis colonization in HIV-negative patients. J Eukaryot Microbiol, 1997, 44, 36S.
16. BOTTEREL, F., CABARET, O., FOULET, F., et al. Clinical significance of quantifying Pneumocystis jirovecii DNA by using real-time PCR in bronchoalveolar lavage fluid from immunocompromised patients. J Clin Microbiol, 2012, 50, p. 227–231.
17. MATSUMURA, Y., ITO, Y., IINUMA, Y., et al. Quantitative real-time PCR and the (1›3)-ß-D-glucan assay for differentiation between Pneumocystis jirovecii pneumonia and colonization. Clin Microbiol Infect, 2012, 18, p. 591–597.
e-mail: mlengerova@fnbrno.cz

Tab. 1 Míra kolonizace u zdravých imunokompetentních jedinců
Studie Citace Charakteristika souboru Míra kolonizace (%)
Ponce a kol. (12) imunokompetentní dospělí (tkáně z autopsie – vraždy, sebevraždy) 65–79
(2010) – Santiago, Chile
Vargas a kol. (13) imunokompetentní dospělí – výplach dutiny ústní 13
(2010) (+ nazofaryngeální stěry) (22)
Medrano a kol. (14) imunokompetentní dospělí (výplach dutiny ústní) 20
(2005) – administrativní pracovníci nemocnice
Nevez a kol. (15) imunokompetentní dospělí (BAL) 20
(1997)

Tab. 2 Hraniční hodnoty pro odlišení kolonizace do aktivní infekce
Studie Citace Počet pacientů Cílový gen Hodnota cut-off Senzitivita (%) Specificita (%)
Alanio a kol. (5) 238 horní > 1900 TFEq/ml 86 100
(2011) (69 HIV + 115 HM + 15 OT aj.) mtLSU dolní < 120 TFEq/ml 100 97
Botterel a kol. (16) 287 ? 4,0 log10 kopií /µl 100
(2012) (39 HIV + 111 HM + 47 OT aj.) mtLSU ? 2,6 log10 kopií /µl 100
Matsumura a kol. (17) 147 1300 kopií/ml 100 80
(2012) (5 HIV + 20 HM + 29 OT) DHPS (odlišení prokázané PCP x možná PCP)
340 kopií/ml 67 73
(odlišení možné PCP x kolonizace)
HIV – HIV pozitivní, HM – hematologická malignita, OT – orgánové, mtLSU transplantace – velká podjednotka mitochondriální DNA (z angl. mitochondrial DNA large subunit),
DHPS – dihydropteroát syntáza, TFEq – ekvivalenty trofické formy (z angl. trophic form equivalents)

Summary

Lengerova, M., Volfova, P., Ricna, D., Palackova, M., Racil, Z. Diagnostics of pneumocystis pneumonia using methods of molecular biology Pneumonia caused by Pneumocystis jirovecii (PCP) is a life-threatening fungal infection that occurs especially in HIV-positive and other immunocompromised individuals. A specific group are patients with haematological malignancies in which it was shown that conventionally used methods, in particular microscopic analysis, are highly specific but not sensitive enough. In these patients, the method of choice is detection of P. jirovecii DNA in clinical specimens (mostly induced sputum or bronchoalveolar lavage fluid) using methods based on PCR. The first methods allowing detection of P. jirovecii in clinical specimens have been published in the 1990’s(1) and were followed by dozens of papers that were aimed at various target genes and used different PCR platforms (single-round, nested, semi-nested, real-time PCR). The aim of this review is to describe the advantages and pitfalls of PCR diagnosis of PCP in patients with haematological malignancies.

Key words
pneumocystis pneumonia * PCR * real-time PCR * diagnostics

O autorovi| 1,2Mgr. Martina Lengerová, Ph. D., 1Mgr. Pavlína Volfová, Ph. D., 1Mgr. Dita Říčná, 1MUDr. Martina Palacková, 1,2doc. MUDr. Zdeněk Ráčil, Ph. D. 1Masarykova univerzita Brno, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Brno, Interní hematologická a onkologická klinika 2Masarykova univerzita, CEITEC – Středoevropský technologický institut, Brno

1)
R
Ohodnoťte tento článek!