Histomorfometrie a kostní biopsie

Histomorfometrie je histologická metoda, umožňující provádět kvantifikaci, resp. matematickou veličinou popsat jednotlivé složky mikroskopického obrazu. Komponentu lze popsat absolutními hodnotami nebo je možné stanovit její procentuální zastoupení v mikroskopickém vzorku, např. procento, které tvoří plocha trabekulární kostí z celkové plochy kostní…

MUDr. Jiří Žák

Univerzita Karlova v Praze, 1. LF UK a VFN, Geriatrická klinika

Klíčová slova

histomorfometrie • kostní biopsie • remodelace kosti

Histomorfometrie

Histomorfometrie je histologická metoda, umožňující provádět kvantifikaci, resp. matematickou veličinou popsat jednotlivé složky mikroskopického obrazu. Komponentu lze popsat absolutními hodnotami (u kostní spongiózy například šířku jediné trabekuly v mikrometrech) nebo je možné stanovit její procentuální zastoupení v mikroskopickém vzorku (např. procento, které tvoří plocha trabekulární kostí z celkové plochy kostní dřeně, tzv. trabekulární objem). Základním principem histomorfometrické metody je promítnutí kalibrovaného rastru – síťky (umístěného např. v okuláru mikroskopu) na zobrazený histologický obraz. Jsou-li známy základní parametry rastru (vzdálenost jednotlivých čar od sebe), je možno podle průsečíků daného typu rastru vypočítat plochu pozorované obrazové části nebo její obvod (Obr. 1).

Při odečítání histomorfometrických parametrů se využívá De Lesseho pravidla, které udává, že na řezu anizotropního materiálu je poměr pozorovaných ploch úměrný jejich objemům. De Lesse byl geolog a svůj poznatek publikoval už v r. 1847. Tedy z obvodů pozorovaného objektu se usuzuje na jeho plochy a z ploch v obraze mikroskopu na skutečné objemy.

Moderní laboratoře jsou vybaveny poloautomaticky nebo automaticky pracujícími počítačovými systémy, hodnotícími mikroskopický obraz. Při první metodě je mikroskopický obraz promítán na obrazovku počítače a pozorovatel sám, pomocí grafického zařízení, obkresluje plochy nebo obvody, určené k vyhodnocení, které vypočítává dál sám počítač. U automatických systémů je mikroskopický obraz snímán kamerou v okuláru. Pozorovatel má možnost obraz event. upravovat tak, aby stanovená data počítač zhodnotil správně podle příslušného (kostního) programu.

Předpokladem pro pochopení smyslu měřených dat je znalost základních principů obnovy kostní tkáně, kostní remodelace. Zde podáme jen jejich krátký nástin.

Remodelace kosti

Především na podkladě genetických vloh jsou vytvářeny tvar a velikost kostí a jejich sycení minerálem, obsahujícím vápník. Tento děj se nazývá modelace a buňky, které se ho účastní, jsou osteoklasty a osteoblasty. Důležitým rysem tohoto období je zisk kostní hmoty. Ve věku 25 až 35 let má fyziologicky skelet nejvyšší obsah kostní hmoty i minerálu a z tohoto hlediska bývá tento stav skeletu označován jako období maximální kostní hmoty (peak bone mass). Období modelačního finále se prolíná s nástupem odlišného procesu, který se pak uplatňuje po celý další život – kostní remodelace. Remodelace je však proces, který výši získané kostní hmoty neudrží. Naopak. Ročně všichni ztrácíme kolem 0,5–0,75 % kostní hmoty. Je to důsledek neúplně účinné osteo blastické apoziční činnosti. Jak k tomu dochází?

Na Obr. 2 je znázorněno, jak v mikroskopickém prostoru (desítky až stovky mikrometrů), po nejasných podnětech, v určitém místě na povrchu kostních struktur proliferují a diferencují z hematologické monocytární řady buňky, které se diferencují až do zralého a funkčně zdatného osteoklastu. Osteoklasty resorbují kost a po vyhloubení a odstranění určité kostní masy navazuje na tuto fázi remodelace období proliferace a diferenciace původní mezenchymální buňky směrem k vyzrálým osteoblastům, které pod sebe produkují nezralý osteoid, jehož většinovou součástí je kolagen typu I. Ten teprve postupně, s odstupem času, mineralizuje. Znamená to, že se do něj ukládají ploché krystaly vápník obsahujícího hydroxyapatitu. Plnohodnotná kost pak plní příslušné funkce.

Apozice však bývá mírně deficitní. Vede to k výše zmíněnému snižování hmoty kosti. Některé změny, které přináší kostní metabolismus, fyziologické známky stárnutí i změny patologické lze vyčíst z histologických vzorků pomocí morfometrie. K odečtu příslušných parametrů je třeba zpracovat odebraný kostní vzorek.

Technika kostní biopsie

Vzorky se odebírají nekropsií nebo biopsií. Oba způsoby by měly odebírat kostní vzorek, určený k morfometrickému hodnocení, z jedné anatomické lokalizace. Je to vertikální, nebo lépe transverzální odběr z lopaty kyčelní kosti (tedy kolmo k lopatě kyčelní kosti) za spina illica anterior superior. Transiliakální odběr poprvé popsal Bordier(1). Místo odběru je 2 cm pod hřebenem lopaty a 2 cm za uvedeným místem (Obr. 3). Vzorek z místa posunutého o 1,5 cm mimo tento bod většinou už obsahuje odlišnou strukturu trabekulární kosti a histomorfometrická měření také zjišťují rozdílné hodnoty některých parametrů od parametrů zjištěných ve vzorcích, odebraných ze standardního místa.

Výkon je prováděn po krátkodobém podání hypnotika i.v. nebo v lokální anestézii. Trepan má průměr vnitřního lumen 7,5 mm. Menší průměry trepanů mohou někdy vést k odběru vzorků, které se při dalším zpracování mohou potrhat, což kazí kvalitu odečtu hledaných dat.

Mezi komplikace takto prováděné kostní biopsie patří lokální hematomy, ojediněle zánět, neuropatie. Bolest trvá přibližně 2 dny. Komplikace se vyskytují na různých pracovištích s různou, vždy jen máloprocentní frekvencí(2).

K účelu morfometrie se odebraný cylindr kostní tkáně musí zpracovat tak, aby se architektonika a stavební poměry vzorku neměnily. Nelze tedy vzorek odvápnit, protože při odvápnění dochází k distorzi stavby. Odebraný vzorek kosti se konzervuje v 70% alkoholu. Poté se vzorek odvodňuje alkoholem postupně stále vyšší koncentrace, a pak se vzorek kosti zalévá do tekutého metyl-metakrylátu, který pomalu (dny) prostupuje tkání a tuhne do tvrdosti kosti. To je velmi důležité pro proces krájení vzorku. Speciální nůž (tungsten-karbidové ostří nebo nůž se skleněným či diamantovým ostřím) krájí v podstatě homogenní těleso, kost je nedekalcifikovaná a nedeformovaná, vhodná k histomorfometrii.

Histomorfometrické parametry

V kostní tkáni se histomorfometrií odečítají rozdílné skupiny parametrů. Primární parametry je možno odečíst ze vzorku přímo (změřit). Sekundární parametry se pak vypočítávají z primárních podle logiky výstavby kostní tkáně. Odečítané parametry se rozdělují také podle modalit, které vystihují, např. ty, které popisují strukturu (mikroarchitekturu trabekulární kosti), formaci kosti (statické a dynamické parametry) nebo resorpci (Tab. 1).

Dynamické parametry určují např. rychlost mineralizace zkoumané kosti. Podáme-li kandidátovi biopsie s odstupem několika dní parenterálně nebo per os látku, která se akumuluje do kosti v aktivní mineralizační zóně tak, že je možno ji v mikroskopickém preparátu detekovat, pak ze vzdálenosti obou mineralizujících čar lze vypočítat rychlost mineralizace (Obr. 4). Takovou látkou je např. tetracyklin. Schémata jeho podávání jsou různá, např. první podání demetylchlortertracyklinu (150 mg po 6 hodinách) nebo hydrochlorid tetracyklinu (250 mg po 6 hodinách) po 2 dny p.o., pak 10–12denní pauza a znovu tetracyklin ve stejných dávkách po 2 až 4 dny. Biopsie pak následuje po 2–4 dnech. Tetracyklinové linie fluoreskují v mikroskopu v ultrafialovém světle.

Zvláště při odečítání dynamických parametrů si musíme uvědomit, že získávaná čísla jsou výsledkem akce buněk v rámci remodelace. Apoziční obrat (MAR) je např. odrazem rychlosti osteo blastické syntézy a následné mineralizace. Tetracyklinem značený povrch (LS) ukazuje na zóny, které byly v době oněch dvou až čtyř dnů podávání tetracyklinu právě ve fázi aktivní mineralizace. Zastihne-li se jen jedna čára, pak to znamená, že mineralizace probíhala právě jen při prvním nebo druhém podávání tetracyklinu. Jestliže je znám rozsah právě probíhající mineralizace (LS) a rychlost, kterou mineralizace probíhá (MAR), pak vynásobením těchto dvou parametrů získáme číslo ukazující na obrat novotvorby kosti (BFR). Když tuto hodnotu BFR poměříme naměřenou hodnotou šířky nově vzniklé strukturální jednotky W.Th, tedy BFR/W.Th (wall thickness, pozor nejde o šířku trabekuly Tb.Th), zjistíme, jak dlouho trvala tato výstavba. Jednotkou je vypočítané číslo za den. Jinak: čím vyšší je získaná hodnota, tím vyšší je frekvence nově vzniklých míst, kde dochází k remodelaci. Získaný parametr se nazývá aktivační frekvence(1). Přehled o základních používaných parametrech a jejich roztřídění podává Tab. 1(3).

Význam a indikace ke kostní biopsii

Histologický obraz a histomorfometrické měření je jedinou metodou, která umožňuje nahlédnout na kvalitu kostní tkáně a kvantifikovat ji tak, aby bylo možno vzorky porovnávat a zařazovat do diagnostických kategorií nebo porovnávat hodnotitelnou změnu před a po určité léčbě. K tomu je ovšem nutné mít dostatek vzorků. Jinak se pohybujeme jen v oblasti odhadů. Máme-li např. posoudit účinek léku jako statisticky významný, pak parametr trabekulárního objemu BV/TV se u jedince musí změnit za sledované období o 29 %, aby změna byla významná. Máme-li však k dispozici 10 vzorků kostní tkáně, musí se pozorovaný parametr před léčbou a po ní lišit už jen o 10 %. U 20 vzorků stačí nalézt už jen 7% změnu BV/TV, abychom mohli říci, že účinek léku je statisticky významný. Kostní biopsie je dodnes jedinou metodou umožňující získat představu o metabolické aktivitě kostní tkáně na buněčné a histologické úrovni. Umožňuje zjistit hodnoty obratu kostní formace, aktivační frekvenci a informace o resorpci i mineralizaci.

Dnes je řada diagnostických rentgenových i biochemických metod, kterými lze stanovit přesnou diagnózu osteopatie. Z hlediska kliniky je kostní biopsie výhodná již jen v málo situacích. Často bývá bioptována lopata kyčelní kosti u dialyzovaných nemocných. Jejich kost může trpět akumulaci aluminia, které se dá histochemicky (aurin-trikarboxylovou kyselinou) ve vzorku prokázat. Taková kost jeví známky nízkého formačního obratu. Nemocný pak může být adekvátně léčen. Někdy se u těchto renálně nemocných naopak najdou známky vysokého kostního obratu (vysoký MAR, LS, BFR) a známky fibrózní přestavby kosti jako histologická reprezentace terciární hyperparatyreózy a nález se stává podporou pro další léčbu, tentokrát cílenou k odstranění zvětšeného příštítného tělíska. Jinak výsledek kostní biopsie pomáhá k diagnóze atypicky probíhajících osteoporóz i osteomalacií nebo jejich kombinací (Tab. 2). V současné době se histomorfometrie používá často výzkumně, např. při sledování histologických změn v kostní tkáni po léčbě nově zaváděnými léky, jako např. bisfosfonáty nebo modulátory estrogenových receptorů(4).

Literatura

1. BORDIER, P., MATRAJT, H., MIRAVET, L., HIOCO, D. Mesure histologique de la masse et de la résorption des travées osseuses. Pathol Biol, 1964, vol. 14, p. 1238–1243.

2. ŽÁK, J., POVÝŠIL, C. Histomorfometrie v klinické praxi a výzkumu. Sborník lék, 1995, 96, s. 240.

3. CHAVASSIEUX, P., ARLOT, M., MEUNIER, PJ. Clinical use of bone biopsy. In MARCUS, R., FELDMAN, D., KELSEY, J. (Eds). Osteoporosis. Academic Press, 1996.

4. RECKER, RR. Bone Biopsy and Histomorphometry in Clinical Practice. In Primer of Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. 3rd ed., Lippincott-Raven. 1996.

e-mail: jiri.zak@lf1.cuni.cz

Ohodnoťte tento článek!