Laboratorní metody v gynekologické endokrinologii

Vysoce citlivé a specifické metody stanovení hormonů umožnily vývoj moderní endokrinologie. Praktická možnost kvantitativně měřit hladiny hormonů v tělních tekutinách citlivými imunoanalytickými metodami existuje něco přes 30 let…

MUDr. Petr Podroužek, CSc.

Ústav pro péči o matku a dítě, Praha

Klíčová slova

imunoanalýza • testy biologické aktivity • metody molekulární biologie a molekulární genetiky

Úvod

Vysoce citlivé a specifické metody stanovení hormonů umožnily vývoj moderní endokrinologie. Praktická možnost kvantitativně měřit hladiny hormonů v tělních tekutinách citlivými imunoanalytickými metodami existuje něco přes 30 let. Současné laboratorní vyšetřovací metody již umožňují analýzy na molekulární úrovni. Metody molekulární biologie (a tedy i molekulární endokrinologie) se běžně zabývají otázkami, jako je kontrola vývoje a diferenciace tkání a orgánů, molekulární formy hormonů v souvislosti s patologickým procesem a tomu odpovídajícími změnami na genové úrovni. Hranice mezi endokrinologií, imunologií a fyziologií nervové soustavy jsou nejasné vzhledem k objevům mnohotných interakcí mezi buněčnými mediátory těchto systémů. Žádné striktní dělení metod do kategorií není dnes odpovídající, poznatky jednoho oboru akcelerují rozvoj druhého. Použijeme-li např. fragment DNA k označení jedné z komponent imunoanalytické metody pro stanovení hormonu, ocitáme se metodologicky mezi obory imunochemie/molekulární endokrinologie/molekulární genetiky. Aplikace těchto nových metod, jako je dnes např. prediktivní DNA testování na predispoziční faktory řady onemocnění, nás posunuje od původně čisté terapie k prevenci těchto chorob a staví společnost před etické otázky, které v historii medicíny nemají obdoby.

Přehled metod

podle použitého analytického systému

Stále je platné obecné dělení laboratorních metod stanovení hormonů na metody kvalitativní (tedy průkaz hormonu ve smyslu ano/ne – příklad: současné jednokrokové těhotenské testy), metody semikvantitativní (hrubá kvantifikace hormonu ve smyslu menší než/větší než, příklad – jednokrokové ovulační testy na principu semikvantitativního stanovení lidského luteinizačního hormonu /hLH/ v moči), metody kvantitativní (určení koncentrace hormonu, pří klad – klasická radioimunoanalýza).

Obecné charakteristiky metod

1. Citlivost – definována jako minimální zjistitelná koncentrace hormonu, která může být odlišena od nulové koncentrace se zvolenou pravděpodobností.

2. Specifičnost – popisovaná jako stupeň selektivity, s jakým je prokazován vyšetřovaný hormon v přítomnosti podobných substancí. Je udávána jako poměr váhových či mezinárodních jednotek či jako stupeň zkřížené reakce v %.

3. Přesnost a reprodukovatelnost – přesnost měřicí metodyje v praxi většinou uváděna jako tzv. kumulativní přesnost nazývaná reprodukovatelnost. Reprodukovatelnost je chyba ve výsledku analýzy vyjádřená jako variační koeficient v % (% CV) při určité koncentraci/koncentracích měřené látky. Je uváděna jako chyba „uvnitř měření“ (intra-assay) (chyba při současném měření vzorku ve více opakováních /replikátech/). Oproti tomu chyba „mezi měřeními“ (inter-assay) je chyba mezi měřeními konkrétního vzorku ve více stanoveních (týž /zmražený/ vzorek změřen opakovaně např. v dvaceti různých dnech). Výše uvedený parametr citlivosti metody je přímo závislý na její reprodukovatelnosti.

4. Správnost – zjišťována je a) tzv. metodou standardního přídavku hormonu, kdy je po přidání známého množství hormonu porovnávána závislost teoretické koncentrace hormonu na změřené. Hodnotí se korelační koeficient; b) testem ředění, kdy se hodnotí po opakovaném naředění závislost teoretické koncentrace hormonu na změřené jako korelační koeficient.

Metody klasické chemie

Dnes překonaná kategorie málo citlivých a nespecifických metod, ve kterých nebyl stanovován jednotlivý hormon, ale metabolity skupiny hormonů v moči sbírané většinou 24 hodin. Příkladem je stanovení odpadových produktů kortizolu, které spolu s odpadovými metabolity androgenů tvoří skupinu 17 oxosteroidů (nesprávně 17 ketosteroidů) v moči metodou dle Zimmermanna. Též byly stanovovány metabolity estrogenů v moči, tzv. „celkové estrogeny“ či estriol ve sbírané moči. Z uvedeného je jistě zřejmé, jak hrubou a nepřesnou informaci mohly tyto metody poskytnout.

Metody imunoanalýzy

Používané pojmy

Metody imunoanalýzy jsou založeny na reakci antigen-protilátka. Využívá se unikátních vlastností protilátek reagovat s antigenem specificky i při velmi nízkých koncentracích obou komponent reakce a relativně pevné vzájemné vazby ve vzniklém imunokomplexu. Protilátky jsou proteiny secernované B buňkami lymfocytů proti cizorodým látkám (humorální imunita). Takovéto cizorodé látky, schopné vyvolat imunitní odpověď, se nazývají antigeny. Protilátky jsou tvořeny proti konkrétním vazebným místům na molekule antigenu zvaným epitopy. Na imunitní reakci se podílí velké množství aktivovaných lymfocytových linií (klonů), které produkují směs protilátek proti jednotlivým epitopům antigenu – tzv. polyklonální protilátky. Dalším pokrokem byl objev, že lymfocyty mohou být fúzovány s myelomovými buňkami a separovány tak, že lze získat klony produkující protilátku proti jednomu jedinému epitopu – tzv. monoklonální protilátku.

Klasické imunochemické metody

Základy imunochemie jako oboru položil roku 1895 Bordet prací zabývající se vlastnostmi „imunního séra“. Prakticky bylo reakce antigen-protilátka využito již v třicátých letech tohoto století v reakcích imunoprecipitačních (shlukování komplexů antigen-protilátka ve formě precipitátu), aglutinačních (antigen či protilátka navázány na nosič – např. erytrocyt, latexovou částici, výsledkem reakce je viditelné shlukování částic) (viz imunoanalýzu s využitím korpus kulárních částic). V padesátých letech byla popsána metoda jednoduché lineární imunodifúze (antigen difunduje z místa aplikace v např. agarovém gelu nasyceném protilátkou, v místě rovnovážné koncentrace se vytvoří precipitační linie) a imunoelelektroforéza (dělení látek na nosiči v elektrickém poli a následná detekce založená na reakci antigen-protilátka). Principy těchto metod jsou dále aplikovány v současné praxi.

Radioimunoanalýza

Technika označení jedné z komponent reakce antigen-protilátka radioaktivním prvkem (markerem) a jejich následného měření i v nízkých koncentracích byla poprvé publikována v r. 1959 v klasické práci R. Yalowové a S. Bersona. Jako první metoda umožnila radioimunoanalýza (RIA) měřit fyziologické hladiny hormonů v krvi a transformovala endokrinologii a další obory v kvantitativní disciplínu. Jako fascinující se jevila náhlá možnost stanovit biologicky aktivní látky v hladinách nanogramů až pikogramů na mililitr biologické tekutiny, což je pro názornost citlivost kvantitativně srovnatelná s detekcí kostky cukru rozpuštěné v plaveckém bazénu.

Klasická RIA je založena na principu soutěže (kompetice) značeného antigenu a neznačeného antigenu vzorku o omezený počet molekul protilátky (viz Schéma).

Vzniklý imunokomplex je nutno oddělit od nezreagovaných zbytků značeného a neznačeného antigenu. Následně se měří radioaktivita buď imunokomplexu (většinou), nebo nezreagované složky. Platí, že v jakém vzájemném poměru vstupuje značený a neznačený antigen do reakce, v takovém z ní vystupuje (Obr. 1). Koncentraci značeného antigenu známe, lze ji měřit (biologická aktivita, vážení), do reakce vstupuje jako 100 % aktivity. Ta je měřena jako počet rozpadů radioaktivního prvku za minutu (counts per minute /c. p. m./). Pro známé (např. odvážené) koncentrace hormonu lze sestrojit kalibrační křivku, kde každá koncentrace odpovídá určité změřené aktivitě. Pokud současně měříme vzorek s neznámou koncentrací hormonu, vynesením změřené aktivity proti kalibrační křivce získáme jeho koncentraci.

V současných rutinně prováděných RIA je často uplatňován princip tzv. „two site“ imunometrické metody, tzv. IRMA. Využívá faktu, že řada vysokomolekulárních látek (např. proteiny) má na svém povrchu více vazebných míst (epitopů). V reakci jsou použity dvě protilátky, každá proti jinému epitopu molekuly. Vazba protilátek na antigen může probíhat po sobě (sekvenčně) (Obr. 2), což je nutností při použití polyklonálních protilátek, nebo zároveň při nutnosti použití monoklonálních protilátek (Obr. 3) – tzv. jednokrokové „one-step“ metody. K oddělení imunokomplexu od nezreagované složky s výhodou slouží zakotvení první protilátky na nosiči (sorbentu) (viz Obr. 2, 3).

Pro značení je jako radioaktivní prvek (marker) používán izotop jódu 125 (125I) (g-záření) nebo méně často tritium (3H) (b-záření). Nevýhodou použití radioaktivního prvku – jódu 125 – jako markeru je krátký poločas rozpadu, a tedy krátká doba použitelnosti (řádově týdny). Automatizace analýzy je u RIA obtížná. Většina laboratoří dnes používá jednoduché gama počítače impulsů, které měří zároveň několik vzorků.

Enzymová imunoanalýza (enzymimunoanalýza)

Použití enzymu jako markeru reakce antigenu-protilátka představovalo jednu z prvých alternativ k RIA, základní principy enzymimunoanalýzy (EIA) byly propracovány na počátku sedmdesátých let. V současnosti se jedná o velice rozšířenou metodu. Mnoho enzymů lze měřit za velmi nízkých koncentrací využitím jejich katalytických schopností – přeměny neutrálního substrátu za vzniku barevného, fluorescenčního nebo luminiscenčního produktu. Principem se neliší od výše popsaných principů RIA metod. Využívá se většinou „two site“ variant s imobilizací prvé protilátky na pevném nosiči (sorbentu) (např. stěna zkumavky, magnetické částice) nazývaných ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) a jejich modifikací. Klasický princip je shodný jako na Obr. 3. Aktivita enzymu je měřena (např. tak, že po konečném kroku – promytí je do zkumavky přidán substrát, který je enzymem rozkládán za vzniku barevného produktu. Reakce se ukončí (změnou pH – např. přidání kyseliny) a koncentrace barevného produktu je měřena na fotometru jako absorbance. Výhodou metody je stabilita enzymu, tedy dlouhá použitelnost re agencií a nutnost méně časté rekalibrace testu. Nejčastěji používanými enzymy jsou alkalická fosfatáza a křenová peroxidáza. Velmi citlivé jsou kombinace enzymimunoanalýzy s jinými metodami (viz níže).

Fluorescenční imunoanalýza

Některé látky (lanthanidy, sérové proteiny aj.) jsou schopné absorbovat světlo jedné vlnové délky a emitovat světlo jiné vlnové délky. Zařazením vhodných filtrů lze měřit jen emitované světlo. Citlivost průkazu fluorescenčních markerů může být ovlivněna inteferencí sérových proteinů, NADH, bilirubinu aj. Lze ji omezit použitím vhodných markerů, jako např. chelátů europia, které emitují světlo dlouhou dobu – tedy delším intervalem mezi ozářením a měřením emitovaného světla (time-resolved fluorescence). Princip fluorescenční imunoanalýzy je shodný s již popsanými (Obr. 2, 3).

Další možností je kombinace metod – enzymimunoanalýza, která používá substrát přeměňovaný enzymem na fluorescenční produkt. Takovéto metody vykazují řádově vyšší citlivost nežli konvenční radioči enzymimunoanalýza.

Chemiluminiscenční imunoanalýza

Luminiscenční látky jsou schopny emitovat světlo v průběhu chemické reakce. Patří sem např. acridinium estery. Lze je použít k přímému značení antigenů či protilátek (principiálně shodné s použitím 125I). Chemicky např. při zvýšení pH se v alkalickém prostředí ester štěpí na nestálý meziprodukt, který emituje „záblesk“ světla. Metoda je často používána v kombinaci s enzymimunoanalýzou, k inicializaci produktu se používá chemická reakce. Chemiluminiscenční metody obecně patří k nejcitlivějším a jsou v endokrinologii široce využívány.

Imunoanalýza s využitím partikulárních částic

Nejjednodušší variantou jsou metody aglutinační, použitelné pro velké molekuly, jako např. proteiny, kdy antigen či protilátka je vázána většinou na erytrocyty (pamětníci jistě vzpomenou na těhotenský test Gestagnost Sevac) nebo na latexové částice. Tyto metody, dnes překonané, byly hodnotitelné pouhým okem, ale měly malou citlivost a specifičnost. Vyhodnocovala se aglutinace (shlukování) částic. Nověji byly ve spojení s monoklonálními protilátkami použity jako marker koloidní kovy či částice obarveného latexu. Metody se vyznačují dobrou citlivostí i specifičností a jsou v našem oboru využívány zejména jako jednokrokové těhotenské testy (kvalitativní stanovení hCG) nebo jednokrokové testy k predikci ovulace (semikvantitativní stanovení hLH).

Další metody a kombinace metod

Imunoanalytické metody mají velké množství různých variant a kombinací. Recentně se objevují i kombinace s metodami molekulární biologie/genetiky. Lze uvést např. metodu (jedná se o „two site“ /sendvičový/ systém), kde na prvou imobilizovanou protilátku se váže antigen, na jeho další epitop druhá protilátka označená fragmentem DNA kódujícím enzym luciferázu (markerem je fragment DNA). Následuje in vitro reakce transkripce/translace, která produkuje do roztoku aktivní molekuly enzymu a chemiluminiscenční reakce.

Současné problémy v imunoanalýze

Současné imunoanalýzy mohou být ovlivněny interferencí s některými látkami (revmatoidní faktor, vazebné proteiny aj.), i když dříve častý problém zkřížených reakcí se strukturálně podobnými a dalšími látkami (příměsi) řešilo použití monoklonálních protilátek. A to do té míry, že si nyní musíme klást otázku, zda nejsou naše imunoanalýzy „příliš specifické“. Monoklonální protilátky detekují vždy určité epitopy antigenu dané prostorovou konfigurací molekuly. Změna struktury molekuly může způsobit změnu epitopu a nemožnost vazby původní protilátky. Budou-li například obě protilátky cíleny (jen teoretický příklad) proti beta části molekuly hCG (hLH, hFSH), budou teoreticky detekovat nativní molekulu hormonu, ale i volnou beta podjednotku hormonu. Výsledkem bude tedy součet obojího (hCG+b-hCG podjednotka). Budou-li protilátky cíleny proti epitopům v alfa a beta části, výsledkem bude teoreticky rozeznání jen nativní molekuly hormonu. Přestože takto je problém zjednodušen a protilátky rozlišují podle prostorové konformace molekuly, v praxi se projevuje. Různé komerční firmy produkující soupravy pro imunoanalytická stanovení používají monoklonální protilátky proti různým epitopům hormonu, použitím více souprav u jediného vzorku pak dojdeme k rozdílnému výsledku. Problém se ještě zhorší, počítáme-li s různými molekulárními formami hormonu (pro náš příklad např. tzv. nicked-forma hCG/rozštěpení vazby /změna prostorové konfigurace/ v oblasti beta podjednotky hormonu). Pro takovouto molekulu může mít použitá protilátka sníženou/zvýšenou afinitu. Polymorfismus molekulárních forem hormonu je problémem u stanovení glykoproteinových hormonů, zejména u hLH (souvisí s polymorfismem genu – viz níže). Problémem imunoanalýz současné doby je tedy zejména standardizace.

Schopnosti monoklonální protilátky detekovat určitou molekulární formu hormonu lze využít pro diagnostiku – např. hyperglykosylované formy hCG (unikátní varianta/rozdíl v glykosylaci hCG) pro screening Downova syndromu či této a nicked-formy hCG (viz výše) pro diagnózu a sledování nemocí trofoblastu.

Automatizace imunoanalytických metod

Automatizace imunoanalytických metod se rozvíjela paralelně s propracováním metodik imunoanalýzy. Nové trendy (zavedení monoklonálních protilátek, amplifikace signálu použitého markeru apod.) se projevily zejména v parametrech citlivosti a specifičnosti metody. Parametr citlivosti je, jak uvedeno výše, dále závislý na přesnosti a reprodukovatelnosti. Moderní analyzátory se svým strojově přesným pipetováním reagencií a přesným časováním doby jednotlivých reakčních kroků přinesly vylepšení právě těchto parametrů. Bylo také možno snížit náklady snížením pipetovaných objemů vzorku a reagencií. Současné analyzátory jsou vysoce automatizovány, umožňují zpracování velkých objemů vzorků pro širokou paletu analytů v relativně krátkém čase s možností předřazení vzorků statimových, minimální manipulaci se vzorkem (čárový kód) a reagencii (čárový kód). Reagencia jsou skladována přímo v chlazeném prostoru analyzátoru, statistické informace o reagenciu a metodě jsou již uloženy v paměti analyzátoru. Zjednodušila se obsluha a dále propracovaly ovládací programy, které zpracovávají i statistiku metod, ukládá se databáze pacientů. Propojení s nemocničním informačním systémem dále urychluje procesy komunikace a zpracování vzorku.

Testy biologické aktivity (tzv. bioassay)

Cílová buňka reaguje na molekuly signální látky (hormonu) prostřednictvím specifických vazebných proteinů nazývaných receptory. Hormon je definován právě svojí biologickou aktivitou, tj. specifickým účinkem na živou buňku, její části, orgán či celý organismus. Klasické metody využívaly jako kritéria změnu hmotnosti ovaria, testes, prostaty nebo dělohy testovaného zvířete. Byly využívány i jako rutinní metody – těhotenský test (v ČR některá pracoviště až do roku 1985). Standardizace většiny těchto metod je i dnes obtížná (např. různé molekulární formy glykoproteinových hormonů). Denaturace hormonu (např. zahřátím polypeptidu) změní složitou kvarterní strukturu a „zničí“ biologickou aktivitu, nedojde k vazbě na receptor. Na některá vazebná místa se však stále mohou vázat protilátky – tzv. „imunologická aktivita“ – imunoanalytické metody tedy nemusejí nutně detekovat biologicky aktivní formu hormonu .

Radioreceptorová analýza (RRA) a biologické systémy

Obdobně jako klasická forma RIA metody radioreceptorová analýza využívá kompetitivního principu. Receptor, nikoli protilátka, zde funguje jako vazebný protein. Hormon se váže na receptor, který zprostředkovává jeho biologickou aktivitu. Jako zdroj receptorů obvykle slouží buňky či cílové tkáně, používají se většinou definované buněčné linie. Radioreceptorové analýzy mohou být použity k prosté kvantifikaci hormonu, ale většinou slouží jako nástroj studia vazby molekulárních forem hormonů, typů receptorů a aktivace dalších nitrobuněčných procesů (včetně jaderných) zprostředkované hormon-receptorovým komplexem. RRA byla široce využita k měření autoprotilátek proti receptorům hormonů např. pro tyreotropní hormon (hTSH) či inzulín. U pokusných zvířat se musí počítat s metabolizací, event. vylučováním hormonu, vedlejšími efekty podaných látek apod. Geneticky modifikovaných pokusných zvířat je využíváno v kombinaci s řadou metod molekulární genetiky/endokrinologie.

Metody molekulární

biologiemolekulární genetiky

Metody imunoanalýzy a biologické systémy jako první umožnily studovat účinky, syntézu, kontrolní mechanismy i metabolismus hormonů za pato/fyziologických okolností. Mnoho aplikací těchto metod na molekulové úrovni, např. vývoj i použití monoklonálních protilátek, lze také zařadit do metod molekulární biologie. Další pokrok ve studiu struktury a funkce hormonů znamenají metody současné genetiky. Původní endokrinologické studie typu „protein/polypeptid/steroid apod. a jeho biologický účinek“ se rozšířily na výzkum celého řetězce provázaných vztahů od transkripce genetické informace až po syntézu hormonu a jeho biologický účinek. Dnes se již nemusí izolovat malá množství proteinů či polypeptidů (jako dříve prováděné techniky přípravy lidských gonadotropinů či prolaktinu z lidských hypofýz), ale lze získat molekuly mRNA kódující tyto hormony. Komplementární cDNA molekuly zpětně připravené z těchto předloh (viz níže) mohou být namnoženy, takže následně lze studovat sekvenci kódující cDNA i sekvenci aminokyselin hormonu. Lze provést i malé změny původní genetické informace, zavádět takto změněnou DNA do hostitelských buněk a studovat následné modifikace hormonální struktury (metoda klonování DNA, tedy zavedení vybrané sekvence cDNA do DNA příjemce, kterým je např. bakteriální plazmid, čímž vznikne nová, tzv. rekombinantní DNA. Ta se dále replikuje, lze ji izolovat a studovat). Nebo obráceným postupem, zmapováním sekvence změněného proteinu, se zpětně dostáváme ke studiu mutace genu, který tuto změnu způsobil. Pro praktické uplatnění poznatků molekulární genetiky se dnes používá pojem genetické inženýrství. Tento bouřlivě se rozvíjející obor má dnes největší praktické využití v oblasti diagnostiky dědičných chorob včetně prenatální diagnostiky, v budoucnu zřejmě i v kauzální terapii těchto onemocnění.

Rekombinantní DNA techniky

Vývoj rekombinantních DNA technologií umožnily dva zásadní poznatky. Byl to objev restrikčních endonukleáz a enzymu reverzní transkriptázy. Restrikční endonukleázy jsou bakteriální enzymy, které chrání baktérii před vniknutím cizorodé DNA, tj. před napadením baktérie bakteriofágem. Cizí DNA je enzymem rozštěpena, vlastní DNA je chráněna (např. metylací bází). Lze vybrat restrikční endonukleázy, které jsou schopny štěpit specifické cílové místo molekuly DNA dané pořadím bází. Protože známe cílová místa použitých endonukleáz, jejich postupným použitím a kombinacemi získáme různě dlouhé fragmenty studované DNA. Po jejich utřídění můžeme pak stanovit sekvenci bází ve fragmentech a postupně celou strukturu studovaného řetězce. Při zkoumání velikosti restrikčních fragmentů je používána metoda tzv. Southern přenosu (Southern blotting).

Southern přenos – (stručný princip) provede se rozdělení získaných fragmentů DNA gelovou elektroforézou. Rozdělené fragmenty se přenesou na nitrocelulózovou nebo nylonovou membránu. Fragmenty se pak na membránu fixují (teplotou, UV světlem), přitom dochází k jejich denaturaci (tedy rozdělení obou komplementárních vláken DNA od sebe). (Pokud by došlo k denaturaci DNA v roztoku, při ochlazování by došlo znovu k renaturaci, obnovení vodíkových můstků mezi komplementárními vlákny. Zde jsou ale vlákna fixována na podložku). Poté radioaktivně značená sonda – jednovláknová DNA – hybridizuje s těmi restrikčními fragmenty, vůči kterým je komplementární. Radiograficky se pak detekuje lokalizace fragmentů, u kterých došlo k hybridizaci. Jako sondy lze používat DNA z genových knihoven nebo cDNA, což je komplementární DNA získaná reverzní transkripcí ze známé RNA.

Objev reverzní transkriptázy v některých virech prokázal možnost přenosu genetické informace z molekuly RNA do molekuly DNA. Enzym umožňuje přípravu komplementární cDNA z mRNA, což je základní krok pro následnou přípravu rekombinantní DNA pro klonování. Metoda je založena na faktu, že zatímco buňka obvykle obsahuje jen 2 kopie genu kódujícího např. určitý polypeptid, zároveň obsahuje 10 000 až 100 000 kopií komplementární mRNA. Využívají se zde metody Nothern přenosu (Nothern blotting) a polymerázová řetězová reakce (PCR – Polymerase Chain Reaction).

Nothern přenos – analogická metoda, stejně jako Southern přenos slouží k dělení fragmentů RNA. Názvy metodik nemají žádnou souvislost se světovými stranami.

Polymerázová řetězová reakce – umožňuje zmnožení (amplifikaci) vybraných sekvencí DNA. Používají se opakované cykly tepelné denaturace DNA. Zahřátím na teplotu 95–96 °C dojde k oddělení obou vláken DNA. Následuje ochlazení (37–70 °C) a přidání tzv. primerů. Primery jsou jednovláknové krátké oligonukleotidy, syntetizované podle přesného plánu. Musejí být velmi čisté. K sestavení primeru musíme znát začátek a konec sekvence, kterou chceme množit. Primer se pak přichytí (hybridizuje) na principu komplementarity na část DNA. Za pomoci DNA dependentní polymerázy (při teplotě 72 °C) pak probíhá prodlužování primeru, tedy replikace pouze těch částí DNA, na jejichž začátek byl přichycen primer. Následuje další denaturace a cyklus se opakuje. Teoreticky lze očekávat množení úseku geometrickou řadou. PCR tedy umožňuje získání velkého množství DNA z velmi malých množství výchozího materiálu.

Western přenos (Western blotting) je metoda analogická s výše uvedenými blotting metodami a slouží k rozdělení a identifikaci proteinů.

Potenciální aplikace rekombinantní DNA technologie

Syntéza rekombinantních proteinů

Uměle připravené sekvence DNA či segmenty DNA z jádra lze metodami genetického inženýrství vpravit do hostitelských baktérií, kvasinek, buněk hmyzu či uměle pěstovaných buněčných linií. Ty pak budou produkovat segmentem DNA kódovaný protein. První úspěšná klonování DNA pro inzulín a růstový hormon ukázala, že můžeme určovat strukturu proteinů dekódováním nukleotidové sekvence. Takto uměle připravených polypeptidů/proteinů je dnes velké množství, řada z nich je používána pro terapeutické účely (rekombinantní interferony, interleukiny a jejich receptory, růstové faktory, z hormonů např. inzulín, glukagon, růstový hormon, testosteron). Praktickou aplikaci v oboru gynekologie a porodnictví má rekombinantní folikulostimulační (rhFSH) a luteinizační (rhLH) hormon.

Diagnostika endokrinních onemocnění

Dostupnost rekombinantních molekulárních sond a restrikčních endonukleáz vedla k přímé detekci mutací, genových delecí a inzercí. Získáme-li DNA od jedinců stejného druhu a působíme-li na ni restrikční endonukleázou, měly by být fragmenty stejně dlouhé. V praxi to tak zcela není. Vysvětlením polymorfismu může být změna – mutace – některého nukleotidu v cílové sekvenci. Enzym pak v této sekvenci neštěpí a fragment má délku součtu dvou původních fragmentů. Změny mohou obdobně vést i ke zkrácení fragmentu. Mapa fragmentů je pro jedince vysoce specifická (stejný obraz pravděpodobnost 1 : 69 miliardám) a ve spojení s PCR je obecně používána v endokrinologii, ale i např. v kriminalistice či soudní medicíně. Takto lze nalézt korelaci fragmentu obsahující konkrétní mutaci DNA se specifickým onemocněním. Druhou možností je pak za použití sondy hledat již známé bodové mutace na specifických genech.

Přestože sterilita, infertilita, nemoc polycystických ovarií a další poruchy ještě nedávno nebyly nahlíženy z hlediska dědičných chorob, je u člověka detekováno stále rostoucí množství mutací ovlivňujících reprodukci a endokrinní situaci.

Genová terapie

Úspěch budoucí genové terapie závisí na vývoji metod umožňujících vpravit minimálně invazívním způsobem funkční gen do lidské buňky. Uvažuje se o strategiích zavedení doplňkové funkční kopie genu do genomu buňky (prostřednictvím virového nosiče nebo endocytózou umělých kapsulí), což bylo již odzkoušeno na zvířatech, cílenou opravou mutace nebo inhibice genové exprese, u nádorových buněk jejich cíleným usmrcením (např. změnou vlastností a likvidací imunitním systémem). Všechny metody jsou v různých stadiích testování a jejich budoucí využití s sebou přináší řadu etických problémů.

BALTIMORE, D. Viruses, polymerases, and cancers. Science, 1976, 192, p. 632–636.

COLE, LA., KARDANA, A. Discordant results in human chorionic gonadotropin assays. Clin Chem, 1992, 38, p. 263–270.

DAVIES, C. Technical performance concepts. In WILD, D. (Ed.), The immunoassay handbook. New York : Stockton Press, 1994, p. 83–100.

ENGVALL, E., PEARLMANN, P. Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry, 1971, 8, p. 871–874.

FURUI, K., et al. Identification of two point mutations in the gene coding luteinizing hormone beta subunit, associated with immunologically anomalous LH variants. J Clin Endocrin Metab, 1994, 78, p. 107–113.

HABENER, FJ. Genetic control of hormone formation. In WILSON, JD., FOSTER, DW., KRONENBERG, HM.,LARSEN, PR. (Eds), Williams textbook of endocrinology. Philadelphia : W. B. Saunders Company, 1999, p. 11–41.

LAYMAN, LC. Mutation in human gonadotropin genes and their physiologic significance in puberty and reproduction. Fertil Steril, 1999, 71, p. 201–218.

PRESL, J. Bioaktivní a imunoreaktivní gonadotropiny. Čs gyn, 1986, 51, s. 354–358.

SELBY, C. Interference in immunoassay. Ann Clin Biochem,1999, 36, p. 704–201.

SOINI, E. Instrumentation: phohotometric and photon emission immunoassays. In COLLINS, WP. (Ed.), Alternative immunoassays. Chichester : Wiley Medical Publication, 1985, p. 87–102.

STÁRKA, L., et al. Genetic variant of luteinizing hormone in Czech Republic. Endocr Regul, 1999, 33, p. 103–108.

THEMMEN, APN.,HUHTANIEMI, IT. Mutations of gonadotropins and gonadotropin receptors: elucidating the physiology and pathophysiology of pituitary-gonadal function. Endocrin Rev, 2000, 21, p. 551–583.

YALOW, RS., BERSON, SA. Assay of plasma insulin in human subjects by immunological methods. Nature, 1959, 184, p. 1648–1649.

YOUNG, SD. Laboratory automation: Smart strategies and practical applications. Clin Chem, 2000, 46, p. 740–745.

e-mail: podrouzek@mail.upmd.cz

Literatura

Ohodnoťte tento článek!