Fetální buňky – zdroj neinvazivní prenatální diagnostiky

Mgr. Ilona Hromadníková

MUDr. Milan Daněk

2. dětská klinika 2. LF UK, FN Motol, Praha

FrauenKlinik Basel, University Basel, Schweiz

Klíčová slova:

placentocentéza • fetální trofoblasty • fetální leukocyty • fetální jaderné elektrocyty • FACS • MACS • charged flow separation • FISH • PCR • prins • fetální DNA

Úvod

Prenatální diagnostika zaznamenala v posledních několika desetiletích obrovský rozvoj. Uvedení ultrazvuku do klinické praxe v 60. letech přineslo možnost detekce řady defektů plodu in utero.

Dalším přínosem pro prenatální péči bylo objevení souvislosti nízké hladiny alfa-fetoproteinu (AFP) a výskytu Downova syndromu. Postupně následoval screening i dalších látek vyskytujících se v séru těhotných jako je choriový gonadotropin (hCG) či nekonjugovaný estriol (UE3). Tyto neinvazivní screeningové metody však nedosahují požadované senzitivity, a tak k definitivní genetické diagnóze je i nadále zapotřebí použití invazivních technik. Vedle amniocentézy, používané k získání fetálních buněk více než 30 let, se na poli prenatální diagnostiky objevily i další metody, jako je odběr choriových klků (CVS) či pupečníkové krve (kordocentéza). Tyto invazivní techniky, i když dobře propracované a efektivní, s sebou nesou nezanedbatelné riziko pro plod a těhotenství. Největší část genetických poruch plodu představují chromozomální aneuploidie, z nichž asi 50 % připadá na trizomii 21 (Downův syndrom). Výskyt chromozomálních aberací se zvyšuje s narůstajícím věkem matky, který je dnes nejčastějším důvodem k provedení prenatální cytogenetické analýzy. S tím souvisí omezení nabídky invazivních metod ženám starším 35 let, kdy se riziko genetického postižení plodu vyrovnává riziku spojenému s použitím těchto technik. Jelikož však takto stanovená hranice věkové indikace k cytogenetické analýze zabrání narození dětí s Downovým syndromem jen v 25 %, je přáním lékařů poskytnout možnost prenatální diagnostiky široké populaci. A to zvláště dnes, kdy ve vyspělém světě klesá porodnost a současně stoupá průměrný věk těhotných a s tím související častější přání žen ujistit se o normálním vývoji plodu. Proto je dlouholetým cílem porodníků nabídnout neinvazivní prenatální diagnostickou metodu bez jakéhokoliv rizika pro plod.

Již delší dobu se pozornost obrací k fetálních buňkám vyskytujícím se v periferní krvi těhotných. Fetální jaderné buňky představují potenciální zdroj k získání genetické informace plodu a skýtají tak atraktivní možnost neinvazivní prenatální diagnostiky.

Současné metody prenatální diagnostiky

Jak bylo již zmíněno, má dnes prenatální diagnostika k dispozici řadu invazivních i neinvazivních metod k detekci vrozených vad plodu. Z neinvazivních screeningových metod má ultrazvuk své nezastupitelné místo především v druhém trimestru těhotenství, kdy umožňuje detekci řady genetických i negenetických onemocnění plodu. V posledních letech se nabízí alternativní ultrazvukový screening cytogeneticky podmíněných abnormalit již v prvním trimestru za použití typických morfologických markerů, jako jsou nuchální translucence (NT) u trizomie 21. chromozomu.

Též screening mateřského séra na AFP se stal součástí standardní prenatální péče. Původně byl určen k detekci strukturálních malformací plodu, jako je defekt neurální trubice či břišní stěny. Od roku 1984 je též používán ke screeningu chromozomálních aneuploidií, neboť se zjistilo, že jeho nízká hladina v mateřském séru koreluje s vyšším rizikem výskytu trizomie 21 a 18. Postupně se začaly používat i další substance vyskytující se v mateřském séru, nejčastěji choriový gonadotropin a nekonjugovaný estriol. Výsledkem snahy o co nejvyšší efektivnost screeningu bylo zavedení tzv. triple-testu (AFP, hCG, UE3) do prenatální péče. Senzitivita tohoto screeningu však nepřesahuje 65 % a je navíc zatížena falešnou pozitivitou okolo 5 %. Současně tyto neinvazivní metodiky nejsou schopny odhalit monogenní choroby plodu. Proto je k finální genetické diagnóze zapotřebí určení fetálního karyotypu pomocí invazivních metod. Z nich je v současnosti nejpoužívanější technikou amniocentéza, která se provádí v 2. trimestru těhotenství. Důvodem je její snadná proveditelnost a tím i dostupnost velkému počtu těhotných. Vzorek amniové tekutiny může být navíc odeslán do specializovaných laboratoří bez zvláštních opatření. Riziko ztráty plodu, spojené s tímto výkonem, je nižší než 1 %. Její nevýhodou je nevyhnutelnost buněčné kultivace a tudíž delší doba k získání konečné diagnózy, což pro pacientku znamená výraznější emoční zátěž a vyšší medicínské riziko v případě nutnosti pozdějšího přerušení těhotenství. Snaha o časnější karyotypizaci plodu vyústila v zavedení alternativních metod, jako je tzv. časná amniocentéza, prováděná mezi 12.–13. týdnem těhotenství a odběr choriových klků s možností získání fetální tkáně před koncem 1. trimestru. Ve srovnání s konvenční amniocentézou prováděnou mezi 15. – 17. týdnem gravidity jsou tyto metody, vedle menší dostupnosti, spojeny též s o něco vyšším rizikem potratu i s rizikem pro další normální vývoj plodu. Své místo v invazivní diagnostice mají i další techniky, jako je fetoskopie, kordocentéza či odběr choriových klků ve 2. či 3. trimestru, tzv. placentocentéza, která umožňuje rychlou cytogenetickou analýzu pomocí přímé preparace placentárních klků (nejčastěji v případech abnormálních ultrazvukových nálezů).

Fetální buňky v mateřské krvi – nová perspektiva neinvazivní prenatální diagnostiky

Během posledních let se celosvětový výzkum v oblasti prenatální genetické diagnostiky zaměřil na rozvoj neinvazivních metod založených na koncentraci a detekci fetálních buněk nacházejících se v periferní krvi gravidních žen. Během těhotenství přecházejí transplacentárně do krve matek fetální trofoblasty, leukocyty (lymfocyty, granulocyty) a jaderné erytrocyty (1, 3, 5, 8, 13, 14, 15).

Fetální trofoblasty

Přítomnost fetálních trofoblastů v mateřském krevním oběhu byla popsána již v roce 1893. Fetální trofoblasty byly zpočátku velmi atraktivní pro účely neinvazivní prenatální diagnostiky vzhledem ke své unikátní morfologii a extenzivnímu transplacentárnímu přestupu během prvního trimestru gravidity. Unikátní morfologie trofoblastů, daná jejich značnou velikostí a mnohojaderností, umožňuje na jedné straně snadnou identifikaci, ale na straně druhé je příčinou jejich vychytávání a rychlé degradace v plicích matky. Zároveň se ukázalo, že přítomnost fetálních trofoblastů v krevním oběhu matek není běžným fenoménem všech těhotenství. Další omezení využití fetálních trofoblastů v oblasti neinvazivní prenatální diagnostiky je dáno existencí placentárního mozaicizmu. Placentární syncytiotrofoblasty neobsahují vždy stejný genetický materiál jako plod. Tento choriový mozaicizmus byl dokumentován v 1 % případů odběrů biopsií choriových klků.

Fetální leukocyty

Použití fetálních lymfocytů v oblasti neinvazivní prenatální diagnostiky je znevýhodněno tím, že jsou produkovány až během druhého trimestru gravidity a schopností jejich dlouhodobé perzistence v krevním oběhu matek. Chromozom Y pozitivní fetální buňky byly detekovány v cirkulaci matek 1 až 5 let po porodu, v některých ojedinělých případech i 27 let post partum. Výhodou fetálních lymfocytů je exprese HLA antigenů na buněčných membránách, což v případě HLA inkompatibility mezi matkou a otcem umožňuje jejich snadnou separaci a koncentraci z periferní krve matek pomocí průtokové cytometrie (FACS).

Fetální jaderné erytrocyty

Jako optimální neinvazivní zdroj jsou v současné době využívány jaderné erytrocyty (NRBC). Jaderné erytrocyty se za fyziologických podmínek v krevním oběhu dospělých jedinců nevyskytují. Výjimkou je období těhotenství, kdy dochází ke stimulaci jejich syntézy.

Fetální erytrocyty jsou prvními hematopoetickými buňkami syntetizovanými v raném stadiu embryonální krvetvorby a do mateřské cirkulace přecházejí již během prvního trimestru. V krevním oběhu gravidních žen je tedy možné nacházet jaderné erytrocyty jak mateřského, tak fetálního původu. Většina NRBC je však původu mateřského. Vzhledem ke krátké životnosti erytrocytů nehrozí nebezpečí jejich perzistence do dalších gravidit. NRBC procházejí jen malým počtem buněčných cyklů, diferenciací ztrácejí jádro a mění se ve zralé červené krvinky. Počet fetálních NRBC přítomných v periferii matek se po porodu rychle snižuje, tři měsíce po porodu nejsou již detekovatelné. Jen ojediněle byl zaznamenán případ jejich dlouhodobější perzistence.

Fetální NRBC se v periferní krvi těhotných žen vyskytují jen ve velmi nízkých koncentracích. U primigravid se udává frekvence výskytu jedné fetální buňky na 1×105 buněk mateřských. Všeobecně je udávána ještě nižší frekvence jejich výskytu (1×10–4 – 10–9). Zajímavé zjištění přinesly některé studie udávající zvýšený výskyt fetálních buněk v periferní krvi těhotných žen s plodem postiženým trizomií 21 (14).

K průkazu výskytu vzácně se vyskytujících fetálních buněk v periferní krvi gravidních žen vysoce citlivými molekulárně-genetickými metodami je tedy nutná jejich předchozí koncentrace (6, 11). NRBC exprimují na svých buněčných membránách řadu antigenů, které usnadňují jejich izolaci. Např. transferinový receptor (CD71), glykoforin A (GPA), antigeny krevních skupin (ABO, Rhesus, MN atd.), trombospondinový receptor (CD36), erytropoetinový receptor, antigeny exprimované na fetálních játrech (HAE9, FB3–2, H3–3) a pravděpodobně i HLA-G molekuly.

Fetální jaderné erytrocyty produkují fetální hemoglobin (HbF). Zeta a gama řetězce fetálního hemoglobinu představují unikátní marker fetálních buněk. Prostřednictvím monoklonálních protilátek proti HbF je možné rozlišit fetální NRBC od NRBC mateřského původu.

Metody koncentrace fetálních buněk z periferní

krve gravidních žen

Vzhledem k nízké četnosti fetálních buněk v krevním oběhu matek je nutná jejich předchozí koncentrace. Byla vypracována řada koncentračních a izolačních metodik zahrnujících použití centrifugace v hustotních gradientech, průtokovou cytometrii (FACS), magnetickou separaci buněk (MACS), mikromanipulaci na úrovni jedné buňky, separaci buněk v elektrickém poli na základě náboje na povrchu buněčných membrán (charged flow separation) atd. Nejpopulárnějšími koncentračními metodami jsou metody průtokové cytometrie (6) a magnetické separace buněk (11).

Autoři koncentrující fetální buňky prostřednictvím průtokové cytometrie používají monoklonálních protilátek proti CD71, CD36, GPA a erytrocytárnímu membránovému proteinu. V případě separace fetálních buněk prostřednictvím anti-GPA monoklonální protilátky samotné či v kombinaci s anti-CD71 nebo anti-CD36 monoklonálními protilátkami bylo možné úspěšně detekovat pohlaví fétu se 100% přesností. Autoři preferující ke koncentraci fetálních buněk metodu magnetické separace používají kombinaci přípravy mononukleárních buněk centrifugací v hustotním gradientu s následnou pozitivní selekcí NRBC prostřednictvím anti-CD71 nebo anti-GPA monoklonálních protilátek konjugovaných se superparamagnetickými partikulemi (microbeads) na zařízení MiniMACS. Některé studie vřazují před pozitivní selekci CD71 pozitivních buněk (NRBC) navíc krok odstranění mateřských leukocytů. Odstranění mateřských leukocytů vede k dokonalejší purifikaci frakce jaderných erytrocytů a tím k dokonalejší koncentraci fetálních buněk. Deplece mateřských buněk se provádí na zařízení VarioMACS pomocí současné inkubace s anti-CD45 a anti-CD14 microbeads.

Nejnovější studie zkoumají vliv specifické hustoty separačních médií (Ficoll-Pague, Sigma, St Louis, MO, USA) určených k izolaci mononukleárních buněk. Výtěžnost NRBC lze zvýšit zvýšením specifické hustoty separačního média (16).

Fetální buňky jako neinvazivní zdroj prenatální diagnostiky

Genetická analýza fetálních buněk koncentrovaných z periferní krve těhotných nevyžaduje přítomnost dělících se buněk. Provádí se pomocí fluorescenční in situ hybridizace (FISH), polymerázové řetězové reakce (PCR) a rovněž pomocí PRINS metody (primed in situ labeling). Komerčně dodávané FISH sety umožňují určit pohlaví fétu a detekovat nejčastěji se vyskytující chromozomální aberace 21., 18., 13., X a Y chromozomu (2, 4, 5). První detekce trizomie 18 a 21 na frakci koncentrovaných jaderných erytrocytů pomocí FISH byly provedena začátkem 90. let.

Metoda PRINS slouží k rychlé analýze numerických chromozomálních aberací a k určení pohlaví fétu.

Pomocí PCR lze rovněž určit pohlaví a Rh faktor fétu nebo detekovat dědičné hemoglobinopatie (amplifikace specifické alely zděděné od otce) (1).

V současné době je studována i možnost neinvazivní prenatální diagnostiky monogenních chorob s autozomálně-recesivním typem dědičnosti (talazémie, cystická fibróza, srpkovitá anémie) a monogenních chorob s dědičností vázanou na chromozom X recesivního typu (svalové dystrofie) (1). V obou případech je pro klinickou manifestaci choroby nutná přítomnost patologické alely na obou homologických lokusech (homozygot). Fetální buňky přítomné v periferní krvi těhotných jsou identifikovány pomocí monoklonální protilátky proti HbF a pro účely prenatální diagnostiky izolovány mikromanipulačně pod mikroskopem podobně jako v případě preimplantační diagnostiky.

Použití výše zmíněných metod je v současné době předmětem intenzivního výzkumu pro spolehlivé a co nejširší využití v prenatální diagnostice. Počáteční úspěch v detekci chromozomálních abnormalit ve frakci fetálních buněk koncentrovaných z periferní krve matek vedl v roce 1994 United States National Institute of Health ke sponzorování klinické studie (NIFTY trial) zabývající se konfrontací těchto výsledků s výsledky klasické cytogenetické analýzy (5).

Klinické souvislosti transplacentárního přechodu fetálních buněk

Výzkum fetálních buněk k účelu prenatální diagnostiky přinesl řadu náhodných a nečekaných informací ohledně bilaterálního přechodu buněk mezi plodem a matkou. Zjištění, že kmenové buňky fetální krvetvorby mohou přetrvávat v mateřském oběhu i několik desítek let (1) přineslo nové pohledy na problematiku některých autoimunitních onemocnění. Možná účast tohoto fetálního mikrochimérizmu v patogenezi systémové sklerózy byla popsána několika autory (12). Není bez zajímavosti, že autoimunitní choroby se vyskytují častěji u žen a zvláště pak u těch, které již rodily.

Zvýšené hladiny jaderných erytroblastů byly pozorovány v krvi těhotných pacientek s preeklampsií (7, 8).

Další studie těchto autorů, která byla zaměřena na těhotné ženy s mužským pohlavím fétu, prokázala zvýšený počet jaderných erytrocytů jak mateřského, tak fetálního původu.

Zjištění zvýšených koncentrací erytroblastů nalezených v časnějších stadiích těhotenství u žen, které později onemocněly preeklampsií, by mohlo sloužit jako prognostický ukazatel rizika vzniku této těhotenské komplikace.

Paralelně se zvýšeným výskytem fetálních buněk u pacientek s preeklampsií byly nalezeny i vyšší hladiny volně cirkulující fetální DNA (10).

Zvýšený fetomaternální přechod buněčných elementů pozorovaný u preeklampsie je nejspíše důsledkem strukturální alterace placentární bariéry způsobené hypoxií.

Fetální DNA v mateřské krvi

Nedávný objev volně cirkulující DNA v mateřské periferní krvi (9, 10) otevírá cestu novým aplikacím prenatální diagnostiky. Fetální DNA byla prvně prokázána v mateřském séru pomocí PCR detekcí Y chromozomu za použití sekvenčně specifických primerů u těhotných s mužským pohlavím fétu.

Použití kvantitativní PCR umožnilo dále stanovit podíl fetální DNA v séru žen s normálním těhotenstvím, který představuje okolo 5 % z celkového množství DNA. Vzhledem k přítomnosti jak mateřské, tak fetální DNA v mateřské krvi je možné detekovat pouze paternální alely. To platí např. pro určení fetálního Rh D genu u Rh negativních matek. Hahn a kol. v roce 1999 ve své studii správně určili jak pohlaví, tak Rh faktor u všech 22 analyzovaných vzorků mateřské krve. Zajímavou informaci přinesl ve své nedávné práci Lo a kol., který našel abnormálně vysoké koncentrace cirkulující fetální DNA ve vzorcích těhotných s plodem postiženým trizomií 21 (10).

Závěr

Dosavadní pokroky ve výzkumu fetálních buněk v mateřském oběhu jsou příslibem reálné možnosti rozšíření stávajícího repertoáru prenatálních diagnostických metod o neinvazivní techniku k detekci chromozomálních aneuploidií. Metoda koncentrace fetálních buněk z periferní krve gravidních žen by mohla představovat doplňkový neinvazivní screeningový test k detekci chromozomálních aneuploidií plodu s možnou vyšší senzitivitou, a tak přispět k snížení potřeby invazivních metodik.

I když tato metoda není ještě použitelná pro účely rutinní prenatální diagnostiky, je již zřejmé, že bude formovat její budoucnost. Současně kombinace mikromanipulačních technik a PCR jedné buňky jsou velmi slibné stejně jako nové technologie vyvinuté k detekci extracelulární fetální DNA. Zdokonalení koncentračních metod fetálních buněk spolu s použitím automatických separačních systémů a vícebarevné FISH přibližuje snahu o neinvazivní prenatální diagnostiku realitě. Dosavadní výzkum přispěl současně k lepšímu pochopení fetomaternálního buněčného transferu a poskytl nové pohledy na patogenezi autoimunitních onemocnění a některých těhotenských patologií.

Literatura

1. Bianchi D. W.: Current knowledge about fetal blood cells in the maternal circulation. J. Perinat. Med., 1998, 26: 175-185

2. Bianchi D. W.: New approaches to prenatal diagnosis. Current Opinion in Pediatrics, 1991, 3: 1024-1028.

3. Ganshirt D., Garritsen H. S. P., Holzgreve W., et al.: Prenatal Diagnosis Using Fetal Cells in the Maternal Circulation. Fetal and Maternal Medicine Review, 1995, 7: 77-85

4. Ganshirt-Ahlert D., Borjesson-Stoll R., Burschyk M., et al.: Detection of Fetal Trisomies 21 and 18 from Maternal Blood Using Triple Gradient and Magnetic Cell Sorting. American J. of Reproductive Immunology, 1993, 30: 194-201

5. Hahn S., Sant R., Holzgreve W.: Fetal cells in maternal blood: current and future perspectives. Molecular Human Reproduction, 1998, 4: 515-521

6. Herzenberg L. A., Bianchi D. W., Shroder J., et al.: Fetal cells in the blood of pregnant women: detection and enrichment by fluorescence-activated cell sorting. Proc Natl Acad Sci USA, 1979, 76: 1453-1455

7. Holzgreve W., Ghezzi F., Di Naro E., et al.: Disturbed Feto-Maternal Cell Traffic in Preeclampsia. Obstetrics and Gynecology, 1998, 91: 669-772

8. Holzgreve W., Mazor M., Geyter C., et al.: Fetal cells in maternal blood: diagnostic and clinical aspects. Textbook of Perinatal Medicine: 1120-1126

9. Lo Y. M.: Fetal RhD genotyping from maternal plasma. Ann Med, 1999, 31: 308-312

10. Lo Y. M. D., Lau T. K., Zhang J., et al.: Increased Fetal DNA Concentrations in the Plasma of Pregnant Women Carrying Fetuses with Trisomy 21. Clinical Chemistry, 1999, 45: 1747-1751

11. Miltenyi S., Muller W., Weichel W., et al.: High gradient magnetic cell separation with MACS. Cytometry, 1990; 11: 231-238

12. Nelson J. L., Furst D. E., Maloney S., et al.: Microchimerism and HLA-compatible relationships of pregnancy in scleroderma.

13. Simpson J. L., Elias S.: Fetal Cells in Maternal Blood. Annals New York Academy of Sciences, 1994, 731: 1-7

14. Simpson J. L., Lewis D. E., Bischoff F. Z., et al.: Isolating Fetal Nucleated Red Blood Cells From Maternal Blood: The Baylor Experience. Prenatal Diagnosis, 1995; 15: 907-912

15. Steele C. D., Wapner R. J., Smith J. B., et al.: Prenatal Diagnosis Using Fetal Cells Isolated From Maternal Peripheral Blood: A Review. Clinical Obstetrics and Gynecology, 1996, 39: 801-813

16. Troeger C., Holzgreve W., Hahn S.: A comparison of Different Density Gradients and Antibodies for Enrichment of Fetal Erythroblasts by MACS. Prenatal Diagnosis, 1999, 19: 521-526

ilona.hromadnikova@lfmotol.cuni.cz

Ohodnoťte tento článek!