Ošetření mužských zárodečných buněk in vitro

V cyklech, kdy je použita inseminace spermiemi (konvenční IVF), zona pellucida funguje jako selektivní bariéra pro abnormální spermie…

1Ing. Olga Teplá, 2doc. RNDr. Jana Pěknicová, PhD.

1Sanatorium Pronatal, Praha

2Ústav molekulární genetiky AV ČR, Praha

Klíčová slova

spermie • testikulární tkáň • spermiogeneze • kultivace

Kvalita epididymálních a testikulárních spermií

V cyklech, kdy je použita inseminace spermiemi (konvenční IVF), zona pellucida funguje jako selektivní bariéra pro abnormální spermie(1). ICSI překoná bariéry, a ačkoli proces fertilizace s využitím ICSI není ještě náležitě objasněn, ukazuje se, že fertilizace může být dosaženo, jestliže jádro ve spermiích je intaktní. Řada studií na jedné straně(2) dokazuje, že vliv základních parametrů hodnocení spermií nesouvisí s úspěšností fertilizace a(3) uvádí, že morfologické abnormality spermie jsou bez návaznosti na kvalitu jádra spermie.

Na druhé straně existuje řada prací o negativním vlivu absence motility, vysoké patologie a nízkého stupně zralosti spermií (při používání epididymálních a testikulárních spermií se jedná o spermie, u nichž neproběhla kapacitace a u kterých proces zrání nemusel být ukončen) na další vývoj embryí. Abnormální hlavička spermie koreluje s nárůstem numerických a strukturálních abnormalit. Zvláště u testikulárních spermií je zaznamenán vyšší výskyt aneuploidií a diploidií než u ejakulovaných spermií, u epididymálních a testikulárních spermií je vyšší pravděpodobnost zvýšení výskytu chromosomálních abnormalit(4). Zde je nutno podotknout(5), že i spermie s abnormálním chromatinem je schopna vytvořit normálně vypadající jádro.

Nežádoucí negativní paternální efekt je zprostředkován nejen genomem spermie. Neúplná formace centrosomálních ohnisek ve spermiích, která je způsobena defektem centrosomu, může vést k absenci fertilizace(6). Nedostatečně vyvinuté centrosomy podmiňují výskyt mozaiky u embryí, která vznikla injikováním spermií získaných z nonobstrukční azoospermie(7).

Spermie normospermiků dosahují vyšší fertilizace ve srovnání se spermiemi, které byly získány operačním způsobem. Porovnání epididymálních spermií s testikulárními spermiemi nevykazuje ve fertilizaci ani v klinických výsledcích statistický rozdíl(8).

Používání spermií, které jsou získány operačním způsobem, přináší bezesporu řadu rizik. Jejich ošetření v laboratoři IVF proto musí být velmi šetrné, aby rizika spojená s jejích využitím pro ICSI byla v rámci možností minimalizována.

Metody zpracování testikulární tkáně selektivní metodou

Prvním cílem pro dosažení co nejkvalitnější populace spermií či injektovatelných prekurzorů spermií je získat kvalitní suspenzi buněk pro kultivaci in vitro. Stupeň spermiogeneze se v kanálcích varlete značně liší. Již při odběru tkáně urolog zohledňuje morfologii kanálků(9) a vyhledává spermatogenně aktivní oblasti. V těžkých případech azoospermie použitím několikastupňové selekce nejlepších kanálků varlete a selekcí buněk lze získat vhodné spermie pro ICSI.

Zpracování tkáně v laboratoři IVF je možné několika způsoby. Tkáň je možno mechanicky rozrušit pomocí sterilních jehel. Tesařík(10) publikoval použití sterilních sklíček k rozrušení tkáně a kousky tkání byly rozrušovány pomocí opakované aspirace 1 ml tuberkulínové stříkačky. Krupker et al.(11) používá skalpel a nůžky k izolování tubulů, které jsou inkubovány v Ham´s F 10 médiu po dobu 3–5 hodin, načež je supernatant centrifugován a obsah pelety je rozsuspendován do velkého množství malých kapiček, v nichž jsou vyhledávány spermie. Tuto metodu „Extended sperm preparation“, která spočívá v pečlivém prohledávání mnoha kapiček sedimentu, publikoval Ron-El et al.(12).

Pro úspěšný nález spermií jsou mnohdy části tkáně podrobeny(10) enzymatickému působení kolagenázy I (1 U/ml, Sigma) nebo elastázy (10 U/ml, Sigma) po dobu 30 min. Krupker et al.(11) používal k rozrušení tkáně kombinaci kolagenázy (0,8 mg/ml, Sigma) a trypsin inhibitoru (0,2 ml/ml, Sigma). V multicentrální studii(8) dosahovali lepších výsledků při injikování nemotilních spermií nebo elongovaných spermatid právě po enzymatickém rozrušení tkáně. Jestliže měli po izolaci motilní spermie, byly lepší výsledky mechanického zpracování tkání. Ovšem v pregnancy rate nebyl rozdíl po mechanickém a enzymatickém rozrušování tkáně pozorován.

Kultivace spermií

Kvalitu spermií lze upravit speciálními kultivacemi, které se používají před aplikací pro ICSI či mrazením, čímž se zlepší pohyb spermií a spermie se vyvážou ze Sertoliho buněk. V případě, že kanálky jsou z velké většiny morfologicky intaktní, je vhodné tkáň mechanicky rozrušit na co nejmenší kousky(13). Je nutné mít na paměti zachování parametrů média – v rozrušování tkáně lze pokračovat kdykoli v průběhu kultivace. Spermie se kultivují ve Flushing médiu (Medicult, Dánsko) nejméně po dobu 15hodin a nejdéle 3 dny za standardních podmínek (teplota 37,3°C, 5% CO2). Po kultivaci lze spermie použít na ICSI nebo mrazení. V případě, kdy kanálky jsou z velké většiny patologické, jsou kanálky s nejlepší morfologií rozvolněny a vyťaty a obsah kanálků je vytlačen doFlushing média (Medicult, Dánsko) a dálepřenesen do 30 µl ekvilibrovaného IVF média (Medicult, Dánsko) obohaceného 50 U/l FSH (Puregon, Organon) a 1 µmol/1 testosteronu (Sigma). Kapka, která je na dně misky (Falcon – kat. č. 3002), je převrstvena parafínovým olejem Liquid parafin (Medicult, Dánsko) a suspenze je kultivována 2–3 dnypři teplotě 32 °C(10). Též je možno provádět kultivaci v Petriho misce (Falcon – kat. č. 3037). Důlek je naplněn ekvilibrovaným IVF médiem (Medicult, Dánsko ) obohaceným 50 U/l FSH (Puregon, Organon) a 1 µmol/l testosteronu (Sigma), ve kterém probíhá kultivace testikulárních buněk.

Kultivace testikulárních buněk před ICSI nebo mrazením (1–3 dny) a po mrazení (1–4 h) se zdají být přínosné, protože přítomné spermie se vyvážou ze shluků testikulárních buněk a získají motilitu, která není nezbytným předpokladem pro úspěšnou fertilizaci oocytů, avšak po injekci nepohyblivých spermií se dramaticky snižuje úspěšnost(8, 14). Stanovením délky kultivace se zabývala řada prací. Edirisinge et al.(15) usuzuje, že při kultivování epididymálních spermií dochází k poklesu motility nejpozději po 5 dnech, zatímco testikulární spermie jsou ještě po týdnu motilní. Liu et al.(16) publikoval zlepšení morfologie a motility spermií za 72 h kultivace. Spermie byly získány u pacientů s obstrukční azoospermií. Angelopoulos et al.(17) stanovil maximum motility po 48 h. Balaban et al.(18) publikoval studii, při které byly spermie kultivovány v médiu, které obsahovalo FSH. Tesařík doporučuje při kultivaci testikulárních spermií média obohacená nejen FSH, ale také testosteronem. Studie ukazují, že kultivací se zvýší jednoznačně počet motilních spermií, a tudíž je možná selekce spermií před ICSI.

Na druhé straně je nutno uvést studii Wood et al.(19), kde jsou porovnávány různé doby kultivací spermií získaných z obstrukčních azoospermií. I když jsou spermie kultivovány, jejich kvalita se nezlepší. Spermie se vyváží ze Sertoliho buněk a získá se jejich větší počet pro kryokonzervaci, což se jeví výhodné. Levran et al.(20) porovnával klinické výsledky v případech, kdy spermie byly injikovány bezprostředně po jejich získání nebo druhý den. Nebyl zjištěn statisticky významný rozdíl.


===== Kryokonzervace spermií získaných operačním způsobem =====


V programu asistované reprodukce je nutné spermie získané operačním způsobem mrazit, ačkoli kryokonzervace epididymálních a testikulárních spermií přináší řadu komplikací; spermie jsou v některých případech bez pohybu a ve velmi nízkých koncentracích(21). Proces mrazení významně redukuje počet spermií s intaktní patologií hlavičky, dále pohyb spermií a jejich fertilizační kapacitu. Plazma a akrosomální membrány testikulárních spermií jsou po kryokonzervaci defektní(22).

Watkins et al.(23) sice poukazuje na nižší fertilizaci oocytů při jejich použití po mrazení, ale klinické výsledky jsou ekvivalentní s výsledky při používání čerstvých spermií. Kvalita spermií by kryokonzervací neměla utrpět – Rufas et al.(24) srovnával čerstvé a mrazené spermie zdravých mužů, kdy stav akrosomu nevykazoval rozdíl. Dokonce, jestliže byly testikulární spermie mrazeny, fertilizace byla shodná s fertilizací při použití čerstvých spermií – Francavilla et al.(25) uvádí 47,6 % vs. 48,0 %. Ve studii Habermanna et al.(26) jsou výsledky obdobné – 56 % vs. 61 %.


===== Kultivace buněčných suspenzí obsahující spermie či prekurzory spermií =====
Řešením situace, kdy v buněčné suspenzi nejsou přítomny spermie, se jeví pro oplozování vajíček použití spermatid. Spermatidy byly injikovány u zvířat již na začátku devadesátých let. Injekce spermatidou u člověka byla poprvé použita v r. 1994 dr. Edwardsem(27). Tato nová možnost přinesla povzbudivé výsledky a vedla k fertilizaci a vývoji embryí a k prvním těhotenstvím. První dítě se narodilo před pěti lety za asistence Tesaříka(28).

V roce 1999 byla publikována(29) rozsáhlá kompilační práce týkající se použití spermatid. Ta udávala 8 těhotenství po injekci kulaté spermatidy do vajíčka – 3 těhotenství po spermatidě získané z ejakulátu a 5 těhotenství po injekci kulaté spermatidy získané z testikulární biopsie. Klinické výsledky injekce těchto typů spermatid zůstávají nízké.

Když jsou v ejakulátu přístupné pouze spermatidy, je nejvhodnější podle některých autorů je použít pro ICSI v elongované fázi. Takto lze dosáhnout normální úrovně fertilizace a implantace. V tomto vývojovém stadiu máme lepší možnost je rozpoznat mezi ostatními buňkami (Sertoliho buňky, jádra Sertoliho buněk, erytrocyty, spermatocyty, dendrity). Ovšem, morfologická identifikace ještě neoznačuje buňky schopné dalšího vývoje.

Nalezené spermatidy v ejakulátu jsou však ve velkém procentu apoptotické (tzn. mají naprogramovánu smrt). Profesor Tesařík(10) dokonce udává, že až 95 % spermatid je poškozených. U pohlavních buněk, u kterých se vývoj zastavil, dochází k poškození důležitých částí, mimo jiné k poškození genetického materiálu. Proto taková spermatida nedokáže oplodnit vajíčko. Při použití těchto spermatid existuje zvýšené riziko narození geneticky poškozeného dítěte. Nejbezpečnější by bylo podrobit kulatou spermatidu individuálnímu vyšetření, které by nepoškodilo její vitalitu. Objevila se práce(30), která popisovala selekci kulaté spermatidy křečků (rhesus monkye) a býků pomocí non invazívní mitochondrion-specific fluorescent proby (Mito Tracker™), kdy jsou kulaté spermatidy selektovány na základě polarizace mitochondrií. Nadějná metoda je předmětem dalšího testování.

Jedním z možných řešení, jak získat s větší pravděpodobností zdravou spermatidu, je kultivace spermatogenních buněk v médiích, která jsou obohacena ve vysoké koncentraci rekombinantním FSH – folikostimulačním hormonem a testosteronem, popřípadě kokultivace s Vero buňkami. Jedná se o relativně jednoduchý kultivační systém zahrnující kultivaci všech typů buněk vyskytujících se v kanálcích varlete. Délka kultivace je 2–3 dny(13) – Sertoliho buňky by neměly být v kultuře déle než 2 dny. Spermatidy jsou pak schopné adekvátního vývoje.

Kultivace probíhá za nižší teploty, než je užívána pro kultivaci embryí a oocytů.

1. LIU, DY., BAKER, HNG. Morphology of spermatozoa bound to the zona pellucida of human oocytes that failed to fertilize in vitro. JReprod Fertil,1992, 94, p. 71–84.

2. NAGY, ZP., LIU, J., JORIS, H., et al. The result of intracytoplasmic sperm injection is not related to any of the three basic sperm parameters. Hum Reprod, 1995, 10, p. 1123–1129.

3. SPANO, AH., KOLSTAD, SB., LARSEN, et. al. The applicability of the flow cytometric sperm chromatin structure assay in epidemiological studies. Hum Reprod, 1998, 13, p. 2495–2505.

4. MACAS, E., IMTHURN, B., KELLER, P. Increased incidence of numerical chromosome abnormalities in spermatozoa injected into human oocytes by ICSI. Hum Reprod,2001, 16, p. 115–120.

5. TWIGG, DS., IRVINE, AITKEN, RJ. Oxidative damage to DNA in human spermatozoa does not preclude pronucleus formation at intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod, 1998, 13, p. 1864–1871.

6. ASCH, R., SIMERLY, C., SCHATTEN, G. The stages at which fertilization arrests in humans: defective sperm centrosomes and sperm asters as causes of human infertility. Hum Reprod, 1995, 10, p. 1897–1906.

7. SILBER, S., ESCUDERO, T., LENAHAN, K., et. al. Chromosomal abnormalities in embryos derived from testicular sperm extraction. Fertil Steril, 2003, 79, p. 30–38.

8. BAUKLOH, H. Retrospective multicentre study on mechanical and enzymatic preparation of fresh and cryopreserved testicular biopsies. Hum Reprod, 2002, 17, p. 1788–1794.

9. SCHLEGEL, PN. Testicular sperm extraction: microdissection improves sperm yield with minimal tissue excision. Hum Reprod, 1999, 14, p. 131–135.10. TESARIK, J., BAHCECI, M., OZCAN, C., et al. Restoration of fertility by in vitro spermatogenesis. Lancet, 1999 , 353, p. 353, 555–556.

11. KUPKER, W., SCHLEGEL, PN., AL-HASANI, S., et.al. Use of frozen-thawed testicular sperm for intracytoplasmic sperm injection. Fertil Steril, 2000, 73, p. 453–459.

12. RON-EL, R., STRASSBURGER, D., FIEDLER, S., et al. Extended sperm preparation: an alternative to testicular sperm extraction in non-obstructive azoospermia. Hum Reprod, 1997, 12, p. 1222–1226.

13. TEPLÁ, O. PĚKNICOVÁ, J., MRÁZEK, M., et. al. The implantation rate of 31,5 % per year 2002 – comprehensive azoospermia solution by Iscare IVF a. s. 9. Symposium českých reprodukčních imunologů, 2003.

14. PARK, YS., LE, SH., SONG, SJ., et. al. Influence of motility on the outcome of in vitro fertilization/intracytoplasmic sperm injection with fresh vs. frozen testicular sperm from men with obstructive azoospermia. Fertil Steril, 2003, 80, p. 526–530.

15. EDIRISINGHE, W., JUNK, S., MATSON, P., et. al. Changes in motility patterns during in-vitro culture of fresh and frozen/thawed testicular and epididymal spermatozoa: implications for planning treatment by intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod, 1996, 11, p. 2474–2476.

16. LIU, J., TSAI, YL., KATZ, E., et. al. Outcome of in-vitro culture of fresh and frozen thawed human testicular spermatozoa. Hum Reprod, 1997, 12, p. 1667–1672.

17. ANGELOPOULOS, T., ADLER, A., KREY, L., et. al. Enhancement or initiation of testicular sperm motility by in vitro culture of testicular tissue. Fertil Steril, 1999, 71, p. 240–243.

18. BALABAN, B., URMAN, B., SERTAC, A., et. al. In vitro culture of spermatozoa induces motility and increase implantation and pregnancy rates after testicular sperm extraction and intracytoplasmic sperm injection. Hum Reprod, 1999, 14, p. 2808–2811.

19. WOOD, S., SEPHTON, V., SEARLE, T., et.al. Effect on clinical outcome of the interval between collection of epididymal and testicular spermatozoa and intracytoplasmic sperm injection ICSI in obstructive azoospermia. J Androl, 2003, 24, p. 67–72.

20. LEVRAN, D., GINATH, S., FARHI, J., et. al. Timing of testicular sperm retrieval procedures and in vitro fertilization-intracytoplasmic sperm injection outcome. Fertil Steril, 2001, 76, p. 380–338.

21. SILBER, SJ., VAN STEIRTEGHEM, AC., LIU, J., et al. High fertilization and pregnancy rate after intracytoplasmic injection with spermatozoa obtained from testicle biopsy. Hum Reprod, 1995, 10, p. 148–152.

22. NOUGUEIRA, D., BOURGAIN, C., VERHEYEN, G., et. al. Light and electron microscopic analysis of human testicular spermatozoa and spermatids from frozen and thawed testicular biopsies. Hum Reprod,1999, 14, p. 2041–2049.

23. WATKINS, AU., NIETO, F., BOURNE, et. al. Testicular and epididymal sperm in a microinjection program: methods of retrieval and results. Fertil Steril, 1997, 67, p. 527–535.

24. RUFAS, O., GILMAN, A., FISCH, B., et. al. Spontaneus and folicular fluid – inducwed acrosome reaction in sperm samples from in vitro fertilizing and nonfertilizing normozoospermic patients. JAssist Reprod Genet, 1998, 15, p. 84.

25. FRANCAVILLA, S., BIANCO, MA., GORDESCHI, G., et al. Ultrastructural analysis of chromatin defects in testicular spermatids in azoospermic men submitted in TESE – ICSI. Hum Reprod, 2001, 16, p. 1440–1448.

26. HABERMANN, H., SEO, R., CIESLAK, J., et al. In vitro fertilization outcomes after intracytoplasmic sperm injection with fresh or frozen-thawed testicular spermatozoa. Fertil Steril, 2000, 73, p. 955–960.

27. EDWARDS, RG., TARIN, JJ., DEAN, N., et al. Are spermatid injections into human oocytes now mandatory? Hum Reprod, 1994, 9, p. 2217–2219.

28. TESARIK, J., MENDOZA, C., TESTART, J. Viable embryos from from injection of round spermatids into oocytes (Letter). N Engl J Med,1995, p. 333, 525.

29. PRAPAS, Y., CHATZIPARASIDOU, A., VANDERZEALMEN P., et al. Spermatid injection: reconsidering spermatid injection. Hum Reprod, 1999, 14, p. 2186–2188.

30. SUTOVSKÝ, P., RAMAHLO-SANTOS, J., MORENO, D. On stage selection single round spermatids using a vital, mitochondrion-specific fluorescent probe Mito TrackerTM and high resolution differential interference contrast microscopy. Hum Reprod,1999, 14, p. 2301–2312.

Práce vznikla díky finanční podpoře GA ČR č. 204/02/1373.

e-mail: olgatepla@tiscali.cz

**

Ohodnoťte tento článek!