HER2 testování v algoritmu cílené léčby trastuzumabem u karcinomu prsu

Karcinom prsu je nejčastější zhoubné onemocnění u žen v rozvinutých zemích. Základem histopatologického vyšetření je stanovení správné morfologické diagnózy. S nástupem nových terapeutických možností totiž začíná hrát stále důležitější roli molekulární profil nádoru.

Summary

Ryska, A. HER2 testing in targeted trastuzubam breast carcinoma treatment algorithm

Breast carcinoma is the most common malignancy in women in the developed world. The basis of histopathological examination is determining a correct morphological diagnosis. With the emergence of new therapeutic possibilities, the tumour's molecular profile plays an increasingly important role.

Karcinom prsu je nejčastější zhoubné onemocnění u žen v rozvinutých zemích, a budí proto pozornost v oblasti novinek týkajících se diagnostiky i terapie. Alfou a omegou histopatologického vyšetření je stanovení správné morfologické diagnózy, tj. biologické povahy nádoru (benigní či maligní, in situ nebo invazívní), jeho velikosti a konkrétního histologického typu (karcinom duktální, lobulární, tubulární, mucinózní apod.), stupně diferenciace, postižení sentinelové a dalších lymfatických uzlin,(1) určení vztahu nádoru k resekčním okrajům, a tím i posouzení adekvátnosti chirurgického výkonu apod. Tyto základní parametry jsou, tak jako je tomu u jiných maligních nádorů, dále rozšířeny o výsledky doplňkových speciálních vyšetření zejména z oblasti imunohistochemie a molekulární biologie.

S nástupem nových terapeutických možností totiž začíná hrát stále důležitější roli molekulární profil nádoru, který vypovídá o funkčních drahách, které mají přímý vliv na růst nádoru, jeho šíření a metastazování, ale také na možnost ovlivnění jednotlivými typy protinádorových léků.(2) Tyto speciální molekulární znaky tak pomáhají onkologovi lépe se rozhodnout při volbě optimálního terapeutického postupu, zejména tehdy, když se jedná o možnost podání tzv. cílené terapie.
U karcinomu prsu jsou proto pro svůj zásadní význam pro rozhodnutí o systémové léčbě do diagnostického standardu zahrnuty výsledky vyšetření exprese hormonálních receptorů (estrogenových – ER a progesteronových – PR), proliferačních markerů (v dnešní době prakticky výhradně antigenu Ki67) a některých onkoproteinů (p53 či HER-2/neu). Zejména otázky kolem vyšetřování posledně jmenovaného receptoru jsou v naší i světové literatuře velmi diskutovány. Přes zavedený systém vyšetřování HER2 existuje celá řada nezodpovězených otázek a výzev. Pozornost se soustředí zvláště na kvalitu a reprodukovatelnost vyšetření, na volbu optimálního diagnostického postupu a také na optimální kritéria, s jejichž pomocí lze s nejvyšší možnou pravděpodobností vybrat pacientky k volbě správné léčby.

Protein HER-2/neu a jeho význam u karcinomu prsu

Protein HER-2/neu (dále jen HER2), který byl poprvé popsán v roce 1982, je produktem přepisu onkogenu c-erbB-2 lokalizovaného na dlouhém raménku 17. chromosomu (17q21). Tento protein o molekulové hmotnosti 185 kd je zástupcem rodiny receptorů pro epidermální růstový faktor (EGFR). Kromě HER2 patří do této skupiny také receptory HER1 (EGFR), HER3 a HER4. Tyto čtyři molekuly si jsou do velké míry podobné -všechny obsahují extracelulární doménu, na kterou se váže ligand aktivující daný receptor aktivující, transmembránovou doménu a intracelulární doménu, která se vyznačuje tyrozinkinázovou aktivitou. Díky té je nastartována signální kaskáda vedoucí ke konečnému biologickému efektu.(3) Na samém počátku signální dráhy je moment aktivace receptoru ligandem, který vede k procesu dimerizace – homodimerizace, v případě vazby na jiný receptor z rodiny HER heterodimerizace. Jednotlivé molekuly skupiny HER se od sebe poněkud liší – právě HER2 je jediným zástupcem, který není přímo aktivován svým ligandem (má „necitlivou“ či „slepou“ svou extracelulární doménu), a podílí se tak na procesu dimerizace spontánně a z celé skupiny HER receptorů nejochotněji. Následná fosforylace a aktivace signální dráhy vedou ke zvýšené proliferaci, zablokování apoptózy, zvýšené vaskularizaci nádoru a vyššímu metastatickému potenciálu. Proto je HER2 u karcinomu prsu považován za jednoznačně nepříznivý prognostický faktor.(4)

U některých nádorů (karcinomy prsu, slinných žláz, pankreatu, endometria, ovaria) je tento receptor zvýšeně exprimován – místo desítek tisíc molekul, které jsou přítomny na povrchu normálních epiteliálních buněk, je jich u tumorů s overexpresí HER2 na membráně nádorové buňky přítomno několik stovek tisíc až milión kopií. Příčinou nadměrné exprese, vyskytující se u karcinomu prsu v naší populaci asi v 12-15 %, je takřka vždy amplifikace genu c-erbB-2.(5) Tato pozitivita HER2 (ať již prokázaná imunohistochemicky – IHC – tj. detekcí proteinu na buněčné membráně, nebo in situ hybridizací – ISH – pomocí detekce amplifikace, tj. zvýšeného počtu kopií genu v buněčném jádře), bývá významně častější zejména u nádorů nízce diferencovaných, častěji u karcinomů duktálních než lobulárních.(6) Jak bylo již výše řečeno, až do 90. let minulého století byla zvýšená exprese HER2 považována pouze za negativní prognostický faktor.(4) Avšak se zavedením trastuzumabu do léčby se HER2 stal ze znaku čistě prognostického rovněž markerem prediktivním. Jeho vyšetřování se ukázalo být zcela zásadním pro selekci těch pacientek, které jsou vhodné pro léčbu trastuzumabem. Proto již po řadu let platí, že vyšetření HER2 má být – vedle průkazu exprese hormonálních receptorů a proliferační aktivity – provedeno u všech nově diagnostikovaných karcinomů prsu.

Tento požadavek je také zanesen v přijatém Standardu morfologického vyšetření nádorů prsu (dostupném na webových stránkách www.patologie.info). Přestože tento materiál, který publikovala Společnost českých patologů ČLS JEP po rozsáhlé odborné diskusi a který je závazným standardem, platí již několik let, není možné jednoznačně a neochvějně tvrdit, že nikdy nedochází k opomenutí provedení toho či onoho dílčího vyšetření. Odpověď na otázku zda, resp. u jaké části nádorů chybí nějaká část vyšetření, by měl přinést nově zavedený celostátní histologický registr karcinomů prsu, do kterého je zaznamenávána celá řada detailních údajů – kromě TNM klasifikace také výsledky vyšetření hormonálních receptorů, proliferační aktivity a HER2. Velmi snadno tak bude možné najít případy, kde vyšetření nebylo provedeno kompletně – ať již z důvodů objektivních (špatná fixace materiálu na chirurgii, malé množství nádorové tkáně v punkčním vzorku apod.), či z důvodů opomenutí. Prospektivní sběr zatím probíhá jeden rok, očekáváme, že v blízké budoucnosti bude možné použít data z registru ke zlepšení zpětné vazby pro jednotlivé laboratoře a pro identifikaci kritických či slabých míst v celém diagnostickém procesu. Statistické zhodnocení umožní také stanovení přesného procentuálního zastoupení HER2 pozitivních karcinomů prsu, a tím také případnou korekci očekávaných počtů pacientek predikovaných k léčbě trastuzumabem.

Jaké jsou novinky v kritériích pro hodnocení HER2 pozitivity?

Přestože vyšetřování HER2 probíhá v ČR již přes 10 let, stojíme znovu před – jen zdánlivě jednoduchou – otázkou, jak definovat HER2 pozitivní karcinom prsu. V dřívější době byly jako HER2 pozitivní označovány ty, které vykazovaly silnou imunohistochemickou membránovou pozitivitu (3+) ve více než 10 % nádorových buněk nebo nádory s amplifikací genu c-erbB-2 definovanou jako průměrný absolutní počet kopií genu v jádře > 4 nebo jako poměr mezi počtem kopií genu c-erbB-2 a počtem signálů centromerické oblasti 17. chromosomu >2. V roce 2007 bylo ale American Society of Clinical Oncology (ASCO) a College of American Pathologists (CAP) vydáno společné doporučení, které změnilo kritéria HER2 pozitivity.(7) Pro imunohistochemii byl z důvodu eliminace nádorů s minoritní HER2 pozitivní komponentou zvýšen minimální podíl pozitivních buněk z původních 10 % na 30 %, u FISH pak byla zavedena kategorie hraničních nádorů, kde se poměr HER2/CEP17 pohyboval v rozmezí 1,8-2,2, případně v rozmezí absolutního počtu 4-6 kopií genu na jádro. V oblasti imunohistochemie se nejednalo o zásadní změnu. Heterogenních lézí s podílem pozitivní komponenty mezi 10 % a 30 % je relativně málo a i u těch, které budou z důvodu zvýšené hranice pro pozitivitu hodnoceny nikoli jako 3+, ale jako 2+, bude následně provedeno vyšetření in situ hybridizací, které potvrdí, zda je gen amplifikován, či nikoli.

Naproti tomu zavedení kategorie hraniční amplifikace vedlo k celé řadě nedorozumění. Důvodem pro zavedení hraniční kategorie byl fakt, že v důsledku interindividuální variability mohli dva různí hodnotitelé dojít při kvantifikaci počtu kopií genu k rozdílům, které nebyly matematicky velké (např. 1,9 vs. 2,1), ale měly zásadní dopad na klinické rozhodování (nepodání versus podání Herceptinu). Proto bylo doporučeno, aby u nádorů, které budou spadat do hraniční kategorie, bylo počítáno větší množství jader, použit jiný tkáňový blok apod., tak aby se definitivně prokázalo, zda je gen v nádoru amplifikován, či nikoli. Pokud bude výsledná hodnota i nadále v hraniční oblasti, platí, že pro anti-HER2 léčbu jsou vhodné případy s hodnotou HER2/CEP17 2 a vyšší. Zatímco tedy pro stanovení ISH pozitivity (amplifikace) platí hranice poměru HER2/CEP17 2,2, pro indikaci terapie trastuzumabem nadále zůstává platná původní hranice 2,0.

Případy karcinomu prsu s diskordantním fenotypem

Obě běžně používané metody – IHC a ISH – se zaměřují na odlišné struktury. Ve většině případů je výsledek obou vyšetření konkordantní (obě vyšetření pozitivní nebo obě negativní), míra shody mezi oběma metodami přesahuje 95 %,(8-10) u menšiny nádorů se však lze setkat s výsledky diskordantními (jedno z vyšetření pozitivní, druhé negativní). Tyto diskordantní výsledky neznamenají nutně selhání – falešnou pozitivitu či falešnou negativitu – jedné z metod, příčiny mohou být (a často jsou) důsledkem inherentních biologických vlastností daného nádoru. U nádorů IHC+/ISH- jde nejčastěji o případy, kdy zvýšená exprese proteinu je způsobena polysomií chromosomu 17 v nádorové buňce,(8) u nádorů IHC-/ISH+ může jít o důsledek změn struktury proteinu, který je následně imunohistochemicky nedetekovatelný.(11) Receptor přitom však může být nadále plně funkční a může být blokován anti-HER2 léčbou.

Celá řada studií prokázala, že amplifikace genu je prediktorem efektivity léčby trastuzumabem, bez ohledu na výsledek IHC; další studie(12, 13) však ukazují, že také pacientky s nádory IHC 3+ profitují z léčby trastuzumabem i v případě, kdy nebyla ISH prokázána amplifikace genu. Není tak překvapením, že podle analýzy dat ze studie HERA efekt léčby trastuzumabem nezávisí na stupni amplifikace genu, ať již hodnoceném pomocí indexu HER2/ CEP17, nebo pomocí absolutního počtu kopií genu HER2.(12, 14) Zajímavým zjištěním je, že pravděpodobně důležitější než poměr HER2/CEP17 je absolutní počet kopií genu HER2 v jádře.(15, 16) Navíc stav detekovaný jako polysomie pomocí FISH nemusí být skutečnou polysomií, ale ve značném počtu případů může jít pouze o současnou amplifikaci HER2 a centromerické oblasti chromosomu 17.(17)

Projekt HERretest a jeho výsledky

V rámci ČR probíhá, stejně jako ve většině jiných rozvinutých zemí, testování HER2 u nemocných s karcinomem prsu primárně pomocí imunohistochemie; u nádorů, které vykazují spornou (slabou) pozitivitu – skóre 2+ – je výsledek ověřován imunohistochemicky pomocí certifikovaných kitů a dále metodou in situ hybridizace v referenčních laboratořích. Pro anti-HER2 terapii jsou vhodné pacientky s nádory pozitivními imunohistochemicky (IHC) a/nebo in situ hybridizací (ISH). V případě nádorů s diskordantním fenotypem IHC+/ISH- jsou nádory zachyceny již v rámci prvotního testování a pacientky tak mohou profitovat z anti-HER2 léčby. Naproti tomu nádory hodnocené v primární laboratoři jako IHC negativní (IHC-) nejsou dále testovány, a nelze proto zjistit, jaké je zastoupení nádorů, které jsou IHC-, avšak vykazují amplifikaci genu HER2 prokazatelnou pomocí ISH (ISH+) – tj. mají diskordantní fenotyp IHC-/ISH+, a mohly by tedy také reagovat na výše zmíněnou léčbu. Zároveň doposud neexistují relevantní data, která by srovnávala výsledky IHC vyšetření provedených v primárních a následně v referenčních laboratořích u nádorů, které byly v primární laboratoři hodnoceny jako IHC-.

V průběhu roku 2010 proběhla studie, které se zúčastnilo celkem 22 pracovišť patologie, která rutinně provádějí IHC stanovení HER2. Tato pracoviště po dobu studie zasílala IHC- vzorky na kontrolní vyšetření, které bylo provedeno vždy v jedné z 6 stávajících referenčních laboratoří, a to jak pomocí IHC certifikovaným kitem (ověření skutečné IHC negativity), tak pomocí ISH. U každého případu byl dále zaznamenáván histologický typ, grade, počet vyšetřených a počet pozitivních lymfatických uzlin, stav exprese receptorů pro estrogen a progesteron a proliferační aktivita (Ki67 antigen).
V rámci studie s prospektivním i retrospektivním sběrem vzorků z 22 pracovišť bylo vyšetřeno celkem 617 případů HER2 IHC-karcinomu prsu. IHC vyšetření v referenční laboratoři bylo shodné s primárním vyšetřením v 535 (86,7 %) případů. Z 82 (13,3 %) neshodných případů bylo 13 nádorů (2,1 %) HER2 silně pozitivních (3+) a 69 (11,2 %) slabě (hraničně) pozitivních. Z těchto 69 nádorů však jen 12 (1,9 %) vykazovalo amplifikaci pomocí ISH, zbylých 57 (9,3 %) bylo ISH negativních. Z celkového počtu 617 nádorů tedy byla klinicky signifikantní falešná negativita vyšetření v primární laboratoři prokázána jen v 25 případech (4 %), což je nepochybně příznivá zpráva. Z 535 (86,7 %) případů IHC- vykazovalo 13 (2,1 %) nádorů hraniční amplifikaci a 8 (1,3 %) nádorů jednoznačnou amplifikaci genu HER-2/neu pomocí ISH; celkem tedy bylo 21 (3,4 %) případů karcinomů prsu s diskordantním fenotypem (tj. imunohistochemicky HER2 negativní i při opakovaném vyšetření, avšak s amplifikací genu potvrzenou in situ hybridizací).

Podrobnější analýza dalších charakteristik této podskupiny nádorů ukázala, že se jednalo statisticky významně častěji o duktální či papilární karcinomy, vykazující částečnou či úplnou ztrátu hormonální dependence a spadající do kategorie pT2 či vyšší. Studie tak prokázala nejen vysokou míru klinicky signifikantní shody IHC vyšetřením provedeném v primární vs. referenční laboratoři (klinicky významná falešná negativita primárního vyšetření nepřesahovala 4 % případů), ale rovněž byla identifikována podskupina 3,4 % pacientek s velmi specifickým fenotypem IHC-/ISH+. Projekce těchto nálezů na celou populaci každoročně diagnostikovaných nádorů ukazuje, že takto by bylo možné nově zachytit až 275 pacientek, které mají šanci profitovat z biologické anti-HER2 cílené terapie. Zastoupení pacientek s nádory IHC-/ISH+ není natolik vysoké, aby bylo efektivní testovat pomocí ISH všechny karcinomy prsu bez ohledu na výsledek IHC, nebo současné testování pomocí IHC zcela nahradit in situ hybridizací. Nádory splňující výše uvedená kritéria jsou v současné době v rámci prospektivního pilotního projektu i přes imunohistochemickou negativitu standardně vyšetřovány v referenčních laboratořích pomocí in situ hybridizace. Všichni patologové provádějící primární imunohistochemická vyšetření byli požádáni, aby k verifikaci do referenční laboratoře poslali nejen nádory IHC2+ nebo 3+, jak je současným standardem, ale též všechny nádory IHC negativní (0,1+), pokud současně splňují obě uvedená kritéria: 1. morfologie jiná než lobulární, tubulární či mucinózní (tedy zejména duktální, papilární a případně jiné vzácnější typy); 2. negativita estrogenových či progesteronových receptorů, případně obou. Pokud se i v rámci prospektivního vyšetřování potvrdí data z projektu HERretest, bude navržena změna standardního algoritmu pro vyšetřování HER2.


O autorovi: Prof. MUDr. Aleš Ryška, Ph. D.
Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Hradec Králové, Fingerlandův ústav patologie

e-mail: ryskaale@fnhk.cz

Ohodnoťte tento článek!