Histondeacetylázy a jejich inhibitory

Inhibitory histondeacetyláz v dnešní době představují slibné sloučeniny pro možné využití v terapii jak hematologických, tak solidních malignit. Jedná se o chemicky strukturně odlišné látky, které spojuje schopnost inhibovat enzymovou aktivitu histonových deacetyláz, čímž způsobují rozvolnění terciární struktury chromatinu a umožňují přístup transkripčních faktorů.

Zároveň jsou schopny acetylovat celou řadu nehistonových cílů, zejména těch, které mají rozhodující význam pro zástavu buněčného cyklu a indukci apoptózy. První z inhibitorů histondeacetyláz, kyselina suberoylanilid hydroxamová (SAHA), byla v roce 2006 uznána americkým Úřadem pro kontrolu léčiv a potravin (Food and Drug Administration, FDA) jako lék pro terapii kožního T-buněčného lymfomu. Tento článek shrnuje dosavadní poznatky o mechanismu protinádorového účinku inhibitorů histondeacetyláz použitých jak samostatně, tak v kombinaci, a jejich možné perspektivy a použití v terapii.

Klíčová slova

inhibitory histondeacetyláz * apoptóza * protein p53 * nádorová onemocnění

Abstract

Histone deacetylases inhibitors A variety of compounds with histondeacetylases inhibitory activity have been identified, they can be divided in four groups according to their chemical structure. Histone deacetylases inhibitors represent a promissing agens in the therapy of leukemias as well as solid tumors. By influencing acetylation status of nuclear histones they significantly affect tertiary structure of DNA: as deacetylated histones are compact, inaccesible to transcription factors, HDAC inhibitors make chromatin structure more open and susceptible to transcription.

Not only acetylation status of histones is affected by HDACi, also non-histone proteins (mainly those involved in cell cycle regulation and apoptosis induction) represent substrates for HDACi. HDACi could be convenient for combination therapy, because they have radiosensitizing effects and additive effects when used with other chemoterapeutics (as demethylation or differentiation agens). In 2006, FDA has recognise first HDACi (suberoylanilide hydroxamic acid) for the therapy of cutaneous T-cell lymphoma.

Key words

histone deacetylases inhibitors * apoptosis * protein p53 * tumorous diseases

Genetický a epigenetický aparát buňky

Schopnost buňky reagovat na změny ve vnějším a vnitřním prostředí je dána souhrou genetického a epigenetického aparátu. Genetický aparát tvoří sekvence nukleotidů v DNA – DNA kód. Epigenetický aparát je tvořen histonovým kódem, tj. souborem minimálně osmi specifických kovalentních modifikací na histonových koncích, a metylací DNA.

Epigenetický aparát řídí strukturu chromatinu bez změny sekvence DNA, a tím ovlivňuje expresi genů, zejména těch, které hrají důležitou roli při transkripci, replikaci a reparaci DNA.(1) DNA eukaryotického jádra je kondenzována do vysoce organizovaného chromatinu. Základní strukturní jednotkou chromatinu je kulovitá částice – nukleosom – o průměru 10 nm.

Obsahuje 146 párů bazí, které vytváří 1,75 levotočivých nadšroubovicových závitů DNA kolem proteinového jádra. Jádro má strukturu oktameru, skládá se vždy ze dvou stejných molekul čtyř různých typů jaderných bílkovin – histonů. Histony H2A a H2B jsou bohaté na lysin a vytvářejí dimery, které se spojují ve větší oligomerní komplexy. Histony H3 a H4 s vysokým obsahem argininu vytvářejí tetramery (Obr. 1).

Struktura histonů je sice mezidruhově značně konzervativní a jejich funkce u všech eukaryontů stejná, ale chromosomální distribuce jednotlivých modifikací se může měnit jak během buněčného cyklu, tak mezi skupinami eukaryont. Histon H1 je obsažen v chromatinu v přibližně polovičním množství než ostatní typy histonů a není součástí centrálního oktameru, nachází se ve vnější části nukleosomů.

K chromatinu se váže nejslaběji, lze ho snadno extrahovat solným roztokem a chromatin se pak stává rozpustným. Sestavení nukleosomu je pravděpodobně zprostředkováno aniontovým jaderným proteinem nukleoplazminem. Nukleosomy se dále skládají do vyšších struktur chromatinu, které jsou poměrně dynamické – procházejí značnými změnami, které vedou k aktivaci nebo represi transkripce.

Na silně bazických amino-terminálních částech histonů probíhá celá řada různých modifikací: acetylace, fosforylace, metylace, ADP-ribosylace, ubikvitinylace, sumoylace, karbonylace, glykosylace, deiminace a izomerizace prolinu. Vazebných míst, kde tyto modifikace probíhají, je několik desítek a jejich funkce se vysvětluje dvěma způsoby. Prvním je prosté narušení kontaktu mezi nukleosomy, což vede k rozvolnění struktury chromatinu, druhým pak zprostředkování vazby nehistonových proteinů přes specifické domény; konkrétně u acetylace je to přes bromodomény.(2)

Z uvedených modifikací je nejlépe prozkoumaná acetylace – probíhá na lysinových zbytcích, např. lysin 8, 12 a 16 na histonu H4, lysin 9, 14 a 23 na histonu H3, a to pomocí tří hlavních skupin acetyltransferáz (GNAT, MYST, CBP/p300). Ze všech modifikací právě acetylace má největší schopnost rozvolňovat chromatin, protože neutralizuje kladný náboj bazických lysinů.

Stupeň acetylace jaderných histonů je dán poměrem aktivit opačně působících enzymů ze skupiny histonacetyltransferáz – HAT a histondeacetyláz – HDAC. Oba typy enzymů působí na cílové geny v komplexu se sekvenčně specifickými transkripčními faktory a jejich kofaktory, např. N-CoR, Sin3, SMRT u HDAC.(3) Zvýšení acetylace histonů je spojeno s vyšší transkripční aktivitou a obecně je acetylace důležitým mechanismem, kontrolujícím uspořádání chromatinu a genové regulace.

Obr. 1 – Struktura nukleosomu

Histondeacetylázy

Jako acetylom označujeme komplex v buňce přítomných HDAC, které regulují řadu procesů a přispívají k udržení specifických buněčných funkcí.(4) HDAC katalyzují deacetylaci aminoskupiny lysinů v N-terminální části jaderných histonů. V současné době je známo 18 histondeacetyláz, které rozdělujeme do 3 skupin na základě jejich homologie s proteiny kvasinek.

Skupinu HDAC I tvoří především jaderné proteiny homologní s proteinem kvasinek Rpd3 a zahrnují HDAC 1, 2, 3 a 8 o molekulové hmotnosti 22-55 kDa. Skupina HDAC II, která putuje mezi jádrem a cytoplazmou, je homologní s HDA1 v kvasinkách a zahrnuje HDAC 4, 5, 6, 7, 9 a 10. Podle struktury deacetylační domény rozdělujeme tuto skupinu na 2 podtřídy IIa a IIb.

Podtřída IIa zahrnuje HDAC s jednou hlavní deacetylační doménou, zatímco deacetylázy podtřídy IIb mají dvě domény s různou afinitou k substrátům. Jejich molekulová hmotnost se pohybuje od 120 do 130 kDa.(5) Skupina HDAC III zahrnuje NADH závislou Sir rodinu deacetyláz, která je rezistentní vůči inhibici trichostatinem A, suberoylanilid hydroxamovou kyselinou a kyselinou valproovou (VA).

Naopak třídy I a II HDAC obsahují v katalytické doméně Zn2+ a vůči jmenovaným agens jsou citlivé.(6) Vysoce specifický inhibiční účinek na histondeacetylázy je dán schopností těchto sloučenin zapadnout do enzymové kapsy HDAC třídy I a II a tvorbou komplexů se Zn2+ ionty.(7) Knock-out analýzy různých typů HDAC ukazují, že HDAC ze skupiny I hrají roli v buněčném přežití a proliferaci, zatímco HDAC skupiny II mají tkáňově specifickou roli. Samostatnou skupinu pak vytváří HDAC 11 (skupina IV), ta má v katalytickém centru znaky jak třídy I, tak třídy II histondeacetyláz.

HDAC 1, 2, 3, 5, 6, 7 a 10 se víceméně nachází ve všech zkoumaných tkáních, zatímco HDAC 4, 8 a 9 jsou přednostně exprimovány v nádorových buňkách. Různé inhibitory se liší svou afinitou vůči jednotlivým podtypům HDAC, zatím se neprokázalo, zda je výhodnější používat specifický inhibitor spíše než pan-inhibitor.(8) Inhibitory histondeacetyláz na základě chemické struktury rozdělujeme do 4 základních skupin:(9)

* mastné kyseliny s krátkým řetězcem (butyrát, fenylbutyrát, fenylacetát, kyselina valproová), * syntetické deriváty benzamidu (MS-275, CI-994, N-acetyldinalin), * cyklické tetrapeptidy (trapoxin, apicidin), * hydroxamové kyseliny (trichostatin A, SAHA).

Inhibitory HDAC regulují přibližně 2 % genů, a to především geny ovlivňující buněčný cyklus, apoptózu a DNA syntézu. V zástavě buněčného cyklu a růstu, diferenciaci a apoptóze hraje hlavní roli regulace transkripce, která je proto ovlivňována velkým množstvím faktorů. Jedním z nich je právě terciární struktura DNA, která je určující pro přístup transkripčních faktorů k jejich cílovým segmentům, a tím pro průběh transkripce.

HDAC jsou klíčové pro procesy, jako jsou buněčné přežití, proliferace a diferenciace. HDACi v nádorových buňkách indukují zástavu buněčného cyklu, zástavu růstu, diferenciaci a/nebo apoptózu. Jsou spojovány s inhibicí jak vaskulární, tak lymfatické angiogeneze a inhibicí reparace DNA poškození po chemoterapii a radioterapii. Všechny tyto účinky zaznamenané na nádorových buňkách jsou minimální u buněk zdravých.

Účinnost HDACi se předpokládá pro celou řadu solidních nádorů i hematologických malignit.(4) Antitumorózní aktivita HDACi nevychází pouze z jejich schopnosti regulovat acetylaci histonů, ale zahrnuje i jiné funkce včetně acetylace nehistonových proteinů, jako jsou p53, E2F, retinoblastoma protein a další. Do dnešní doby bylo identifikováno více než 50 nehistonových proteinů, které jsou substráty pro HDAC.(6)

Rovněž modifikace těchto substrátů jsou zahrnuté v rozličných procesech, jako jsou regulace transkripce, proteinová degradace, umlčení genů, DNA oprava a průběh buněčného cyklu.(10) Další z hypotéz je, že HDACi mohou reaktivovat tumorsupresorové geny, jejichž aktivita byla v průběhu neoplastických transformací utlumena, např. gen CDKN1A, který kóduje CDK inhibitor p21.(9)

Vnější a vnitřní cesta apoptózy, protein p53 a p21 a jejich ovlivnění HDACi

Apoptóza

Je snahou ovlivňovat citlivost nádorů a normálních buněk k protinádorovým látkám tak, aby došlo ke zvýšení účinnosti léčby a snížení toxicity na normální tkáně. Snížená schopnost nádorových buněk umírat v určitém čase apoptózou je jeden z faktorů, který se podílí na vzniku nádorů. Apoptóza je řízená buněčná smrt, která nevyvolává destruktivní zánětovou reakci.

Její podstatou je proteolýza intracelulárních bílkovin pomocí kaspáz „cytosolic aspartate-specific cystein proteases“. Kaspázy jsou syntetizovány jako inaktivní proenzymy a samy mohou být aktivovány proteolytickým štěpením na specifických aspartátových reziduích. Dělíme je na kaspázy iniciátorové (8, 9, 10) a efektorové.(3, 6, 7) Iniciátorové kaspázy mohou být aktivovány pomocí dvou odlišných cest – tzv. vnitřní a vnější apoptotické cesty.

Vnější cesta se spouští aktivací receptorů smrti (CD 95; CD 120 a TRAIL), které patří do rodiny receptorů TNF. Navázání ligandu na povrchový receptor je spojeno s funkčními a morfologickými změnami. Dochází ke konformačním změnám C-konců receptorových molekul, které vedou k oligomerizaci a vzniku makromolekulárních komplexů. Na tyto komplexy se přímo váže iniciační proteináza kaspázové kaskády vnější cesty, kaspáza 8. Aktivní kaspáza 8 pak štěpí mnoho dalších substrátů, především prokaspázu 3, která je hlavní efektorovou proteinázou apoptózy.

Vnitřní cesta apoptózy je spouštěna na základě signálů z vnitřního prostředí buňky, jako jsou např. volné radikály, anoxie, působení virů a cytostatik. Nejčastějším iniciátorem je ovšem poškození DNA a následná aktivace proteinu p53. Klíčovým momentem vnitřní cesty je zvýšení permeability mitochondriálních membrán. Pro transmembránový potenciál mitochondriální membrány je určující poměr antia proapoptoticky působících proteinů.

Proapoptotické faktory patří k rodině Bcl-2 (Bax, Bad, Bim, Bid) a nachází se v cytosolu. Na mitochondriální membráně jsou pak kanálové antiapoptotické proteiny Bcl-2, Bcl-x a Mcl-1. Po přijetí smrtícího signálu dojde ke strukturním změnám, proa antiapoptotičtí členové se setkávají na povrchu mitochondrií a tvoří homoa heterodimery.

Při převládnutí proapoptotických faktorů se změní permeabilita membrány, což způsobuje nabobtnání mitochondrií. Nabobtnání je výraznější u vnitřní membrány, která následně způsobí ruptury vnější membrány a porušení respiračního řetězce s uvolněním cytochromu c z intermembránového prostoru. V cytosolu cytochrom c vytváří spolu s Apaf-1 a kaspázou 9 komplex apoptosom, který aktivuje hlavní efektorovou kaspázu 3. Aktivace kaspázy 3 je sjednocujícím bodem vnitřní a vnější cesty apoptózy. Aktivní kaspáza 3 je zodpovědná za vlastní apoptotický proces. Amplifikuje činnost iniciačních proteináz a podílí se významně zejména na jednom z prvních jevů apoptózy, na fragmentaci DNA.

Po kliknutí se obrázek zvětší!

Obr. 2 – Nejdůležitější buněčné signální dráhy spuštěné po aktivaci proteinu p53

Protein p53

Hlavní aktivátor vnitřní apoptotické cesty, protein p53, je transkripční faktor a tumor supresorový protein, tzv. strážce genomu (Obr. 2). Je lokalizovaný v jádře, kde kontroluje proliferaci a smrt buňky. Ztráta funkce p53 se považuje za klíčovou v rozvoji rakoviny. Zabraňuje buňkám s poškozenou DNA, aby se dělily, a tak udržuje stabilitu genetické informace.

Hladina p53 signifikantně vzrůstá v odpovědi na poškození DNA, aktivaci onkongenů a hypoxii. Ovlivňuje transkripci celé řady proteinů, hlavními výsledky jeho aktivace jsou:* zástava buněčného cyklu v G1/S fázi (přes protein p21),* zástava buněčného cyklu v G2/M fázi (přes 14-3-3), * indukce apoptózy při neschopnosti buňky opravit poškození (aktivací proteinů BAX, PUMA, NOXA).

Zástava buněčného cyklu poskytuje čas pro reparaci DNA poškození. Při něm dochází k aktivaci proteinu p53 fosforylací na různých místech různými kinázami. Aktivovaný protein p53 zvyšuje expresi proapoptotických cytosolických faktorů PUMA, NOXA a BAX. Protein p53 je důležitý transkripční faktor, jeho aktivací dochází k indukci nebo inhibici exprese více než 150 genů. Protein je kódovaný genem TP53 lokalizovaným na chromosomu 17.

Skládá se z 393 aminokyselin (AK), které tvoří 7 domén: N-terminální transkripčně-aktivační doména (TA1) aktivuje transkripční faktory. Druhá aktivační doména (TA2) je důležitá pro apoptotickou aktivitu p53, stejně jako třetí doména bohatá na prolin. Největší část tvoří centrální DNA vazebná doména (DBD), tou se protein p53 jakožto transkripční faktor váže na p53-responzívní úseky DNA a spouští transkripci p53 závislých genů. Pro aktivitu p53 in vivo je nutná tetramerizace proteinu, zajišťovaná homo-oligomerizační doménou. C-terminální doména snižuje vazbu p53 na DNA (Obr. 3).

Přes 50 % všech nádorových onemocnění je spojeno s mutací proteinu p53, přičemž obvykle je postižena DBD doména. K inaktivaci genu p53 dochází zejména v důsledku malých mutací (missense a nonsense mutace, inzerce/delece několika nukleotidů), které vedou jednak k expresi mutantního proteinu (90 % případů) nebo nepřítomnosti proteinu (10 %).

V mnoha nádorech, zejména sarkomech, je pozorována abnormální akumulace proteinu Mdm2. Inaktivace p53 patří ke klíčovým událostem při transformaci buňky DNA viry, např. SV40 se váže do DNA vazebné domény p53 a znemožňuje vazbu na p53 na DNA. Stejně je tomu u Li Fraumeniho syndromu, což je vrozená predispozice ke vzniku nádorových onemocnění způsobená heterozygotní mutací v TP53, právě v místě DBD.

V jádře je p53 udržován na nízké hladině díky negativnímu regulátoru Mdm2 , který způsobuje ubikvitinylaci p53 (má E3 ubikvitin ligázovou aktivitu), export p53 z jádra a jeho následnou degradaci pomocí proteasomu.(11) Vzájemnou interakci p53 a Mdm2 výrazně ovlivňují posttranslační modifikace obou proteinů. U p53 dochází k modifikacím na minimálně 18 místech, a to zejména v N-terminální části, kterou tvoří cca 100 AK, a v C-terminální části (cca 90 AK).

N-konec je především fosforylovaný, tyto fosforylace jsou důležité pro stabilizaci p53 a klíčové pro acetylaci p53, což v kombinaci vede k plné p53-zprostředkované odpovědi na genotoxický stres. Na C-konci dochází k fosforylacím, acetylacím a sumoylacím. Modifikace na C-konci inhibují schopnost této domény negativně regulovat sekvenčně specifickou vazbu na DNA, navíc ovlivňují stabilitu, oligomerizaci, jaderný import/export a stupeň ubikvitinylace p53.

Uvedené posttranslační modifikace vznikají v reakci na působení různých faktorů a vedou ke zvýšené stabilitě p53 (brání vazbě s Mdm2) a zvýšené transkripční aktivitě. Acetylační místa K373/382 jsou stejná jako vazebná místa pro Mdm2, takže p53 acetylace výrazně prodlužuje poločas p53 a snižuje jeho ubikvitinylaci.(12) Protein Mdm2 interaguje s HDAC1 a dohromady tak zajišťují efektivní spojení deacetylačních a ubikvitinylačních pochodů, které vedou k negativní regulaci funkce p53. Acetylace p53 probíhá pomocí p300 a CBP acetyláz.

Dalším důležitým důsledkem acetylace p53 je posílení vazby na p53 cílové geny, včetně p21, což u nich zvyšuje transkripční aktivitu po DNA poškození.(12) Deacetylace p53 probíhá pomocí Sir2, který tím pádem slouží jako inhibitor transkripční a proapoptotické aktivity p53 v odpovědi na poškození DNA.

Protein p53 reguluje expresi genů zahrnutých v odpovědi na buněčný stres, v zástavě buněčného cyklu nebo v indukci apoptózy. Má důležitou roli pro aktivaci p21; při indukci p53 pomocí DNA poškozujících agens vyústí v náhradu HDAC1 za tumor supresor na C-konci transkripčního faktoru Sp1, zvýší acetylaci histonů u p21 promotoru, a tím vyvolá transkripční aktivaci p21 genu.

Protein p21

Protein p21 (také inhibitor cyklin dependentní kinázy 1A – CDKN1A) inhibuje aktivitu cyklin-CDK2 a cyklin-C8 CDK4 komplexů, čímž vyvolává zástavu buněčného cyklu v G1/S fázi a umožní opravu poškození DNA. Inhibitory HDAC indukují transkripci proteinu p21 přes akumulaci acetylovaných histonů spojených s promotorem a kódujícími oblastmi genu CDKN1A.(13)

Exprese p21 je kontrolována tumor supresorovým proteinem p53, p21 promotor obsahuje 5 vazebných míst pro p53. Inhibitory HDAC však působí zesílenou expresi p21 jak p53-závislým, tak p53-nezávislým mechanismem a v této aktivaci jsou zahrnuty další četné faktory. Zdá se, že hlavní cesta indukce p21 po působení HDACi je p53-nezávislá a probíhá aktivací Sp1/Sp3 cesty.

Promotor p21 obsahuje 6 Sp1 vazebných míst. Proteinová rodina Sp má u lidí 4 členy: Sp1-Sp4; jedná se o transkripční faktory, které se váží pomocí zinc-finger domén na sekvence DNA bohaté na GC. Při poškození DNA se protein p53 váže přímo na Sp1 místo, na oblast, kde kompetuje o vazebné místo s HDAC1.

Po terapii HDACi je HDAC1 uvolněna z Sp1 vazebného místa na p21 promotoru, což vede ke ztrátě represe a indukci transkripce p21. Kromě inhibice komplexů cyklin/CDK p21 zároveň blokuje replikaci DNA tím, že se váže na proliferační jaderný antigen (PCNA).

O toto vazebné místo kompetuje s DNA metyltransferázou1 (DNMT1), takže zvýšená DNMT1 exprese může vyvolávat disociaci p21 z PCNA. Protein p21 je specificky štěpen pomocí CASP3 like kaspáz, což vede k dramatické aktivaci CDK2. Má také antiapoptotické účinky, brání vstupu buňky do apoptózy, protože při translokaci z jádra do cytoplazmy tvoří komplex s kinázou regulující signál pro apoptózu 1 (Ask1).

Změny v HDAC u nádorových onemocnění

Strukturální mutace HDAC spojené s rakovinou jsou vzácné, zato častější jsou změny v expresi různých HDAC. Abnormální aktivita HDAC ústí v transkripční represi specifických tumor supresorových genů, což přispívá k tvorbě nádorů stejně jako inaktivace HAT. Zvýšení exprese odlišných typů histondeacetyláz je charakteristické v odlišných nádorech.

HDAC1 je zvýšena v nádorech prostaty a žaludku, HDAC2 v nádorech žaludku, HDAC3 u rakoviny plic. U myeloidní leukémie byla prokázána abnormální aktivita HAT a HDAC; např. acetyltransferázy p300 a CREB vazebný protein, které jsou obecně pokládány za nádorové supresory, mají narušenou funkci. Naopak PML/RARalfa fúzní proteiny tvoří komplexy s HDAC, a tak přispívají k útlumu cílových genů.(14)

Potenciální terapeutické účinky HDACi mají výjimečnou důležitost, protože dokáží indukovat protein p21 i cestou nezávislou na p53, přičemž právě mutace proteinu p53 je jednou z nejběžnějších změn pozorovaných u nádorů. Mutace v kódujících oblastech p21 zatím nejsou známé, na rozdíl od epigenetické inaktivace hypermetylací GC-bohaté oblasti promotoru v blízkosti iniciačního místa transkripce, která je běžně pozorovaná u lidských nádorů.

Inhibitory histondeacetyláz se zdají být vhodnými kandidáty zejména pro terapii leukemických onemocnění, protože právě u nich dochází ke vzniku specifických onkogenních fúzních proteinů, které umožňují vazbu histondeacetylázovým komplexům na promotory cílových genů a tyto události mohou tvořit hlavní krok v rozvoji leukémií.

HDACi v kombinaci

Inhibitory histondeacetyláz ovlivňují celou řadu signálních cest, mají četné biologické účinky a působí synergicky nebo aditivně s různými protinádorovými agens, jako jsou radiační terapie, chemoterapie, terapie diferenciačními agens a s mnoha dalšími. Radioterapie je široce používanou metodou pro léčbu různých typů nádorů, celosvětově se předpokládá, že 50 % pacientů s nádorovým onemocněním je ozařováno.(15)

Látka, která by zvýšila citlivost nádorových buněk vůči ionizujícímu záření bez ovlivnění zdravých buněk, by byla velmi vítaným příspěvkem v terapii. Doposud žádná taková látka nebyla schválena, i když mnohé sloučeniny se v preklinických studiích jeví nadějně. Mastné kyseliny s krátkým řetězcem in vitro zvýšily citlivost nádorových buněk tím, že ovlivňují jejich schopnost reparovat poškození DNA vyvolané ionizujícím zářením.

Jiné inhibitory HDAC pak zesilují radiací indukovanou apoptózu, zeslabují funkci DNA reparačních proteinů a zkracují G2/M blok vyvolaný radiací, což vede také ke zvýšené indukci apoptózy. Ionizující záření vyvolává celou řadu poškození v buňce. Z nich nejzávažnější představují dvojité zlomy DNA (DSB). Pokud selže jejich oprava, tak dochází k chromosomové nestabilitě a akumulaci mutací.

Při normálně fungujících kontrolních bodech buňka zastavuje svůj cyklus, čímž získá čas pro reparaci, nebo pokud je poškození neopravitelné, tak se spouští apoptóza. Při dalších defektech (např. mutaci p53) dochází postupně k akumulaci mutací a nádorovému zvrhnutí buňky. Mechanismus odpovědi na poškození DNA zahrnuje senzor, který rozpozná poškození, transdukční kaskádu a efektorové molekuly.

Na počátku v odpovědi na dvojité zlomy DNA stojí ATM kináza, která je aktivována přímo poškozením DNA. Je produktem ATM genu, který je mutovaný u lidského onemocnění ataxia telangiectasia. Jedná se o komplexní multisystémové onemocnění s predispozicí k malignitám. Hlavními cíli ATM kinázy jsou proteiny p53, Mdm2, checkpoint kináza 1 (ChK1), checkpoint kináza 2 (ChK2), breast cancer 1 protein (Brca1) a Nijmegen Breakage Syndrome protein (Nbs1).

Díky nim aktivace ATM zastavuje proliferaci a dává čas pro reparaci poškození. Jeden z prvních cílů fosforylovaných pomocí ATM kinázy je histon H2AX, nutný pro účinnou opravu poškození. Kontrolní bod G1/S fáze je řízený přes protein p53, ATM kináza ho aktivuje a stabilizuje, protože fosforylace p53 na serinu 15 brání vazbě s negativním regulátorem Mdm2. Aktivací checkpoint kináz 1 a 2 řídí kontrolní bod G2/M fáze. Aktivace BRCA1 pomocí ATM je nutná pro indukci některých genů, jako např. CDKN1A.

HDACi v klinické praxi

Jako první z inhibitorů HDAC se v praxi použil fenylbutyrát. U pacienta s četnými relapsy po terapii kyselinou retinovou došlo k remisi onemocnění po léčbě fenylbutyrátem. Nevýhodou je, že fenylbutyrát je po i. v. podání velice rychle odbouráván, a proto se musí podávat ve vysokých dávkách, přesahujících 400 mg/kg/den.(16)

Prvním inhibitorem HDAC, který americký Úřad pro kontrolu léčiv a potravin (Food and Drug Administration, FDA) uznal jako lék, byl v roce 2006 vorinostat neboli kyselina suberoylanilid hydroxamová pro terapii kožního T-buněčného lymfomu. SAHA silně indukuje apoptózu v lidských leukemických buňkách p53 nezávislou cestou, která je částečně regulovaná Bcl-2/Bcl-xL a p21.(17) SAHA vykazuje antitumorózní aktivitu jak u solidních, tak u hematologických malignit.

V současné době je 12 různých inhibitorů histondeacetyláz ve více než stovce klinických studií. Kyselina valproová, která je již 30 let používaná v klinické praxi jako antiepileptikum, prochází celou řadou zkoušek jako možné terapeutikum pro léčbu akutní promyelocytární leukémie a myelodysplastického syndromu, a to jak samostatně, tak v kombinační terapii např. s all-trans-retinovou kyselinou (ATRA) nebo demetylačními agens.(14)

Kyselina all-trans-retinová je základním diferenciačním agens a je používaná v terapii akutní promyelocytární leukémie, kdy vyvolává terminální diferenciaci APL blastů do zralých granulocytů. Fúzní onkoprotein PML-RARa se váže na promotory RA cílových genů a způsobuje jejich represi. Tyto fúzní proteiny působí ve formě komplexů, které obsahují kromě korepresorů SMRT a N-CoR také HDAC1.(18) V nepřítomnosti RA PML-RAR způsobuje vyšší kondenzaci chromatinu, který pak zůstává méně přístupný.

Proto terapie HDACi a RA odvrací blok diferenciace u APL blastů in vitro a indukuje remisi onemocnění in vivo tím, že inhibuje, resp. uvolňuje HDAC-RARalfa fúzní represorový komplex.(19) Warell et al. použili u pacientky s ATRA rezistentní promyelocytární leukémií fenylbutyrát sodný (PB). Leukemické buňky byly eliminovány z kostní dřeně po 23 dnech léčby, kombinací all-trans-retinové kyseliny a fenylbutyrátu došlo ke klinické a cytogenní remisi.(20)

Hyperacetylace histonů je spojena s diferenciací leukemických buněk, i když v různém rozsahu mezi pacienty, jak ukazují změny v morfologii blastů. Zároveň je patrný pokles nezralých buněk a současný nárůst buněk se specifickou enzymatickou aktivitou nebo s markery zralých buněk. Předpokládá se, že sekvenční podávání kyseliny all-trans-retinové po HDACi synergizuje odpověď blastů.

Klinická léčba inhibitorem histondeacetyláz indukuje hyperacetylaci cílových genů a může obnovit citlivost k antileukemickým účinkům ATRA u akutní promyelocytární leukémie. Podobná terapie by mohla být užitečná u jiných neoplastických onemocnění, která jsou spojena s onkogenní represí genové transkripce vlivem působení histondeacetyláz.(21) Zkoušky in vitro i in vivo probíhají s celou řadou jiných kombinací terapeutik, jako jsou TRAIL, antracyklinová antibiotika a další.

Epigenetické alterace představují v současnosti jednu z nejvíce zkoumaných oblastí v klinickém a preklinickém výzkumu myeloidních nádorů. Je to především z toho důvodu, že oproti genetickým aberacím je možné epigenetické změny farmakologicky zvrátit a tak obnovit funkci utlumených genů. Studium se zaměřuje především na dvě odlišné skupiny epigeneticky aktivních látek: inhibitory DNA metyltransferáz a inhibitory histondeacetyláz.

Tato práce vznikla za podpory výzkumného záměru MSM 0021620820.

Po kliknutí se obrázek zvětší!

Obr. 3 – Struktura proteinu p531Mgr. Darina Muthná, Ph. D., 1doc. MUDr. Martina Řezáčová, Ph. D., 1doc. MUDr. Alena Stoklasová, CSc., 2prof. RNDr. Jiřina Vávrová, CSc. 1Univerzita Karlova v Praze, Lékařská fakulta v Hradci Králové, Ústav lékařské biochemie 2Fakulta vojenského zdravotnictví Univerzity obrany, Katedra radiobiologie e-mail: zaskodovad@lfhk.cuni.cz


Literatura

1. TURNER, BM. Histone acetylation and an epigenetic code. Bioessays, 2000, 22, p. 836-845.

2. KOUZARIDES, T. Chromatin modifications and their function. Cell, 2007, 128, p. 693-705.

3. GLASER, KB. HDAC inhibitors: clinical update and mechanism-based potential. Biochem Pharmacol, 2007, 74, p. 659-671.

4. MENEGOLA, E., Di RENZO, F., BROCCIA, ML., GIAVINI, E. Inhibition of histone deacetylase as a new mechanism of teratogenesis. Birth Defects Res C Embryo Today, 2006, 78, p. 345-353.

5. de RUIJTER, AJ., van GENNIP, AH., CARON, HN., KEMP, S., van KUILENBURG, AB. Histone deacetylases (HDACs): characterization of the classical HDAC family. Biochem J, 2003, 15, p. 737-749.

6. DOKMANOVIC, M., MARKS, PA. Prospects: histone deacetylase inhibitors. J Cell Biochem, 2005, 96, p. 293-304.

7. DEUBZER, H., BUSCHE, B., RÖNNDAHL, G., et al. Novel valproic acid derivatives with potent differentiationinducing activity in myeloid leukemia cells. Leuk Res, 2006, 30, p. 1167-1175.

8. KHAN, N., JEFFERS, M., KUMAR, S., et al. Determination of the class and isoform selectivity of small-molecule histone deacetylase inhibitors. Biochem J, 2008, 409, p. 581-589.

9. ROSATO, RR., GRANT, S. Histone deacetylase inhibitors in clinical development. Cancer Biol Ther, 2003, 1, p. 30-37.

10. FU, M., WANG, C., ZHANG, X., PESTELL, RG. Acetylation of nuclear receptors in cellular growth and apoptosis. Biochem Pharmacol, 2004, 68, p. 1199-1208.

11. ULDRIJAN, S., KOTALA, V., VOJTĚŠEK, B. Regulace stability a aktivity nádorového supresoru p53. Chem Listy, 2002, 96, s. 145-149.

12. ZHAO, Y., LU, S., WU, L., et al. Acetylation of p53 at lysine 373/382 by the histone deacetylase inhibitor depsipeptide induces expression of p21(Waf1/Cip1). Mol Cell Biol, 2006, 26, p. 2782-2790.

13. RICHON, VM., SANDHOFF, TW., RIFKIND, RA. Histone deacetylase inhibitor selectively induces p21WAF1 expression and gene-associated histone acetylation. Proc Natl Acad Sci U S A, 2000, 97, p. 10 014-10 019.

14. KUENDGEN, A., LÜBBERT, M. Current status of epigenetic treatment in myelodysplastic syndromes. Ann Hematol, 2008, 8, p. 601-611.

15. KARAGIANNIS, TC., KN, H., EL-OSTA, A. The epigenetic modifier, valproic acid, enhances radiation sensitivity. Epigenetics, 2006, 1, p. 131-137.

16. GÖTTLICHER, M., MINUCCI, S., ZHU, P., et al. Valproic acid defines a novel class of HDAC inhibitors inducing differentiation of transformed cells. EMBO J, 2001, 20, p. 6969-6978.

17. VRANA, JA., DECKER, RH., JOHNSON, CR., et al. Induction of apoptosis in U937 human leukemia cells by suberoylanilide hydroxamic acid (SAHA) proceeds through pathways that are regulated by Bcl-2/Bcl-XL, c-Jun, and p21CIP1, but independent of p53. Oncogene, 1999,18, p. 7016-7025.

18. KOSTROUCHOVÁ, M., KOSTROUCH, Z., KOSTROUCHOVÁ, M. Valproic acid, a molecular lead to multiple regulatory pathways. Folia Biol (Praha), 2007, 2, p. 37-49.

19. FERRARA, FF., FAZI, F., BIANCHINI, A., et al. Histone deacetylase-targeted treatment restores retinoic acid signaling and differentiation in acute myeloid leukemia. Cancer Res, 2001, 61, p. 2-7.

20. WARRELL, RP. JR., HE, LZ., RICHON, V., et al. Therapeutic targeting of transcription in acute promyelocytic leukemia by use of an inhibitor of histone de-acetylase. J Natl Cancer Inst, 1998, 90, p. 1621-1625.

21. CIMINO, G., LO-COCO, F., FENU, S., et al. Sequential valproic acid/all-trans retinoic acid treatment reprograms differentiation in refractory and high-risk acute myeloid leukemia. Cancer Res, 2006, 66, p. 8903-8911.

Ohodnoťte tento článek!