Kmenové buňky a chronická kritická ischémie dolních končetin

Souhrn

Chronická kritická ischémie je nejtěžší formou ischemické choroby dolních končetin a tito pacienti mají výrazně sníženou kvalitu života. Přibližně 20 % pacientů s touto diagnózou není vhodných k endovaskulární ani chirurgické léčbě. Implantace kmenových buněk je novou slibnou metodou, která podporuje angiogenezi.
V publikovaných klinických pracích vedla k subjektivnímu i objektivnímu zlepšení stavu u pacientů s kritickou končetinovou ischémií. Tyto výsledky potřebují ověření randomizovaných placebem kontrolovaných studií na větších počtech pacientů.

Klíčová slova chronická kritická ischémie dolních končetin • kmenové buňky • kvalita života Summary

Skalicka, L. Stem cells and critical lower limb ischemia Critical limb ischemia is the worst stadium of peripheral arterial disease and patients suffering from it have a severely decreased quality of life. Up to 20% of critical limb ischemia patients are not suitable for endovascular or surgical treatment. Bone marrow derived stem and progenitor cells have been identified as a new potential therapeutic option to induce angiogenesis. Clinical benefits were reported in many clinical trials. These results should be verified by larger randomized placebo-controlled studies.

Key words chronic critical limb ischemia • bone marrow mononuclear cells • quality of life Pacienti s ischemickou chorobou dolních končetin (ICHDK) v klaudikačním stadiu mají zhoršenou kvalitu života a jsou ohroženi hlavně následky koronární nemoci a postižením karotických tepen. Chronická kritická ischémie je nejhorší manifestací ICHDK. Je definována jako klidová bolest v trvání minimálně dvou týdnů, vyžadující analgetika, a/nebo přítomnost defektu či gangrény. Za objektivní kritéria se považují kotníkové tlaky pod 50 mmHg nebo prstové tlaky pod 30 mmHg a/nebo hodnoty transkutánního tlaku kyslíku pod 30 mmHg. Incidence chronické kritické ischémie se odhaduje v Evropě a Severní Americe na 500–1000 nových případů na jeden milión obyvatel. Progrese ICHDK do tohoto stadia představuje nejen ohrožení končetiny, ale i samotného života. Prognóza pacientů s chronickou kritickou ischémií dolních končetin je zatížena vysokou mortalitou a je srovnatelná s prognózou pacientů s pokročilým maligním onemocněním.(1) Přibližně 60 % nemocných s kritickou ischémií je léčeno chirurgicky nebo intervenčně, 20 % prodělá primární amputaci a 20 % pacientů je léčeno konzervativně. Za rok od stanovení diagnózy chronické kritické ischémie dolních končetin prodělá 25 % nemocných amputaci nad kolenem, 20 % zemře a 55 % pacientů žije s oběma končetinami. 50 % nemocných s klidovými bolestmi zemře do pěti let. S amputací se prognóza těchto pacientů dále zhoršuje. Perioperativní mortalita amputací pod kolenem je udávána v rozmezí 5–10 %, pro amputace nad kolenem 15–20 %. Do dvou let po amputaci zemře 25–30 % nemocných a do pěti let nežije 50–75 % pacientů.
Strategie léčby spočívá především ve zlepšení perfúze ischemické oblasti chirurgickou či perkutánní revaskularizací. Pro pacienty s nerekonstruovatelným nálezem na tepnách dolních končetin je určena konzervativní léčba k zastavení nebo zpomalení progrese onemocnění, ke zlepšení lokálních i celkových cirkulačních poměrů, odstranění klidových bolestí a lokální péče o bolestivé defekty, které jsou výrazným stresujícím faktorem zhoršujícím kvalitu života. Přibližně 20 % pacientů není vhodných k endovaskulární ani chirurgické léčbě a je u nich provedena amputace končetiny.(2) Tento nepříznivý osud nemocných s chronickou kritickou ischémií dolních končetin vede ke snaze nalézt nové terapeutické postupy, které by vedly k záchraně končetin, resp. ke zlepšení kvality jejich života, snížení morbidity a mortality. Terapeutická angiogeneze vede v experimentu ke zlepšení perfúze v ischemické oblasti končetiny. Tato metoda by se tak mohla stát alternativní metodou konzervativní léčby nemocných s diagnózou chronické kritické ischémie dolních končetin.(3)

Patofyziologie

Proces růstu nových krevních cév je výsledkem několika procesů, kde zásadní roli hrají angiogeneze, arteriogeneze a vaskulogeneze. Termínem „angiogeneze“ je označována tvorba cév (většinou kapilár) větvením již existujícího řečiště, většinou z postkapilárních venul. Tento proces je stimulován především tkáňovou hypoxií, která vede k aktivaci řady růstových faktorů a jejich receptorů, především ze skupiny vaskulárních endotelových růstových faktorů (VEGF A-D), placentového růstového faktoru (PIGF), angiopoetinů a inducibilní formy syntázy oxidu dusnatého (iNOS). Je regulována lokální expresí faktoru indukovaného hypoxií (HIF-1alfa). Účinkem růstových faktorů se zvyšuje permeabilita stěny cévy, dochází k průniku plazminogenu a fibrinogenu a k jejich následné přeměně v plazmin a fibrin. Síť fibrinových vláken je pak podkladem pro vytváření nové cévy. Angiopoetiny zřejmě působí proti zvýšení propustnosti cévní stěny. Efekt PIGF je spíše arteriogenní a tento cytokin je schopný uvolňovat cirkulující endoteliální progenitorové buňky (EPC) z kostní dřeně. Zdá se, že se na angiogenezi významně uplatňují i zánětlivé mediátory (MCP-1, monocyte chemotactic protein-1).(4) Angiogeneze byla až donedávna pokládána za jediný mechanismus novotvorby a obnovování cév v dospělém organismu. Snížení účinnosti angiogenní aktivity má za následek poruchu hojení ran nebo pomalé hojení zlomenin, naopak zvýšená podpora novotvorby cév se může podílet na patogenezi revmatoidní artritidy, diabetické retinopatie nebo chronického zánětu. Angiogeneze hraje také významnou úlohu v růstu nádorového ložiska a v metastazování.(5) Termínem „arteriogeneze“ označujeme proces tvoření kolaterálních spojek de novo ze stávajícího tepenného řečiště, kde došlo k uzávěru či stenóze, které můžeme zobrazit angiograficky. Regulace arteriogeneze není závislá na hypoxii tkáně. Vznik kolaterál je podle experimentu způsoben zvýšením smykových rychlostí při nahromadění mononukleárů, což vede ke zvýšení aktivity uvolněných růstových faktorů, jako jsou fibroblastový růstový faktor (FGF), VEGF, růstový faktor odvozený od destiček (PDGF) a další. Růstové faktory FGF a PDGF, na rozdíl od VEGF, mají minimální vliv na permeabilitu cév a výrazně potencují aktivaci pericytů, proliferaci fibroblastů s podporou syntézy kolagenu, což vede ke vzniku nové stěny cévní a jejího lumen. PDGF se spolu s hepatocytárním růstovým faktorem (HGF) významně podílí na morfogenezi cévy, ale přesná role a vzájemná interakce zatím nejsou zcela objasněny.(6) Termínem „vaskulogeneze“ je označována diferenciace mezodermálních prekurzorů směrem k angioblastům a následně ke zralým endotelovým buňkám, které vytvářejí primitivní kapilární síť v časné embryogenezi. Je to tedy proces tvorby krevních cév in situ z cirkulujících endoteliálních progenitorových buněk (EPC) a cévních progenitorových buněk. Tyto tři popsané procesy neovaskularizace se mohou navzájem doplňovat, ale i dynamicky měnit podle charakteru poškození tepenného Pokud dojde k poškození tkáně, uplatňuje se při hojení nejspíše angiogeneze. Při organických změnách tepenného řečiště se zachováním periferních tepen hraje zásadní roli arteriogeneze tvorbou kolaterálního řečiště. Vaskulogeneze se zřejmě uplatňuje především v novotvorbě cévního řečiště distálně od uzávěru tepenného řečiště.(7) Kmenové buňky jsou esenciální stavební kameny vícebuněčných organismů a vyskytují se ve většině orgánů. Jejich zásadními vlastnostmi je schopnost dalšího růstu s možností tvorby dalších kmenových buněk a možnost diferenciace ve specializované buňky. Tato tzv. „plasticita“ (multipotence v diferenciaci a množení) znamená, že tyto kmenové buňky mohou být zdrojem všech typů buněk a mohou se uplatňovat např. v regeneraci myokardu, jater, nervové tkáně a dalších orgánů, a naopak kmenové buňky z jednotlivých orgánů mohou vytvářet buňky kostní dřeně s expresí jejich povrchových znaků. Tento fakt byl potvrzen při transplantaci kostní dřeně nebo obohacených hematopoetických kmenových buněk, kdy bylo možno prokázat myoblasty kosterního svalstva nebo myokardu, endotelu, epitelie plic, střeva, žlučových cest a jater, kůže nebo neuroektodermu. Zásadní význam v regeneraci tkání se v současnosti přikládá právě těmto tzv. multipotentním buňkám, které se vyskytují v jednotlivých orgánech.(8) Cirkulující endoteliální progenitorové buňky (EPC) jsou v nízkých počtech přítomny v periferní krvi podobně jako prekurzory hematopoetické. Podobně jako ony jsou mobilizovatelné růstovými faktory (G-CSF – granulocyte-colony stimulating factor, SCF – stem cell factor, erytropoetin) a také inhibitory HMG-CoA reduktázy (statiny). Kromě nich byly u některých chorobných stavů, především vaskulitid, ale i u akutních forem tepenných onemocnění, popsány zralé, cirkulující endotelové buňky, většinou apoptotické či nekrotické. U ANCA-asociovaných vaskulitid bylo ve více pracích popsáno zmnožení zralých endotelových buněk v periferii,(9, 10) existuje však jen jediná práce zkoumající množství cirkulujících EPC.(11) EPC mohou vznikat nejen z primitivních prekurzorových buněk, ale též ze zralých buněk kostní dřeně či periferní krve a usídlovat se v již existujících cévách. Na svém povrchu nesou tyto EPC charakteristické znaky, jako jsou CD 133, CD 34 a receptor-2 pro VEGF. Tyto buňky lze získat kultivací hematopoetických progenitorových buněk CD 34+, CD 133+, a dále z buněk mononukleárních. Podobně jako u kmenových buněk u nich byla prokázána schopnost navodit vaskulogenezi. Buňky hladké svaloviny v tepenné stěně mohou také vznikat z prekurzorů kostní dřeně.(4) V roce 1994 skupina biologů ze Seattlu zjistila, že dakronové cévní náhrady u pokusných psů nejsou endotelizovány transmurální angiogenezí z okrajů cévní náhrady, ale endotelovými ostrůvky, které postupně vznikaly na různých místech dakronového graftu bez kontaktu s existujícím cévním řečištěm.(12) Dalšími sériemi pokusů bylo zjištěno, že tyto endotelové ostrůvky nepocházejí z endotelových buněk, náhodně odloučených ze zralých cév, ale mají původ v prekurzorových buňkách z kostní dřeně.(13) V současné době se předpokládá, že cévní i krvetvorné buňky pocházejí ze společného prekurzoru, takzvaného hemangioblastu.(4, 13) Je prokázáno, že nezralé angioblastové prekurzory cirkulují v detekovatelných množstvích i v krevním oběhu dospělých jedinců, kde tvoří zhruba 0,002 % mononukleárních buněk.(14)

Jak už bylo uvedeno, množství angioblastických prekurzorů je možno zvýšit mobilizací pomocí VEGF, G-CSF či SCF.(4) Cévní ischémie rovněž zvyšuje množství angiogenních prekurzorů u pokusných zvířat či u pacientů se srpkovitou anémií, což vede k závěrům, že vaskulogeneze se významnou měrou podílí na cévní obnově i u dospělých jedinců.(15) Kromě dřeňových prekurzorů vaskulárních buněk se ovšem mohou na procesu vaskulogeneze podílet i relativně zralé endotelové buňky, odloučené z cévní stěny. Vzhledem k jejich omezené schopnosti proliferace(14) je však jejich podíl na celkovém výsledku nejasný.
Z výše uvedeného pohledu je logické, že u chorobných stavů vedoucích k ateroskleróze, jako jsou například diabetes mellitus, hypercholesterolémie nebo vyšší věk, naopak cirkulujících endotelových prekurzorů ubývá. Hill a spol.(16) v práci z roku 2003 našli přímou korelaci mezi počtem cirkulujících endoteliálních prekurzorů a Framinghamským rizikovým indexem pro aterosklerózu. Z toho ovšem vyplývá, že právě ti jedinci, kteří jsou nejvíce ohroženi cévním onemocněním, mají nejmenší reparační kapacitu cévního řečiště.
Existují dva teoretické způsoby využití vaskulogeneze, které jsou dobře prozkoumány především u ischemické choroby srdeční. První spočívá v mobilizaci endotelových prekurzorů z kostní dřeně do krevního oběhu pomocí cytokinů. Orlic(17) mobilizoval dřeňové buňky u myší s experimentálně vyvolaným infarktem myokardu pomocí G-CSF a SCF. Mobilizace endotelových prekurzorů těmito dvěma cytokiny snížila velikost infarktu o 40 %, dilataci komory o 26 % a mortalitu o 68 %. Na primátech se však tyto výsledky nepodařilo zopakovat vzhledem k excesivní mortalitě pokusné skupiny. Rovněž u člověka bylo prokázáno, že aplikace cytokinů před plánovaným sběrem krvetvorných buněk může vyvolat anginu pectoris či akutní arteriální uzávěr.(18) Dále bylo zjištěno, že dřeňové prekurzorové buňky se mohou diferencovat i do buněk hladké svaloviny a podílet se na vzniku aterosklerotických plátů. Inhibitory HMG-CoA reduktázy rovněž zvyšují počet cirkulujících progenitorů, a to až na čtyřnásobek v průběhu čtyř týdnů po začátku podávání, což je srovnatelné s použitím VEGF.(19) Mechanismus mobilizace není zcela jasný, patrně však souvisí se zvýšeným vyzráváním endotelových prekurzorů. Je pravděpodobné, že mobilizace endotelových prekurzorů je jedním z mechanismů příznivého účinku statinů u pacientů s normálním cholesterolem a ischemickou chorobou srdeční.(20) Druhou možností je sběr vaskulárních prekurzorů a jejich aplikace přímo do místa kritické ischémie. Tímto způsobem bylo dosaženo snížení frekvence amputací v experimentálním modelu cévní ischémie končetiny u nahých myší.(21) Výše nastíněné úvahy mohou vést k velmi logické otázce: jestliže je v ischemické oblasti zachován alespoň minimální krevní průtok, proč nestačí k regeneraci vaskulogeneze fyziologicky cirkulující endotelové prekurzory? Jedna z možných odpovědí je, že při mobilizaci endotelových prekurzorů, ať již vznikem akutní ischémie, podáváním statinů či podáváním růstových faktorů, nedojde k dostatečné koncentraci těchto prekurzorů v postižených oblastech, eventuálně jejich vzájemný poměr s jinými dřeňovými prekurzory není optimální.
Přes řadu nejasností v celé této složité problematice je ale možno dnes jednoznačně říci, že orgány dospělého člověka (včetně snadno přístupné kostní dřeně) obsahují nezralé buňky, které jsou schopny v případě potřeby napomáhat regeneraci poškozených orgánů. V případě náhlého, rozsáhlého či chronického poškození a u starších jedinců však není na poškozeném místě dostatečný počet progenitorových buněk k dispozici a jejich mobilizace ze vzdálenějších míst a doprava na místo poškození rovněž nejsou dostačující. V takovém případě by mohlo být prospěšné pěstování uvedených buněk in vivo a jejich následná doprava na místo poškození. V současné době se předpokládá, diferenciace progenitorových buněk ve funkční buňky poškozeného orgánu je plně řízena vnitřním mikroprostředím. V takovém případě by nebylo třeba progenitorové buňky nijak zvlášť upravovat. Větší problém by mohl být s dopravou dostatečného množství buněk na místo určení. V úvahu připadá buď intravenózní podání (kdy ovšem značná část buněk nemusí dorazit na místo určení), nebo podání přímo do poškozeného místa. Dalším problémem je, že v případě akutního poškození nebudou autologní buňky pacienta k dispozici. Zdá se však, že některé (např. mezenchymové) kmenové buňky nevyvolávají při alogenním podání imunitní odpověď, dokonce podle některých pokusů mohou rovněž navozovat imunitní toleranci. Teoreticky je tedy možné si představit využití jak autologních progenitorových buněk, tak i předem připravených alogenních progenitorových buněk.

Klinické studie

Pilotní klinická práce s kmenovými buňkami u pacientů s ischemickou chorobou dolních končetin byla publikována r. 2002 japonským autorem E. Tateishi-Yuyamou (TACT Study).(19) Tehdy bylo zařazeno 25 pacientů s unilaterální kritickou končetinovou ischémií, kterým byly aplikovány kmenové buňky do musculus gastrocnemius postižené končetiny. Druhá skupina 22 pacientů měla bilaterální postižení končetin, u této populace byly aplikovány kmenové buňky do jedné končetiny (opět do musculus gastrocnemius) a periferní mononukleáry do druhé končetiny. Primárním cílem byla bezpečnost a účinnost léčby založená na hodnocení ankel-brachial indexu (ABI), klidových bolestí. Práce prokázala účinnost implantace kmenových buněk u těchto pacientů se zlepšením prokrvení končetiny, ústupu klidových bolestí a hojení defektů. Metoda byla hodnocena jako bezpečná.
Doposud publikované preklinické a klinické studie ukazují, že podání autologních mononukleárních buněk kostní dřeně zlepšuje prokrvení končetiny. Toto bylo dokumentováno zlepšením jak objektivních parametrů (ABI, transkutánní tenze kyslíku, angiografie, prodloužení klaudikační vzdálenosti, snížená incidence amputace), tak i subjektivních ukazatelů (zmírnění klidových bolestí, zlepšení kvality života).
Pro léčbu kritické ischémie byly používány tři možné cesty aplikace kmenových buněk – intramuskulární, intraarteriální a kombinovaná (intramuskulární a intrarteriální). Žádná studie nesrovnávala tyto cesty aplikace. Z metaanalýz vyplývá, že výraznější zlepšení ABI a transkutánní tenze kyslíku bylo zaznamenáno při intramuskulárním podání, nicméně obě cesty podávání byly srovnatelné při hodnocení zmírnění bolestí, prodloužení klaudikačního intervalu.(22) Výhodou intramuskulárního podání může být vytvoření lokálního zdroje implantovaných buněk jako místa zvýšené lokální parakrinní aktivity v ischemické oblasti. Možnou výhodou selektivního intraarteriálního podání do postiženého místa je „homing“ buněk přímo v cílové ischemické tkáni, tím i zvýšená koncentrace v místě očekávané novotvorby cév.
Byly publikovány práce, které se zabývaly bezpečností a účinností implantace kmenových buněk u pacientů s trombangiitis obliterans (Bürgerova choroba).(23, 24) U těchto pacientů byla patrná lepší léčebná odpověď v porovnání s pacienty s ischémií končetiny na podkladě aterosklerózy. Bylo pozorováno výraznější zlepšení ABI, transkutánní tenze kyslíku, současně také hojení defektů a zmírnění bolestí po implantaci kmenových buněk u těchto nemocných. Polymorbidita pacientů s povšechnou aterosklerózou je spojená s přítomností mnoha kardiovaskulárních rizikových faktorů a negativním vlivem na funkčnost autologních kmenových buněk. Snížená funkce endotelových progenitorových buněk a zhoršená odpověď na buněčnou terapii byly pozorovány u pacientů s diabetem, u pacientů s renální insuficiencí.
V lednu 2011 byla publikována studie PROVASA – randomizovaná, dvojitě slepá, placebem kontrolovaná studie. Bylo zařazeno 40 pacientů s kritickou končetinovou ischémií. První tři měsíce byly polovině pacientů aplikovány intraarteriálně kmenové buňky do tepen dolních končetin, polovina dostávala placebo. Za 6 měsíců od začátku studie byly kmenové buňky aplikovány všem pacientům. Primárním endpointem byla změna indexu kotník/paže (ABI), sekundárním endpointem bylo hojení defektů, snížení bolesti, počet amputací. ABI parametr se ukázal jako nevhodný primární endpoint, protože jeho změny nekorelovaly s hojením ran a záchranou končetiny. Dále bylo prokázáno, že intraarteriální aplikace kmenových buněk signifikantně podporuje hojení ran a snižuje bolest po třech měsících oproti aplikaci placeba. Kompletní zhojení defektů bylo ve většině případů spojeno s opakovanou aplikací kmenových buněk. Dobrá odpověď na aplikaci kmenových buněk byla zjištěna u pacientů s trombangiitis obliterans, u celkově kriticky nemocných s rozsáhlými gangrénami a u pacientů s hrozící amputací nebyl předpokládaný benefit aplikace kmenových buněk prokázán. Toto ukazuje na důležitost samotného stavu postižené končetiny. Silnými prediktory nedostatečné odpovědi na léčbu kmenovými buňkami je vzestup zánětlivých markerů (CRP). Lokální zánět vytváří prostředí, ve kterém mají podané buňky snížený regenerační potenciál. Z toho vyplývá také správné načasování léčby.
Metoda léčby kmenovými buňkami se v publikovaných pracích jeví jako metoda bezpečná a dobře tolerovaná. Nebyla vyšší mortalita u pacientů léčených kmenovými buňkami. Nebyly pozorovány hypotetické nežádoucí účinky jako zhoršení diabetické retinopatie nebo akcelerace růstu tumorů.(25) Data ze studií také ukazují, že implantace kmenových buněk indukuje signifikantní histologické změny, které nejsou přítomny u kontrolních pacientů s kritickou ischémií bez implantace kmenových buněk. Zatím nezodpovězena zůstává celá řada otázek souvisejících s těmito změnami, které vedou ke klinickému zlepšení.
Nyní probíhají velké randomizované placebem kontrolované klinické studie (JUVENTAS, BONMOT-CLI), které by mohly zodpovědět některé důležité otázky týkající se léčby kmenovými buňkami u pacientů s kritickou končetinovou ischémií.
Zkoumání a objevování nových léčebných strategií u pacientů s kritickou končetinovou ischémií má velký význam z důvodu závažnosti této diagnózy, stávající špatné prognózy a velmi snížené kvality těchto pacientů. Kmenové buňky jsou možným novým léčebným prostředkem, což naznačují výše zmíněné studie.

Naše zkušenosti

Od 1. 9. 2004 do 31. 12. 2006 jsme provedli 28 autologních intravaskulárních transplantací dřeňových buněk u 24 pacientů (13 mužů a 11 žen) s chronickou kritickou končetinovou ischémií (CHKKI) dolních končetin. Stupeň ICHDK jsme hodnotili podle Fontainovy klasifikace. Stupeň III (klidové bolesti DK) splňovalo 14 (50 %) ošetřených končetin, stejný počet i stupeň IV (defekt či ztráta tkáně). Věkový medián souboru byl 68 let 26–85). Patnáct (62,5 %) pacientů se léčilo pro diabetes mellitus, 11 (46 %) pacientů pro ICHS, 18 (75 %) pacientů pro hypertenzi, u 13 (54 %) pacientů byla zjištěna porucha metabolismu lipidů, u pěti (21 %) pacientů byla zjištěna anamnéza embolizace do tepen dolních končetin při chronické fibrilaci síní, pět (21 %) nemocných mělo v anamnéze cévní mozkovou příhodu, 8 (33 %) pacientů bylo kuřáky.
Všichni pacienti byli hospitalizováni na jednotce intenzívní angiologické péče II. interní kliniky 1. LF UK. U všech bylo provedeno při přijetí základní interní a angiologické vyšetření (biochemické, hematologické vyšetření, změření indexu kotníkpaže [ABI], změření transkutánní tenze kyslíku [TcpO2] a angiografické vyšetření). Pacienti podepsali informovaný souhlas s léčbou a byl jim rozdán k vyplnění dotazník kvality života (SF-36). Test klaudikační vzdálenosti na běhátku jsme zpočátku prováděli, ale jelikož většina nemocných nebyla schopna chůze pro defekt na noze nebo klidové bolesti, od dalšího provádění jsme ustoupili. Po transplantaci kmenových buněk byli pacienti propuštěni druhý den do domácího léčení, užívali svoji chronickou medikaci a byli pravidelně sledováni v šesti měsíčních intervalech v naší angiologické ambulanci II. interní kliniky VFN a 1. LF UK, kde jsme kontrolovali vedle celkového stavu i lokální nález na léčené končetině (včetně ABI). Lokální léčba defektů DK byla prováděna specializovanou angiologickou sestrou, monitorována standardním způsobem a byla prováděna jejich pravidelná fotodokumentace. Po roce bylo provedeno kontrolní angiografické vyšetření léčené končetiny se změřením ABI, TcpO2 a vyplněn dotazník kvality života.
Mohli být zařazeni pacienti ve věku do 85 let s diagnózou kritické ischémie DK bez další možnosti endovaskulární či chirurgické revaskularizace. Nemohli být zařazeni pacienti s kritickou stenózou koronární tepny nebo nestabilní anginou pectoris, maligním onemocněním.
Po roce sledování byli všichni pacienti živí. Dle hodnocení stupně ICHDK se podařilo převést do stadia klaudikací (IIb dle Fontaina) 22 (84,6 %) nemocných. U 2 (7,6 %) pacientů přetrvávaly, i když došlo ke zhojení defektu, klidové bolesti, které ale lépe než před implantací kmenových buněk reagovaly na analgetickou léčbu. Ke zhojení defektu došlo v 11 ze 14 případů (78,9 %) během prvního roku. Velkou amputaci končetiny (ve stehně) podstoupili do tří měsíců po implantaci dva pacienti (pacienti s klidovou bolestí nereagující na analgetika). Tři pacienti prodělali amputaci (gangréna). Během léčby a následující rok žádný pacient neprodělal infarkt myokardu nebo cévní mozkovou příhodu. Po dvou letech zemřela jedna pacientka z důvodů nesouvisejících s aterosklerózou. U dvou nemocných přetrvával defekt (i když zmenšen) i po roce léčby.
Léčba byla pacienty velmi dobře tolerována. V našem souboru jsme zaznamenali u jednoho pacienta větší hematom v místě punkce po odběru dřeně, ale bez potřeby krevního převodu. Ani u jednoho pacienta nedošlo k významnému poklesu hemoglobinuV souboru došlo k vzestupu průměrných hodnot ABI z 0,54 na 0,67, stejně tak došlo k vzestupu průměrných hodnot TcpO2 z 14,9 na 37,2 mmHg. Oba vzestupy jsou statisticky významné (p < 0,0001) (Obr. 1, 2).
Rok po implantaci dřeňových buněk došlo ke zlepšení angiografického nálezu ve všech sledovaných úsecích, přičemž dle předpokladu největší zlepšení bylo pozorováno v distálních částech končetiny (lýtka a nohy). Nebyla zjištěna žádná korelace mezi zlepšením angiografického nálezu a počtem implantovaných progenitorů. Zlepšení průměrného angiografického nálezu korelovalo jak s Fontainovým hodnocením ICHDK před léčbou, tak i s hodnocením ICHDK po léčbě, avšak nikoli s průměrnou změnou Fontainova hodnocení. Toto znamená, že implantace progenitorových buněk způsobovala zlepšení angiografického nálezu a Fontainova hodnocení jak u pacientů se stupněm IV, tak u pacientů se stupněm III, a že výsledný benefit byl pro obě tyto skupiny pacientů stejně dobrý (Obr. 3–10). Také hodnocení dotazníků kvality života před a po léčbě bylo pozitivní ve všech ukazatelích (dotazník SF 36).

Závěr

Pacienti s kritickou končetinovou ischémií jsou ohroženi vysokou mortalitou a vysokým rizikem amputace končetiny a s tím související výrazně zhoršenou kvalitou života. Hledání nových léčebných možností pro tyto pacienty je proto důležité. Implantace dřeňových prekurzorových buněk do ischemické končetiny se ukazuje jako metoda bezpečná, dobře tolerovaná a účinná, zlepšuje jak objektivní, tak i subjektivní ukazatele hodnotící tíži poškození končetiny. Autologní kostní dřeň poskytuje endotelové progenitorové buňky, které mají schopnost se diferencovat na endotelové buňky a zároveň produkovat množství cytokinů. Z publikovaných prací vyplývá, že zlepšení tvorby kolaterálního řečiště nastává nejen v místě cévního uzávěru, ale i distálně od něho. Výsledky léčby pomocí transplantace progenitorových buněk jsou významně lepší než výsledky léčby alprostadilem. Na rozdíl od léčby alprostadilem nevyžaduje transplantace dřeňových progenitorů dlouhodobou hospitalizaci. Pro zavedení léčby kmenových buněk do běžné praxe jsou potřeba výsledky velkých randomizovaných placebem kontrolovaných klinických studií, které by měly dát odpověď na řadu ne zcela jasných otázek, jako jsou optimální zdroj buněčného materiálu, způsob přípravy a aplikace buněk, možnost alogenního podání.

Použité zkratky

G-CSF růstový faktor stimulující tvorbu granulocytů (granulocyte colony-stimulating factor) SCF růstový faktor kmenových buněk (stem cell factor) HMG-CoA 3-hydroxy-3metyl-glutaryl-koenzym A VEGF vaskulární endoteliální růstový faktor (vascular endothelial growth factor) Prohlášení: autor v souvislosti s tématem práce nespolupracuje s žádnou farmaceutickou firmou.

**

Literatura

1. WOLFE, JH., WYATT, MG. Critical and subcritical ischaemia. Eur J Vasc Endovasc Surg, 1997, 3, p. 578–582.
2. RISSANEN, TT., VAJANTO, I., YLA-HERTTUALA, S. Gene therapy for therapeutic angiogenesis in critically ischaemic lower limb on the way to the clinic. Eur J Clin Invest, 2001, 31, p. 651–666.
3. KOK HO., T., RAJKUMAR, V., BLACK, C., et al. Critical limb ischemia classification and therapeutic angiogenesis. Intern J Angiol, 2005, 14, p. 49–59.
4. ASAHARA, T., TAKAHASHI, T., MASUDA. H., et al. VEGF contributes to postnatal neovascularization by mobilizing bone marrow-derived endothelial progenitor cells. Embo J, 1999, 18, p. 3964–3972.
5. PUGH, CW., RATCLIFFE, PJ. Regulation of angiogenesis by hypoxia. Role of the HIF system. Nat Med, 2003, 9, p. 677–684.
6. ITO, WD., ARRAS, M., SCHOLZ, D., et al. Angiogenesis but not collateral growth is associated with ischemia after femoral artery occlusion. Am J Physiol, 1997, 42, H1255–H1265.
7. RISAU, W., FLAMME, I. Vasculogenesis. Annu Rev Cell Dev Biol, 1995, 11, p. 973–911. 8. STAMM, C., WESTPHAL, B., KLEINE, HD., ET AL. Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration. Lancet, 2003, 361, p. 45–46.
9. SHI, Q., WU, MH., HAYASHIDA, N., et al. Proof of fallout endothelization of impervious Dacron grafts in the aorta and inferior vena cava of the dog. J Vasc Surg, 1994, 20, p. 546–557.
10. SHI, Q., RAFII, S., HONG, D., WU., M., et al. Evidence for circulating bone marrowderived endothelial cells. Blood, 1998, 92, p. 362–367.
11. PEICHEV, M., NAIYER, AJ., PEREIRA, D., et al. Expression of VEGFR-2 and AC133 by circulating human CD34+ cells identifies a population of functional endothelial precursors. Blood, 2000, 95, p. 952–958.
12. ORLIC, D., KAJSTURA, J., CHIMENTI, S., et al. Mobilized bone marrow cells repair the infarcted heart, improving function and survival. PNAS, 2001, 98, p. 10344– 10349.
13. SOLOVEY, A., LIN, Y., BROWNE, P., et al. Circulating activated endothelial cells in sickle cell anemia. N Engl J Med, 1997, 337, p. 1584–1590.
14. HILL, JM., ZALOS, G., HALCOX, JPJ., et al. Circulating endothelial progenitor cells, vascular function and cardiovascular risk. N Engl J Med, 2003, 348, p. 593–600.
15. KAWAICHI, Y., WATANABE, A., UCHIDA, T., et al. Acute arterial thrombosis due to platelet aggregation in a patient receiving granulocyte colony-stimulating factor. Br J Haematol, 1996, 94, p. 413–416.
16. LLEVADOT, J., MURASAWA, S., KUREISHI, Y., et al. HMG-CoA reductase inhibitor mobilizes bone marrow-derived endothelial progenitor cells. J Clin Incest, 2001, 108, p. 399–405.
17. DIMMELER, S., AICHER, A., VASA, M., et al. HMG-CoA reductase inhibitors (statins) increase endothelial progenitor cells via the PI 3-kinase/Akt pathway. J Clin Invest, 2001, 108, p. 391–397.
18. KOCHER, AA., SCHUSTER, MD., SZABOLCS, MJ., et al. Neovascularization of ischemic myocardium by human bone-marrow-derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis, reduces remodeling and improves cardiac function. Nature Med, 2001, 7, p. 430–436.
19. TATEISHI-YUYAMA, E., MATSUBARA, H., MUROHARA, T., et al. Therapeutic angiogenseis for patients with limb ischaemia by autologous transplantation of bone-marrow cells: a pilot study and a randomised controlled trial. Lancet, 2002, 360, p. 427–435.
20. POMYJE, J., ŽIVNÝ, J., ŠEFC, L., et al. Expression of genes regulating angiogenesis in human circulating hematopoietic cord blood CD34+/ CD133+ cells. Eur J Haematol, 2003, 70, p. 143–150.
21. LEDERMAN, R., MENDELSOHN, F., ANDERSON, R., et al. Therapeutic angiogenesis with recombinant fibroblast growth factor-2 for intermittent claudication (the TRAFFIC study): a randomised trial. Lancet, 2002, 359, p. 2053–2038.
22. FADINI, GP., AGOSTINI, C., AVOGARO, A. Autologous stem cell therapy for peripheral arterial disease meta-analysis and systematic review of the literature. Atherosclerosis, 2010, 209, p. 10–17.
23. UBBINK, DT., JACOBS, MJHM., SLAAF, DW. Can transcutaneous oximetry detect nutritive perfusion disturbances in patients with lower limb ischemia? Microvasc Research, 1995, 49, p. 315–324.
24. WARE, JE., Jr., SHERBOURNE, CD. The MOS 36-item short-form health survey (SF-36). I. Conceptual framework and item selection. Med Care, 1992, 30, p. 473–483.
25. WAHLBERG, E. Angiogenesis and arteriogenesis in limb ischemia. J Vasc Surg, 2003, 38, p. 198–203.

O autorovi| MUDr. Lenka Skalická, Univerzita Karlova, 1. lékařská fakulta a Všeobecná fakultní nemocnice, II. interní klinika – klinika kardiologie a angiologie e-mail: lenka.skalicka@vfn.cz

Obr. 1 Ankle-brachial index (ABI) před a po implantaci kmenových buněk
Obr. 2 Transkutánní tenze kyslíku před a po implantaci kmenových buněk
Obr. 3 Odběr kostní dřeně z lopaty kyčelní
Obr. 7 Přístroj pro měření transkutánní tenze kyslíku
Obr. 9 Pacient s kritickou končetinovou ischémií při trombangiitis obliterans (A – před implantací kmenových buněk, B – po půl roce, C, D – po roce)
Obr. 5, 6 Implantace kmenových buněk na angiografickém sále intraarteriálně
Obr. 10 Angiografické nálezy u téhož pacienta před implantací kmenových buněk (vlevo) a rok po implantaci (vpravo)
Obr. 4 Separace kmenových buněk
Obr. 8 Sonda přístroje pro měření tenze kyslíku

Ohodnoťte tento článek!