Likvorová diagnostika roztroušené sklerózy

Souhrn

Vyšetření mozkomíšního moku je základní vyšetřovací metodou v neurologii používanou k diferenciální diagnostice řady zánětlivých, autoimunitních či neurodegenerativních onemocnění CNS. V důsledku nutnosti minimalizace diagnostických chyb byl vytvořen panel laboratorních likvorových vyšetření nezbytných k diagnostice a diferenciální diagnostice roztroušené sklerózy.
Patří k nim kvantitativní a kvalitativní cytologie, základní biochemické vyšetření, posouzení stavu hematolikvorové bariéry, vyšetření intratekální syntézy IgG a stanovení počtu oligoklonálních IgG pásů.

Klíčová slova roztroušená skleróza • mozkomíšní mok • intratekální syntéza

Summary

Sladkova, V., Mares, J. Diagnosing multiple sclerosis by examining cerebrospinal fluid An examination of the cerebrospinal fluid (CSF) is the essential examination method used in neurology, used for differential diagnostics of a number of inflammatory, auto-immune or neurodegenerative diseases of the CNS. Due to the necessity of minimising diagnostic errors, a panel of laboratory examinations of the CSF was developed, essential for diagnosis and differential diagnostics of multiple sclerosis.
Among those are quantitative and qualitative cytology, basic biochemical examinations, examination of the condition of the blood-CSF barrier, examination of intrathecal IgG synthesis and determination of the number of oligoclonal IgG bands.

Key words multiple sclerosis • cerebrospinal fluid • intrathecal synthesis

Vyšetření mozkomíšního moku je základní vyšetřovací metodou v neurologii používanou k diferenciální diagnostice řady zánětlivých, autoimunitních či neurodegenerativních onemocnění CNS.
Mozkomíšní mok je čirá, bezbarvá tekutina tvořící se v chorioideálních plexech a vyplňující subarachnoideální prostory, mozkové komory a spinální kanál. Vstřebává se prostřednictvím arachnoideálních klků a paccionských granulací do nitrolebních venózních splavů, převážně do sinus sagitalis superior. Šedesát procent likvoru vzniká filtrací ze séra, zbylých 40 % má původ v extracelulární tekutině tkáně CNS. U dospělých jeho celkový objem činí 150–180 ml, průměrná denní produkce je kolem 500–600 ml.(1) Průkopníkem likvorového vyšetření a prvním, kdo provedl lumbální punkci, byl německý lékař a vědec Heinrich Irenäus Quincke (1842–1922), který již v roce 1891 popsal provedení lumbální punkce. Byl to právě on, kdo zavedl do praxe metodiku vyšetření mozkomíšního moku: stanovení počtu buněk v likvoru, koncentrace bílkovin a glukózy a mikrobiologické vyšetření. Zabýval se i likvorovou tenzimetrií (měřením tlaku likvoru). Rutinním vyšetřením se lumbální punkce stala až v průběhu následujících desetiletí. K výraznějšímu posunu v možnostech likvorové diagnostiky došlo v posledních 30 letech se zavedením nových imunochemických laboratorních metod k průkazu řady proteinů specifických pro jednotlivá onemocnění CNS.(2) Podle revidované verze McDonaldových diagnostických kritérií z roku 2011 je základní metodou nutnou k diagnostice roztroušené sklerózy (RS) vyšetření magnetickou rezonancí, likvorové vyšetření je pouze metodou pomocnou k potvrzení primárně progredientní formy RS. V klinické praxi je ovšem jedinou možností, jak definitivně potvrdit přítomnost demyelinizace a vyloučit jiná onemocnění.
V důsledku nutnosti minimalizace diagnostických chyb byl světovými odborníky zabývajícími se problematikou RS vytvořen panel laboratorních likvorových vyšetření nezbytných k diagnostice a diferenciální diagnostice RS (Tab. 1).
Patří k nim kvantitativní a kvalitativní cytologie, základní biochemické vyšetření, posouzení stavu hematolikvorové bariéry (HLB), vyšetření intratekální syntézy IgG a stanovení počtu oligoklonálních IgG pásů (OCB).(3) Doplňující je vyšetření tzv. MRZ reakce.

Cytologické vyšetření

K cytologickému vyšetření se používá nativní necentrifugovaný likvor. Vzhledem k tomu, že podléhá velmi rychlým morfologickým a destruktivním změnám, je dle doporučení České společnosti klinické biochemie ČLS JEP nutno provést toto vyšetření do tří hodin od jeho odběru. Počet elementů se rutinně stanovuje ve Fuchsově-Rosenthalově komůrce o objemu 3,2 mm3 – proto se dříve uváděla hodnota/3, nyní je to již hodnota absolutní. Normální počet elementů je 0–3/mm3. U RS bývá přítomna lehká lymfo-monocytární oligocytóza, tedy 20–30 elementů/mm3 neboli 20–30krát 106/l, hodnoty vyšší než 90krát 106/l dg. demyelinizace typu RS prakticky vylučují. Kromě klidových forem těchto elementů typicky nacházíme lymfocyty i monocyty se známkami aktivace, plazmocyty a buňky tvaru pečetního prstenu (Obr. 1). Plazmocyty jsou posledním vývojovým stadiem B-lymfocytů, produkují protilátky. Typicky mají excentricky uložené jádro s kondenzovaným chromatinem, bazofilní cytoplazmou a perinukleárním projasněním cytoplazmy.(4) V období ataky lze zachytit i neutrofilní a eozinofilní granulocyty.(2) Normální cytologický obraz ovšem nevylučuje diagnózu demyelinizace.(1)

Základní biochemické vyšetření

Základní biochemické vyšetření zahrnuje stanovení množství bílkovin (proteinorachie), cukrů (glykorachie) a chloridů. U RS může být hraničně vyšší proteinorachie, ostatní parametry bývají v normě.

Stanovení funkce hematolikvorové bariéry (HLB)

Hematolikvorová bariéra je tvořena endotelem chorioideálních plexů a sítí drobných kapilár v pia mater. Jedná se o dynamický systém umožňující transport látek mezi sérem a likvorovým kompartmentem. Majoritním mechanismem transportu je difúze proteinů ze séra do likvoru dle koncentračního gradientu, větší molekuly (např. IgM) procházejí pomaleji, menší molekuly (např. IgG, albumin) naopak rychleji. Zvýšení koncentrace určité látky v séru má za následek současné zvýšení koncentrace této látky i v likvoru, přičemž poměr obou koncentrací zůstává konstantní.(4) Stav HLB popisuje tzv. albuminový kvocient (Qalb), neboť veškerý albumin v likvoru pochází ze séra. Qalb je dán poměrem koncentrace albuminu v likvoru a koncentrace albuminu v séru. Permeabilitu (propustnost) HLB ovlivňuje celá řada faktorů, např. dilatace cévního endotelu chorioideálních plexů vlivem prozánětlivých cytokinů produkovaných v důsledku zánětlivého procesu v CNS nebo věk. S narůstajícím věkem permeabilita HLB stoupá a současně s ní i referenční hodnota albuminového kvocientu (Tab. 2).(5) Albuminový kvocient, a tedy i proteinorachie stoupá také při poruše cirkulace likvoru. U RS bývá funkce HLB v normě nebo lehce porušena.

Intratekální syntéza

Průkaz přítomnosti intratekální syntézy imunoglobulinů je stěžejní pro potvrzení diagnózy RS. Ale samotné zvýšení koncentrací imunoglobulinů v likvoru ještě neznamená jejich intratekální syntézu. Mohou se sem dostat transsudací ze séra při jejich zvýšené koncentraci v séru nebo v důsledku zvýšené permeability HLB.(6) U zánětlivých a demyelinizačních procesů jsou zdrojem imunoglobulinů plazmocyty vyzrávající z lymfocytů tvořících perivaskulární infiltráty. Lze detekovat všechny třídy imunoglobulinů – IgG, IgM, IgA, včetně volných řetězců kappa a lambda. Na rozdíl od séra, kde po akutním stadiu nemoci, kdy jsou produkovány imunoglobuliny IgM, nastupuje produkce imunoglobulinů IgG charakterizující chronicitu procesu, v likvorovém kompartmentu tuto konverzi nepozorujeme. Typický imunoglobulinový vzorec IgG/ IgM/IgA prokázaný u určitého jedince zůstává po celou dobu onemocnění konstantní. Tato heterogenita imunitní odpovědi je vysvětlována teorií imunitní sítě, kdy imunitní reakce na určité agens vyvolá změny v celé imunitní síti. Po aktivaci imunitního systému CNS pak intratekální syntéza přetrvává i bez přítomnosti vyvolávajícího agens.(2) Intratekální syntézu lze prokázat kvantitativně výpočtem nebo kvalitativně vyšetřením séra a likvoru izoelektrickou fokusací s následným stříbřením, imunofixací či blottingem.(7) K výpočtu intratekální syntézy se v minulosti používaly Linkův index nebo Tourtellottova formule, podle kterých je vztah mezi Qalb, popisujícím stav HLB, a QIgG, udávajícím intratekální syntézu IgG (IgGCSF/IgGsérum), lineární, a tudíž je výpočet zatížen chybně pozitivními nálezy v případě středně a silně porušené propustnosti HLB. Proto se v současnosti používá rovnice dle Reibera, kde vztah mezi Qalb a QIgG je vyjádřen hyperbolou, zohledňuje zákony difúze a závislost koncentrace proteinů na cirkulaci likvoru. Vzhledem ke složitosti výpočtu intratekální syntézy dle Reibera se v praxi rutinně používá výpočet tzv. imunoglobulinového indexu (index IgG): • index IgG = (IgGCSF : IgGS) : (AlbCSF : AlbS) = Qalb : QIgG Podobně lze stanovit i indexy imunoglobulinů IgM a IgA. O přítomnosti intratekální syntézy svědčí hodnoty indexů IgG > 0,7, IgA > 1,2 a IgM > 2,4.(2) U RS bývá intratekální syntéza IgG prokazatelná u 72 % pacientů, IgM u 20 % pacientů a IgA u 9 % pacientů.(4) V rámci diferenciální diagnostiky je procentuální zastoupení jednotlivých tříd imunoglobulinů u různých chorob odlišné, např. IgG dominují v časné fázi bakteriální a virové meningitidy, u polyradikuloneuritidy Guillain-Barré, RS, neurosyfilis a chronické HIV encefalitidy, IgA převažují u neurotuberkulózy, mozkového abscesu a adrenoleukodystrofie, IgM u neuroboreliózy a non-Hodgkinova lymfomu. Ke zvýšení všech tříd IgG dochází u oportunních infekcí (CMV, toxoplazmózy).(8)

Oligoklonální pásy

Kvalitativní stanovení intratekální syntézy, tedy průkaz oligoklonálních pásů (OCB) v séru a likvoru, je dalším důležitým vyšetřením pro potvrzení diagnózy RS. Toto vyšetření se provádí pomocí izoelektrické fokusace (IEF) na agarovém gelu s následným imunoblotem a enzymovým barvením. Prvním, kdo tuto metodu průkazu jednotlivých subfrakcí ?-globulinů použil, byli v roce 1959 Karcher a kol (Antverpy, Belgie). Původně prováděli elektroforézu na agarovém gelu spolu se stříbřením, které bylo v roce 1986 nahrazeno imunoblottingem.(10) Za pozitivní nález je považován nález dvou a více OCB, u RS se tyto pásy typicky nacházejí v alkalické frakci elektroforetického pole.
Dle mezinárodního konsenzu pro detekci OCB z roku 1986 rozlišujeme pět základních vzorců oligoklonálních IgG (Obr. 3):(4) • typ 1 – normální nález, bez průkazu OCB, • typ 2 – oligoklonální IgG pásy pouze v likvoru (typický pro RS), • typ 3 – oligoklonální IgG pásy v likvoru a navíc identické pásy v likvoru i séru (neuroborelióza, ale i RS), • typ 4 – identické oligoklonální IgG pásy v séru i likvoru (systémová onemocnění pojiva, SLE, paraneoplastické syndromy), • typ 5 – monoklonální pásy v séru i likvoru (monoklonální gamapatie, mnohotný myelom).
U nemocných s RS pozorujeme pozitivitu OCB v 98 % případů, sérové OCB u nich nacházíme až ve 44 %. Kromě IgG lze oligoklonální pásy prokázat i ve třídě IgM a IgA. Přítomnost oligoklonálních IgM pásů u nemocných s klinicky izolovaným syndromem (po první atace RS, CIS) predikuje brzký přechod do klinicky definitivní RS (nástup 2. ataky). V případě negativity OCB je velmi přínosný průkaz volných lehkých řetězců (free light chain – FLC) kappa a lambda. Průkaz lehkých řetězců je méně senzitivní (92 %), je ovšem velmi důležitý, protože u některých nemocných nedochází k syntéze oligoklonálních IgG, ale pouze lehkých řetězců kappa.(3) Pacienti s vysokou produkcí FLC vykazují rychlejší progresi neurologického deficitu.

MRZ(H) reakce

MRZ reakcí se označuje polyspecifická intratekální syntéza IgG protilátek proti virům spalniček (measles), zarděnek (rubeolla) a planých neštovic (varicella zoster), popřípadě ještě herpes simplex viru. Její přítomnost se vysvětluje opět teorií imunitní sítě, kdy aktivace imunitní odpovědi určitým antigenem vyvolá reakce v celém imunitním systému. Tuto reakci lze detekovat všeobecně u autoimunitních zánětlivých onemocnění CNS, specifická je u RS, a to již ve stadiu CIS. Pozitivitu MRZ reakce vykazuje 84–94 % nemocných s RS, z toho 78 % protilátky proti spalničkám, 60 % proti zarděnkám a 55 % proti varicella zoster viru. Množství těchto protilátek se vyjadřuje tzv. protilátkovým indexem (antibody index, AI), který je podílem koncentrace specifické protilátky v likvoru a koncentrace této protilátky v séru. Referenční rozmezí AI se pohybuje v intervalu 0,7–1,3. Hodnota AI větší než 1,4 svědčí pro intratekální syntézu této protilátky.(2) Dle práce Rosche a kol. míra produkce IgG protilátek proti spalničkám koreluje s objemem demyelinizačních lézí a aktivitou onemocnění. U nemocných s CIS hodnota AI protilátek proti spalničkám odpovídá rychlosti přechodu do klinicky definované RS. Proto by mohlo být vyšetření MRZ reakce v rámci diagnostiky RS prediktivním faktorem aktivity onemocnění.(12) Vysoká pozitivita MRZ reakce je uváděna i u dalších autoimunit, např. u Sjögrenova syndromu, systémového lupusu či Wegenerovy granulomatózy. Naproti tomu u jiných zánětlivých afekcí, např. neuroboreliózy, neurosyfilis nebo neurotuberkulózy, je kombinovaná MRZ reakce pozitivní pouze v 0,1 %

případů.(2)

Doplňková vyšetření likvoru

K posouzení stupně zánětu a degenerativního postižení či poškození tkání CNS lze provádět vyšetření celé řady parametrů: • neuronální protilátky • protilátky proti myelinu – protilátky proti myelin-bazickému proteinu (anti-MBP), protilátky proti myelinovému oligodendrocytárnímu glykoproteinu (anti-MOG), proteolipidový protein, glykoprotein sdružený s myelinem, 2,3´-cyklická nukleotid 3´-fosfodiestéráza • protilátky proti axonům – protilátky proti neurofilamentům: lehkým (light – NFL), středním (medium – NFM) a těžkým (heavy – NFH) • zánětlivé markery – transferin, ferritin, prealbumin, orosomukoid, C-reaktivní protein, C3 a C4 složky komplementu, beta2-mikroglobulin • markery destrukce – apolipoproteiny A a B, cystatin C • cytokiny – interleukin 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12 • strukturální proteiny CNS – protein 14-3-3, neuron-specifická enoláza (NSE), protein S-100b, tau-protein, fosforylovaný tau-protein, beta-amyloid,(2) gliální fibrilární kyselý protein (glial fibrillary acidic protein, GFAP), N-acetylaspartát(13,14) Většina parametrů je v praxi běžně stanovována, některé, např. protilátky proti neurofilamentům nebo protilátky proti složkám myelinu, mají spíše výzkumný význam.

Závěr

Vyšetření mozkomíšního moku je základní a nezastupitelná metoda používaná v praxi k potvrzení diagnózy RS a současně k vyloučení jiných demyelinizačních či zánětlivých onemocnění CNS. Kromě základního biochemického vyšetření, kvantitativní a kvalitativní cytologie a posouzení stavu HLB je stěžejním vyšetřením průkaz intratekální syntézy IgG a stanovení počtu oligoklonálních IgG pásů. Při diferenciálnědiagnostických pochybách může pomoci vyšetření MRZ reakce.

Prohlášení: autoři v souvislosti s tématem práce v posledních 12 měsících nespolupracovali s žádnou farmaceutickou firmou.

Literatura

1. ADAM P., TABORSKY L., SOBEK O., et al. Cytology of cerebrospinal fluid. Medica News Publishers, 2003.
2. KALA, M., MAREŠ, J. Lumbální punkce a mozkomíšní mok. Praha : Galén, 2008. 3. FREEDMAN MS., THOMPSON EJ., DEISENHAMMER F. et al. Recommended Standard of Cerebrospinal Fluid Analysis in the Diagnosis of Multiple Sclerosis. A consensus statement. Arch Neurol, 2005, 62, p. 865–870.
4. BEDNÁŘOVÁ, J., ADAM, P. Likvorový profil u roztroušené sklerózy. Neurol pro praxi, 2002, 5, p. 249–251.
5. KELBICH, P., ADAM, P., SOBEK, O., a kol. Základní vyšetření likvoru v diagnostice postižení centrálního nervového systému. Neurol pro praxi, 2009, 10, s. 285–289.
6. HAVRDOVÁ, E., a kol. Neuroimunologie. Maxdorf, 2001.
7. SOBEK, O., ADAM, P., KELBICH, P., a kol. Vyšetření likvoru – současné možnosti. Neurol pro praxi, 2009, 10, s. 280–284.
8. REIBER, H., PETER, JB. Cerebrospinal fluid analysis: disease-related data patterns and evaluation programs. J of Neurol Sci, 2001, 184, p. 101–122.
9. HOLMOY T. The Discovery of Oligoclonal Bands? A 50-Year Annioversary. Eur Neurol, 2009, 62, p. 311–315.
10. RAMMOHAN, KW. Cerebrospinal fluid in multiple sclerosis. Ann Indian Acad Neurol, 2009, 12, p. 246–253.
11. HAVRDOVÁ, E., a kol. Roztroušená skleróza. Praha : Mladá fronta, 2013.
12. ROCHE, B., LAURENT, S., CONRADI, S., et al. Measles IgG antibody index correlates with T2 lesion load on MRI in patiens with early multiple sclerosis. PLoS One, 2012, 7, e28094.
13. AVSAR, T., Korkmaz, D., TÜTÜNCÜ, M., et al. Protein biomarkers for multiple sclerosis: semiqantitative analysis of cerebrospinal fluid candidate protein markers in different forms of multiple sclerosis. Mult Scler, 2012, 18, p. 1081–1091.
14. HARRIS, VK., SADIQ, SA. Disease biomarkers in multiple sclerosis: potential for use in therapeutic decision making. Mol Diagn Ther, 2009, 13, p. 225–244.
e-mail: sladkovav@centrum.cz

O autorovi| MUDr. Vladimíra Sládková, Ph. D., prof. MUDr. Jan Mareš, Ph. D. Univerzita Palackého v Olomouci, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Olomouc, Neurologická klinika

Tab. 1 Doporučení vycházející z konsenzu panelu odborníků pro analýzu mozkomíšního moku ke stanovení diagnózy roztroušené sklerózy(2)
Jednou z nejdůležitějších analýz je kvalitativní vyhodnocení CSF na přítomnost IgG IEF společně s imunodetekcí (blottingem nebo fixací). Kvalitativní analýza musí být provedena s nekoncentrovaným vzorkem CSF současně se vzorkem séra. Optimální je vyšetření podobného objemu dvojice vzorků CSF a séra. Pro každý vyšetřený vzorek by měly být k dispozici pozitivní a negativní kontroly, pokud jsou OCB špatně rozpoznatelné u pozitivních kontrol, nebo je jejich zvýšená produkce u negativních kontrol. Výsledky kvalitativní analýzy CSF by měly být interpretovány jako 1 z 5 rozpoznaných charakteristických vzorců OCB Interpretace by měla být provedena podle individuálních zkušeností s použitou technikou. Neurologové by měli znát všechna ostatní provedená vyšetření CSF (počet buněčných elementů, celkovou bílkovinu, glukózu, laktát a další). V určitých případech může pomoci vyřešit nejasnosti ohledně přítomnosti OCB vyšetření lehkých řetězců imunodetekcí. V případě, že trvá podezření na RS, ale výsledky analýzy CSF jsou nejasné, negativní nebo je přítomen jen jeden OCB, je ke zvážení provedení další lumbální punkce. Kvantitativní vyšetření IgG je pouze doplňující vyšetření. Nemůže nahradit vyšetření kvalitativní, které má vyšší senzitivitu a specificitu. Pokud se provádí nelineární měření intratekální hladiny IgG, je nutné vzít v úvahu stav HEB stanovením kvocientu albuminu. Laboratoře provádějící rutinní vyšetření CSF by měly být podrobeny internímu i externímu hodnocení kvality ke zjištění vysokého standardu spolehlivosti. OCB – oligoklonální pásy, CSF – mozkomíšní mok (cerebrospinal fluid)
Obr. 1 Neaktivované a aktivované lymfocyty, uprostřed plazmocyt s projasněním cytoplazmy
Obr. 2 Reiberův diagram – popisuje vzájemný vztah mezi Qalb a QIgG. Hyperbolická křivka představuje předěl mezi sérovou a intratekální imunoglobulinovou frakcí. Hodnoty nad hyperbolou jsou procentuálním vyjádřením intratekální frakce, přerušovaná vertikála je předělem mezi normální a porušenou permeabilitou HLB. 1 – normální nález 2 – porucha HLB bez intratekální syntézy 3 – porucha HLB s intratekální syntézou 4 – intratekální syntéza IgG s normální permeabilitou HLB 5 – oblast metodologické chyby (analytická chyba laboratoře)
Tab. 2 Věkově vázané referenční hodnoty Qalb(4)
Obr. 3 Imunoelektroforéza na agarovém gelu s imunoblottingem – vzorce oligoklonálních pásů v séru a likvoru

Ohodnoťte tento článek!