Laboratorní diagnostika hemofilie a dalších vrozených krvácivých chorob

Souhrn

Laboratorní diagnostika krvácivých chorob je nezbytně spjata s klinickou diagnostikou. Informace z anamnézy pomáhají k cílenému výběru laboratorních metod a následně k rychlé a přesné diagnostice. Při laboratorním vyšetření je vždy nutné vycházet ze základního koagulačního vyšetření, krevního obrazu a globálních testů na vyšetření primární hemostázy. Teprve potom se doporučuje pokračovat se specializovanými vyšetřeními, kterých je velké množství, a často nejsou okamřitě dostupná.

Klíčová slova krvácivá onemocnění • hemofilie A • von Willebrandova choroba • vzácná krvácivá onemocnění

Summary

Hrachovinova, I. Laboratory diagnostics of haemophilia and other hereditary haemorrhaging diseases Laboratory diagnosis of haemorrhaging diseases is irreversibly linked with clinical diagnostics. Information from the patient’s medical history help to select the most suitable laboratory methods and to achieve quick and precise diagnosis.

Key words haemorrhaging diseases • haemophilia A • von Willebrand’s disease • rare haemorrhaging diseases Základní přístup

Primárně je nutné u krvácejícího pacienta zhodnotit, zda se jedná o lokální příčinu krvácení z důvodu úrazu, nebo o krvácení způsobené vrozenou nemocí. Dále je nutné zjistit, zda se jedná o poruchu hemostázy primární, nebo sekundární (koagulace). Diagnóza krvácení je několikastupňový proces; pokud se nejedná o akutní stav, měla by probíhat v tomto sledu: A. anamnéza krvácení, B. vyšetření typu krvácení, C. laboratorní vyšetření.
Ad A. Na základě informací pacienta vytvoření předběžné diagnózy, rozhodnutí, jaké testy jsou nejlepší pro vyšetření a vytvoření strategie léčby.(1) Ad B. Kontrola místa, kde ke krvácení dochází (kůže, sliznice, oči, svaly a klouby).
Ad C. Laboratorní vyšetření by mělo potvrdit nebo vyvrátit podezření na krvácivou chorobu. Při akutním krvácení je laboratorní vyšetření primární!(2) Při rozhodování, zda se jedná o lokální poranění, nebo o systémovou poruchu hemostázy, je důležité si uvědomit, že systémová porucha hemostázy se projevuje: a) krvácením na více místech, b) epizodami spontánního krvácení, c) krvácivými epizodami s časovým odstupem od poranění nebo

prodlouženým krvácením, d) slizničním krvácením s epistaxemi, e) hematomy nebo krvácení do kloubů.(3) Přibližné rozlišení, zda se jedná o krvácení z příčiny poruchy primární hemostázy, nebo koagulační poruchy, je v Tab. 1. Hlavní znaky pro rozlišení, zda se jedná o poruchu krvácení vrozenou, nebo získanou, jsou v Tab. 2. Je ale obtížné odlišit nově vzniklé získané krvácivé onemocnění od lehké formy vrozené krvácivé choroby jen na základě klinické anamnézy.

Hemofilie A

Hemofilie je vrozené krvácivé koagulační onemocnění, které postihuje přibližně 1 z 10 000 mužů. Vedle hemofilie A, která je 6krát četnější a je způsobena deficitem FVIII v cirkulující krvi, existuje také hemofilie B, která je způsobena deficitem FIX. Stejná klinická manifestace obou onemocnění je způsobena úlohou FVIII a FIX v plazmatické koagulaci, kde spolu tvoří tenázový komplex. Podle hloubky deficitu klasifikujeme hemofilii na těžkou (< 1 %), středně těžkou (1–5 %) a lehkou (5–40 %) formu.(4) Tíže krvácivých projevů u lehké a středně těžké formy koreluje s hloubkou deficitu faktorů. Nemocní s těžkou formou hemofilie zpravidla krvácejí několikrát do měsíce většinou do nosných kloubů a do svalů. Nemocní s lehčími formami nadměrně krvácejí při chirurgických a stomatologických výkonech nebo po menším traumatu. Závažným problémem hemofilie je vznik autoprotilátek inhibujících FVIII (FIX). Vyskytují se u 5–35 % pacientů s těžkou až středně těžkou formou onemocnění. Častěji se objevují u hemofilie A, což je dáno výraznějšími riziky vzniku inhibitoru u tohoto onemocnění. Hemofilie je na chromosom X vázaná choroba, muži mají projevy choroby – krvácejí – a ženy jsou zpravidla bez příznaků krvácení – jsou přenašečky onemocnění.
Krvácení u hemofiliků má komplexní patofyziologii. Defekt FVIII/FIX způsobuje nedostatečnou tvorbu trombinu, následkem toho vzniká pomalu nestabilní krevní sraženina. Nedostatečné množství trombinu také způsobuje časnou a zvýšenou fibrinolýzu.

LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA

Screeningový test: prodloužené APTT Hlavní test: aktivita FVIII Dodatečné testy: inhibitor FVIII a genetické stanovení kauzální mutace

PRINCIP STANOVENÍ FVIII

Dvě různé metody měření koagulační aktivity FVIII (FVIII:C), jednofázová (FVIII:C1st) a dvoufázová, byly zavedeny již v 50. letech minulého století.(5, 6) V 70. letech byla upravena dvoufázová metoda na chromogenní dvoufázovou metodu (FVIII:Chr).(7) Metody se od sebe liší způsobem aktivace jednotlivých faktorů koagulační kaskády.
Jednofázová koagulační metoda – FVIII:C – provádí se tak, že směs plazmy s deficitem faktoru VIII a plazmy je testována pomocí testu APTT (aktivovaný parciální tromboplastinový test). V případě deficitu faktoru VIII v pacientově plazmě nemůže dojít ke kompenzaci chybějícího faktoru v deficitní plazmě, a proto dojde k prodloužení času měření.
Dvoufázová metoda – chromogenní – FVIII:Chr – se provádí tak, že při aktivaci faktoru VIIIa trombinem vzniká při stálém množství FIXa, fosfolipidů a vápenatých iontů tenáza, ta zaktivuje FX přidaný v nadbytku, na FXa. Vznik FXa měříme za přítomnosti chromogenního substrátu, při jehož rozkladu se odštěpuje paranitroanilin (pNA). Odštěpený paranitroanilin detekovaný zabarvením při 405 nm je přímo úměrný aktivitě FXa, a tím i FVIIIa.
Vyšetření aktivity FVIII se používá k: a) diagnóze hemofilie A, b) klasifikaci onemocnění (těžká, středně těžká, lehká forma), c) monitorování léčby, d) stanovení inhibitoru FVIII.

PROBLÉMY A TĚŽKOSTI V LABORATORNÍ DIAGNOSTICE HEMOFILIE

1. Rozdíl mezi laboratorní a klinickou tíží hemofilie A, 2. diagnóza lehké hemofilie A, 3. stanovení inhibitoru FVIII.
Ad 1. Koagulačnní test stanovení FVIII je na principu APTT. Ve svém stanovení spotřebuje pouze 3–5 % celkového trombinu, který je vytvořený v reakční směsi. FVIII:C nezahrnuje informaci o celkovém množství vytvořeného trombinu. Touto nedokonalostí měřícího systému je možné vysvětlit, jak je možné, že dva pacienti, oba s FVIII:C < 1 %, mají rozdílný krvácivý fenotyp. Proto se u pacientů s těžkou formou hemofilie A doporučuje měřit TGT (trombin generační čas) nebo TEG (tromelastograf), což jsou globální testy, které lépe reflektují skutečné množství vzniklého trombinu. Tyto metody jsou také doporučené pro monitorování optimální léčby běžnými koncentráty FVIII i bypasovou aktivitou rFVIIa nebo Feibou.(8) Ad 2. Většina měření aktivity FVIII u pacientů chromogenní (FVIIICr) i jednofázovou koagulační metodikou (FVIIIC) dává stejné výsledky. Byly ale popsány případy, kdy tyto výsledky byly rozdílné. Na základě mnoha studií v evropských zemích bylo zjištěno, že se diskrepance týká 20–40 % lehkých hemofiliků. Diskrepance je vyvolána kauzálními mutacemi, které způsobují poruchu stability FVIIIa. Podle umístění a typu kauzální mutace je pak vyšší FVIIIC nebo FVIIICr. Diskrepance dosahuje u některých pacientů extrémů, kdy vyšetření FVIIIC je v normě, zatímco vyšetření FVIIICr je patologické a odpovídá středně těžké a ž lehké hemofilii A. V případě, že by se diagnóza stanovovala jen podle vyšetření FVIIIC, nebyli by tito pacienti diagnostikováni jako hemofilici, i když klinicky krváceli jako středně těžcí hemofilici. Na základě těchto výsledků bylo doporučeno, aby každý pacient s podezřením na hemofilii A měl stanovenu aktivitu FVIII oběma metodami.(9, 10) Ad 3. Funkční autoprotilátky proti FVIII se od roku 1975 stanovovaly tzv. Bethesda metodou. Inhibitor 1 BU/ml je definován jako taková koncentrace inhibující protilátky, která způsobí 50% reziduální aktivitu FVIII v přesně definované inkubační směsi (2 h 37 oC). Koncem 90. let, kdy se zaváděly stále nové léčebné koncentráty FVIII a bylo nezbytné sledovat, zda mohou způsobit vznik inhibitoru, bylo zjištěno, že původní metoda dává falešně pozitivní výsledky přítomnosti inhibitoru. To bylo způsobeno tím, že při dvouhodinové inkubaci plazmy při 37 oC docházelo ke změně pH a následně ke zvýšené, nestandardní degradaci FVIII. Proto byla doporučena modifikace Nijmegen, ve které se používá pufrovaná plazma.(11)

Von Willebrandova choroba

Von Willebrandova choroba (VWCH) je nejčastější vrozené krvácivé onemocnění. Na základě populační studie je zastoupena 1 %,(12) ale symptomatický výskyt VWCH je popisován jen v 0,01 % populace.(13) Je způsobena defektem nebo deficitem von Wilebrandova faktoru. Přenáší se mezi generacemi oběma pohlavími autosomálně dominantně i recesivně, závisí na subtypu VWCH. Struktura VWF je popsána na Obr. 1.(14) Funkce VWF je: a) v primární hemostáze – adheze trombocytů k subendoteliálním strukturám prostřednictvím GPIb a kolagenu v endoteliálni matrix, adheze a agregace trombocytů vazbou na receptory trombocytů, b) v koagulaci – ochrana FVIII před proteolytickou degradací.
Klasifikace VWCH a podrobné rozdělení VWCH do jednotlivých subtypů je v Tab. 4. Jednotlivé subtypy jsou podmíněny mutacemi v různých doménách VWF.
Správná diagnostika VWCH je ovlivněna výraznou heterogenitou onemocnění, faktory ovlivňujícími laboratorní i klinické vyšetření (stres, věk, hormony a krevní skupina) a vlastní limitací testů, které se používají k vyšetření jednotlivých subtypů.(15)

LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA

Laboratorní diagnostika následuje po prokázání krvácivého onemocnění.
Screeningové metody: – APTT, PFA100, krvácivost, konsumpce protrombinu.
Hlavní testy k diagnostice VWCH: – vyšetření funkce VWF (VWF:RCo, VWF:CB, VWF:Act), VWF:Ag, FVIII:C.
Další testy k vyšetření subtypů VWCH: – RIPA, vyšetření multimerů VWF, vyšetření vazby FVIII k VWF, ppVWF, vyšetření kauzální mutace.
K dalšímu rozlišení subtypu 2A na terciální subtypy (IIC, IID, IIE) a odlišení subtypu 2M od 2A je nutná znalost multimerní struktury VWF. PROBLÉMY A TĚŽKOSTI V DIAGNOSTICE VWCH

1. Odlišení typu 2 od typu 0, 2. odlišení typu 3 od těžké formy typu 1, 3. lehká forma VWCH od normálního člověka krvácejícího

z jiných neznámých příčin, 4. odlišení lehké formy hemofilie A od VWCH 2N, 5. odlišení získaného VW syndromu (AVWS) od vrozené formy

VWCH.
Ad 1. Je mezinárodně prokázáno,(16) že vyšetření VWF:RCo je na rozdíl od metody VWF:Ag zatíženo velkou mezilaboratorní i interlaboratorní chybou. Vzhledem k tomu, že většina laboratoří odlišuje typ 1 od typu 2 na základě porovnání výsledků těchto metod, může dojít k záměně typu 1 za typ 2 a naopak. Z těchto důvodů je doporučeno provádět funkční vyšetření ještě další metodikou, např. VWF:CB.
Ad 2. Je prokázáno,(17) že vyšetření VWF, funkční i kvantitativní, mají velmi malou senzitivitu k nízkým hodnotám VWF, rozptyl výsledků je 5–10 %. Může proto dojít k záměně typu 3 za typ 1. Vyšetření by mělo být opakováno, při přetrvávajících nejasnostech by měla být došetřena genetická příčina vWCH. Ad 3. Hranice patologie VWF, a tím laboratorní potvrzení VWCH, není jednoznačně stanovena. Je kromě jiného ovlivněna krevní skupinou (KS), lidé s krevní skupinou 0 mají v průměru o 25 % nižší hladinu VWF než ti, kteří mají KS non 0. Hranice patologie se liší od 45 do 30 % u KS0 a od 55 do 40 % u KS non 0. Krevní skupina ale není jedinou příčinou snížení VWF. V mezinárodní studii zabývající se VWCH typ I (MCMMDM-1VWD) nebyla nalezena žádná kauzální mutace v genu pro VWF téměř u 1/3 pacientů s laboratorně prokázanou VWCH typu 1 bez vztahu ke krevní skupině 0. Existují tedy ještě jiné příčiny snížení hladiny VWF.
Ad 4. Přibližně u 10 % pacientů s diagnózou lehké hemofilie A byla po zavedení vyšetření vazby FVIII na VWF (FVIII:B) po roce 2012 změněna diagnóza z HA na VWCH subtyp 2N. Tyto dvě choroby nemohly být odlišeny na základě výsledků doposud prováděných laboratorních vyšetření FVIII:C a VWF. Odlišit je mohl jen jiný způsob dědičnosti, hemofilie A je na chromosom X vázaná choroba, VWCH 2N je autosomálně recesivní choroba. Záměna těchto chorob má závažné následky při léčbě koncentráty koagulačních faktorů, která nemusí být dostatečně účinná. V dnešní době je vyšetření FVIII:B součástí rozšířeného vyšetření lehké formy hemofilie A, a proto by již k záměnám nemělo docházet.
Ad 5. Získaná forma VWCH je velmi vzácná. Laboratorně je neodlišitelná od vrozené formy VWCH. Při diagnóze jednoznačně pomůže kinetika podávání koncentrátu VWF. Poločas preparátu je výrazně zkrácený u AWS. K diagnostice pomůže i znalost primárního onemocnění, kterým bývají lymfoproliferativní onemocnění, paraproteinémie, imunologické onemocnění nebo kardiopatie. Ke správné diagnóze výrazně přispívá také anamnéza krvácení při předchozích úrazech a operacích. Vzácná krvácivá onemocnění

Prevalence vzácných vrozených krvácivých onemocnění je jeden pacient na 500 000 až dva milióny lidí (Obr. 2).
Klinická manifestace celoživotního krvácení je velmi různorodá. Těžko se stanovuje riziko krvácení, protože hranice těžké, středně těžké a lehké formy jednotlivých faktorů se liší (Tab. 5).

LABORATORNÍ DIAGNOSTIKA

Screeningové metody: – APTT, PT, TT (trombinový čas) (Obr. 3).
Hlavní testy k diagnostice vzácných krvácivých chorob: – funkční aktivita jednotlivých koagulačních faktorů.
Doplňkové testy: – kvantitativní stanovení faktorů a stanovení inhibitoru.
Laboratorní rozvaha na základě výsledků koagulačního screeningu je v Tab. 6.

PROBLÉMY A TĚŽKOSTI V LABORATORNÍ DIAGNOSTICE VZÁCNÝCH KRVÁCIVÝCH PORUCH

Zásadním problémem je, že změřená aktivita koagulačního faktoru nemusí odpovídat tíži krvácení pacienta. U některých pacientů s funkčním deficitem fibrinogenu a normální kvantitou fibrinogenu (dysfibrinogenémie) dochází místo krvácení k tromboembolickým stavům.

Prohlášení: autorka v souvislosti s tématem nespolupracovala v posledních 12 měsících s žádnou farmaceutickou firmou.

Literatura

1. KITCHENS, KS., et al. Consultative Haemostais and Thrombosis. 2007, chapter 1, p. 3– 15.
2. KEY, N., et al. Practical haemostasis and thrombosis. 2010, chapter 2, p. 7–16.
3. COLMAN, RW., et al. Haemostasis and Thrombosis: Basic Principles and Clinical Practice. 2006, chapter 27, p. 1147–1158. 4. MANNUCCI, PM., TUDDENHAM, EGD. The hemophilias – from royal genes to gene therapy. N Engl J Med, 2001, 344, p. 1773–1779.
5. BIGGS, R., EVELING, J., RICHARSD, G. The assay of antihaemophilic – globulin activity. Br J Haematol, 1955, 1, p. 20–34. 6. LANGDELL, R., WAGNER, R., BRINKHOUSE, K. Effect of antihemophilic factor on one-stage clotting tests; a presumptive test for hemophilia and a simple one stage antihemophilic factor assy procedure. J Lab Clin Med, 1953, 41, p. 637–647.
7. SEGHATCHIAN, M., MILLER-ANDERSSON, M. A colorimetric evaluation on factor VIII:C potency. Med Lab Sci, 1978, 35, p. 347–354.
8. FAVALORO, JE., et al. Problems and solutions in laboratory testing for hemophilia. Semin Thromb Hemost, 2013, 39, p. 816–833.
9. PAVLOVA, A., DELEV, D., PAHL, S., DRIESEN, J., BRONDKE, H., OLDENBURG, J. Molecular genetic back-ground of haemophilia A patients with discrepancy between one-stage and two-stage factor VIII assays. Hamestaseologie, 2010, 30, S153–S155.
10. PROVAZNÍKOVÁ, D., et al. Novel mutations associated with a discrepancy between one-stage and chromogenic FVIII activity assays. Haemophilia, 2015, 21, e330–e332.
11. VERBRUGGEN, B., et al. The Nijmegen modification of the Bethesda assayd for factor VIII:C inhibitors. J Thromb Haemost, 1995, 73, p. 247–251.
12. RODEGHIERO, F., et al. Epidemiological investigation of the prevalence of von Willebrand‘s disease. Blood, 1987, 69, p. 454–459.
13. SADLER, JE., et al. Update on the pathophysiology and classification of von Willebrand disease: a report of the Subcommittee on von Willebrand Factor. J Thromb Haemost, 2006, 4, p. 2013–2014.
14. NG, C., et al. Diagnostic approach to von Willebrand disease. Blood, 2015, 125, p. 2029-2037.
15. TOSETTO, A., et al. Prospective evauation of the clinical utility of quantitative bleeding severity assessment in patiens referred for hemostatic evaluation. JTH, 2011, 9, p. 1143–1148.
16. FAVALORO, JE., et al. Evaluating errors in the laboratory identification of von Willebrand disease in the real world. Thromb Res, 2014, 134, p. 393–403.
17. FAVALORO, JE. Diagnosing von Willebrand disease: a short history of laboratory milestones and innovations, plus current status, challenges, and solutions. Semin Thromb Hemost, 2014, 40, p. 551–570.
18. PEYVANDI, F., et al. Coagulation factor activity and clinical bleeding severity in rare bleeding disorders: results from the European Network of Rare Bleeding Disorders. JTH, 2012, 10, p. 615–621.
e-mail: mail: hrachovinova@uhkt.cz

Tab. 1 Rozlišení, zda se jedná o krvácení z příčiny poruchy primární
hemostázy, nebo koagulační poruchy
Porucha primární hemostázy Koagulační porucha
petechie, purpura krvácení do svalů
časté krvácení z nosu krvácení do kloubů
krvácení při operaci opožděné krvácení po operaci
a při trhání zubů nebo extrakci zubu
menoragie

Tab. 2 Rozlišení, zda se jedná o poruchu krvácení vrozenou, nebo
získanou
Vrozená choroba Získaná krvácivá porucha
krvácení od dětství dospělý pacient
opakované krvácivé epizody přítomnost dalších chorob
prodloužené krvácení po dřívějším dřívější operace bez krvácivých
chirurgickém zákroku komplikací
krvácení u dalších členů rodiny žádné krvácení v rodině

Tab. 4 Rozdělení VWCH do typů a subtypů na základě výsledků jednotlivých vyšetření
VWF:Ag VWF:RCo VWF:CB FVIII:C RIPA
1 ?? ?? ?? N/?? N/??
2A ??/N ???? ???????? N/?? N/??
2B ??/N ???? ???????? N/?? ??
2M ?? ???? ???????? N/?? N/??
2N N/?? N/?? N/?? ?????????? N
3 ???? ???? ???? ???? ????

Tab. 5 Rozdělení vzácných krvácivých chorob ve vztahu hladiny faktorů a krvácení.(18) Těžký – spontánní velké krvácení, středně těžký – mírné
spontánní nebo vyvolané krvácení.
Deficit koagulačního faktoru Laboratorní fenotyp
Těžký Středně těžký Lehký
fibrinogen nedetekovatelný 0,1–0,4 g/l > 0,4 g/l
FII nedetekovatelný < 10 % > 10 %
FV nedetekovatelný < 10 % > 10 %
FVII < 10 % 10–20 % > 20 %
FX < 10 % 10–40 % > 40 %
FXI < 10 % 10–30 % > 30 %
FXIII nedetekovatelný < 30 % > 30 %

Tab. 6 Vliv jednotlivých deficitů koagulačních faktorů na prodloužení screeningových testů
Deficit faktoru APTT PT TT
fibrinogen N/?? N/?? ????????
II ?? ?? N
V ?? ?? N
VII N/?? ?? N
X ?? ?? N
XI ???????? N N
XIII N N N

O autorovi| RNDr. Ingrid Hrachovinová, Ph. D. Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha

Obr. 1 Struktura a multimerizace VWF: A – VWF a jednotlivé domény, B – multimerizace VWF
Tab. 3 Klasifikace VWCH
Obr. 2 Poměrné zastoupení jednotlivých vzácných krvácivých poruch koagulace
Obr. 3 Koagulační kaskáda a vyšetření APTT, PT a TT

Ohodnoťte tento článek!