Protinádorová imunita


Imunitní systém se podílí na kontrole růstu nádorových buněk, zejména v raných stadiích karcinogeneze. Imunitní reakce na nádorovou buňku má komplexní povahu a jsou do ní zapojeny všechny imunitní mechanismy nespecifické i specifické. Ústřední úlohu hrají dendritické buňky, které indukují protinádorovou reakci, pokud jsou adekvátně aktivovány. Imunoterapie dendritickými buňkami je použitelná u již diagnostikovaných nádorových onemocnění u lidí jako léčebná aktivní imunoterapie. Protinádorová imunoterapie v praxi má největší naději na úspěch, jestliže bude aplikována buď v časných fázích onemocnění, nebo v kombinaci s terapeutickými zásahy, které vedou k minimalizaci nádorové masy.

Summary

Bartůňková, J. Antitumor immunity

In this review, we first summarize current knowledge about the initiation of the immune response. Recent findings on the role of immune system in protection from cancer are discussed. Current understanding of the interactions between tumors and cells of the immune system particularly at the early stages of carcinogenesis is the rationale for immunotherapy in clinical practice. Recent data from human and mice studies clearly show that the immune system is capable of detecting and eliminating the smallest expansions of transformed cells, well before the development of clinical cancer. These advances suggest a need to change the current emphasis for harnessing anti-tumor immunity from therapy of advanced disease to the immunotherapy of early lesion.

Imunitní reakce a nádorová onemocnění

Vznik nádorového onemocnění je mnohastupňový proces komplexní povahy, v němž samotné nádorové buňky představují velmi heterogenní populaci zasazenou do kontextu mikroprostředí nenádorových buněk a tkání (cévy, stromální buňky, mezibuněčná hmota, infiltrující buňky imunitního systému aj.) a tvořící složitý nádorový „ekosystém“ (Obr. 1). Existují důkazy pro to, že imunitní systém je schopen kontrolovat růst nádorových buněk v raných stadiích karcinogeneze i ve stadiu tzv. preneoplazie. S pokročilým růstem nádoru se imunitní mechanismy víceméně paralyzují a mnohdy mají naopak podpůrný účinek ve prospěch proliferace nádorových buněk, za což jsou zodpovědné různé únikové mechanismy nádorových buněk.

Imunitní systém používá v boji proti oběma typům nebezpečí dva hlavní systémy – systém přirozené (nespecifické) imunity a systém imunity adaptivní (specifické). Složky nespecifické imunity, ať již buněčné (makrofágy, NK-buňky, granulocyty) nebo humorální (komplement, antimikrobiální peptidy, cytokiny), jsou schopny rychle patogen v organismu detekovat a eliminovat jej do určité míry bez nutnosti zapojení specifické imunity. Nespecifická imunita ale nemá mechanismy, které by zabezpečily vznik imunologické paměti. Tu zajišťují až složky specifické imunity, T- a B-lymfocyty, díky existenci množství (až 1011) různých receptorů (TCR, resp. BCR) s přesně definovanou specifitou pro nejrůznější antigeny.

Obr. 1 Nádorový ekosystém. NB – nádorová buňka, ECM – extracelulární matrix, F- fibroblast, M – makrofágy, DB – dendritická buňka, L – lymfocyty, C – céva. Podle KLENER, P. Nová protinádorová léčiva a léčebné strategie v onkologii. Praha : Grada Publishing, 2010.

Daní za tuto velkou různorodost lymfocytů ovšem je, že buněk rozpoznávajících určitý antigen je velmi malé množství, cca 1–2x 10-5. Tak malý počet je pro časnou obranu proti infekcím nepoužitelný. Pro aktivaci specifického lymfocytu musí být antigen zpracován v buňkách prezentujících antigen (APC – nejčastěji v dendritických buňkách, DC), poté složitým systémem postupných interakcí APC s T-lymfocyty dojde ke klonální expanzi a teprve po vytvoření dostatečné populace efektorových buněk se rozvíjí primární specifická imunitní reakce. Tento proces většinou trvá 4–7 dní a po tuto dobu je nutné, aby obranu zajistila nespecifická imunita. Při opakovaném setkání se stejným patogenem je již situace odlišná.

V organismu jsou již vytvořeny paměťové T- a B-lymfocyty a sekundární imunitní odpověď je mnohem rychlejší. Uvádí se, že např. po očkování se zvyšuje prekurzorová frekvence řádově, tedy na cca 1–2x 10-4 specifických lymfocytů pro daný antigen. U imunizace vůči nádorovým buňkám dochází k mnohem menšímu vzestupu specifických lymfocytů, cca trojnásobně.(1) Reakce na nádorovou buňku je tedy v principu obdobná jako na infekční agens, ale vzhledem k tomu, že se jedná o buňku vycházející z vlastních tkání, je situace komplikovanější, protože k vlastním tkáním je ustanovena imunologická tolerance. Proto se zdá, že pro udržení kontroly nad nádorovým růstem je potřeba podporovat a udržovat aktivitu protinádorových lymfocytů opakovanými „boosty“.

Úloha jednotlivých složek imunity v obraně proti nádorům

Zásadní pro racionální využití imunitního systému v léčbě nádorů je předpoklad, že imunitní systém je schopen rozeznat neoplastické buňky. Nádorové buňky vznikají komplexními mechanismy z normálních buněk organismu. Imunitní reakce proti nádorové buňce vzniká stejně jako jiné druhy imunitních reakcí, a to tehdy, jsou-li nádorové antigeny prezentovány T-lymfocytům dendritickými buňkami, aktivovanými v prostředí poskytujícím signál „nebezpečí“. Nekontrolovaný nádorový růst vznikne tehdy, pokud selžou imunitní mechanismy nebo pokud nádorová buňka vyvine účinné nástroje, kterými imunitní reakce paralyzuje. Obecně platí, že imunitní mechanismy jsou v obraně proti nádorům značně neúčinné ve srovnání s mechanismy antiinfekčními. To je způsobeno přílišnou podobností nádorových buněk buňkám normálním, takže je imunitní systém víceméně toleruje jako normální tkáně. Pokud je abnormalita nádorových buněk imunitním systémem rozpoznána, mohou se na boji s nimi podílet všechny imunitní mechanismy nespecifické i antigenně specifické, zejména pak buněčné.

Myšlenka, že imunitní systém je schopen rozeznat a odpovídat na nádorové bujení, byla poprvé formulována na počátku 20. století, když americký chirurg W. B. Coley zaznamenal vzácné regrese nádorů v průběhu bakteriálních infekcí. V roce 1950 byly publikovány studie, které ukázaly, že inbrední myši mohou být imunizovány proti nádorům indukovaným karcinogeny a že protilátky vytvořené proti odvrženému tumoru byly specifické. Tyto objevy vedly v roce 1957 k formulaci hypotézy o protinádorovém imunitním dohledu. Hypotéza byla vyslovena Thomasem a Burnetem a předpokládala existenci strážných buněk pocházejících z thymu, které trvale monitorují přítomnost transformovaných nádorových buněk.(2)

Rozhodující důkaz o roli imunitního systému v obraně proti nádorům poskytly studie na myších bez funkčních genů pro rekombinaci T- a B-buněčných receptorů RAG1 a RAG2 (RAG -/-). Tyto myši nemají T- a B-lymfocyty, protože nemohou přestavět antigenně specifické receptory. RAG -/-myši nejenže vyvinou chemicky indukované nádory rychleji a s větší frekvencí než imunokompetentní kontroly, ale také tvoří mnohem více spontánních tumorů, když pokus probíhá po dostatečně dlouhou dobu.(3) Také u pacientů s poruchami specifické buněčné imunity bývá velmi výrazně zvýšeno riziko nádorů, a to jak spontánních, tak vyvolaných viry. Úlohu jednotlivých složek specifické imunity v obraně proti nádorům pak dokázaly studie s geneticky modifikovanými zvířaty, jimž chybí nebo nesprávně fungují (např. v důsledku absence důležitých molekul, jako je např. perforin) T-, B-, NK-, NK-T-lymfocyty.

Editace nádoru imunitním systémem

Hypotézu nazývanou „Cancer immune editing“, tj. editace nádoru imunitním systémem, formuloval Dunn et al.(4) Jde o rozvinutí původní teorie Thomase a Burneta o poznatky získané během posledních let při pokusech s RAG deficitními modely. Tyto pokusy odhalily významné rozdíly v imunogenicitě nádorů v závislosti na hostiteli, ve kterém rostly. Pokud byl nádor, izolovaný z RAG-2 -/- myši bez funkčního imunitního systému, transplantovaný do myši stejného kmene, rostl se stejnou kinetikou. Stejně tak přenos nádoru rostoucího v imunokompetentní myši do kontrolní myši téhož kmene vedl k rychlé implantaci a rozvoji všech nádorů.

Zajímavé a nečekané bylo ovšem zjištění, že téměř 50 % tumorů rostoucích v RAG-2 -/imunokompromitovaných myších bylo odvrženo po přenosu do imunokompetentního hostitele. Nádory, které rostou v nepřítomnosti funkčního imunitního systému, jsou tedy více imunogenní než tumory vytvořené v imunokompetentních hostitelích. Výše uvedené výsledky naznačují, že imunitní systém vyvíjí na nádorové buňky neustálý selekční tlak, který vede k selekci takových variant transformovaných buněk, které dokáží uniknout efektorovým mechanismům imunitního systému. V procesu boje imunitního systému proti nádorovým buňkám se rozlišují 3 stadia – eliminace transformované buňky (elimination), ustanovení rovnováhy mezi transformovanou buňkou a organismem (equilibrium) a únik transformované buňky před kontrolou imunitního systému (escape).

Ve většině případů je nádorová buňka rozpoznána v časných stadiích transformace a zničena imunitním systémem. Celý proces zde může skončit nebo přejít do dalších fází. Ve fázi ustanovení rovnováhy hostitelský imunitní systém a přežívající nádorové buňky vcházejí do stadia dynamické rovnováhy. Nekonečná přizpůsobivost nádorových buněk vyplývající z rostoucí genetické nestability nakonec dá vzniknout novým genotypům, které zmenší imunogenicitu a může dojít k fázi úniku této buňky před vlivem imunitního systému. Fáze ustanovení rovnováhy je nejdelší z těchto tří procesů a klinicky se nejvíce shoduje s preneoplastickým onemocněním, které nejčastěji zůstává nediagnostikované. Výsledkem stadia rovnováhy mohou být tři různé situace: 1. kompletní eliminace nádorových buněk; 2. dlouhodobé udržení dynamické rovnováhy mezi aktivní imunitní odpovědí a populací nádorových buněk; 3. únik z kontroly imunitní reakce a rozvoj nádorového onemocnění s klinickými příznaky.

Preneoplastický stav rozeznaný imunitním systémem

Studium imunitní reakce během rozvoje nádoru je u lidí problematické, protože většina preneoplastických procesů probíhá asymptomaticky. Diagnostikován je obvykle až klinicky detekovatelný nádor. A přitom právě studium preneoplastických lézí může poskytnout velmi cenná data. První otázkou je, zda je u pacientů s preneoplazií detekovatelná imunitní odpověď proti transformovaným buňkám. Pokud ano, pak by studium antigenů, proti kterým je namířena, mohlo pomoci identifikovat antigeny, které jsou skutečně efektivní pro eliminaci nádorových buněk. Preneoplazie často zůstává po dlouhou dobu, někdy i doživotně, stacionární a je možné, že imunitní reakce je u ní namířena proti jiným antigenům než u pokročilých nádorů. Rozdíl v kvalitě imunitní reakce by pak byl zodpovědný za nekontrolovaný růst nádorových buněk u pacientů s klinicky rozvinutým onemocněním a stálou dynamickou rovnováhou mezi preneoplastickými buňkami a imunitním systémem u preneoplazie.

Údaje o imunitní reakci u lidské preneoplazie byly získány u pacientů s monoklonální gamapatií nejasného významu (monoclonal gammopathy of unknown significance, MGUS).(5) Pacienti s MGUS mají v kostní dřeni klonální expanzi plazmatických buněk, které jsou podle všech parametrů (cytogenetika, fenotyp, expresní profilování genovými čipy) téměř totožné s nádorovými buňkami u mnohočetného myelomu (MM). Zatímco MM je ovšem onemocnění s velmi špatnou prognózou a bez léčby zcela infaustní, pacienti s MGUS zpravidla zůstávají klinicky stabilní po mnoho let, bez rozvoje MM. Studium MGUS a MM je technicky jednodušší než studium solidních nádorů, protože nádorové buňky i buňky imunitního systému mohou být poměrně jednoduše izolovány z kostní dřeně. Bylo zjištěno, že pacienti s MGUS mají v kostní dřeni i v periferní krvi lymfocyty, které jsou schopny rozpoznávat autologní nádorové buňky a reagovat produkcí IFN?.

U MM se takové buňky nenacházejí a nádorově specifické lymfocyty se dají detekovat až po minimálně dvou týdnech in vitro stimulace. Tyto skutečnosti ukazují, že lidský imunitní systém je schopen rozpoznávat a odpovídat na preneoplastické stadium. Prvním z antigenů, který je navíc specificky rozpoznáván pouze u MGUS, je transkripční regulátor SOX2. Jde o jeden ze čtyř transkripčních faktorů, které jsou pro funkci kmenových buněk zcela klíčové a je často exprimován v nádorových kmenových buňkách.(6) Tato populace buněk je v nádorové tkáni jako jediná schopna sebeobnovy a dává vznik všem dalším, více diferencovaným nádorovým buňkám. Zdá se tedy, že u MGUS je populace nádorových buněk „držena“ pod kontrolou díky imunitní reakci, která specificky potlačuje progenitorovou populaci kmenových nádorových buněk. V dalších studiích je třeba zhodnotit, zda podobná odpověď existuje i u dalších preneoplastických stavů a identifikovat další antigenní cíle takové imunitní reakce.

Mechanismy úniku nádorových buněk před imunitním systémem

Nádorové buňky vyvinuly řadu strategií, pomocí nichž jsou schopné uniknout kontrole imunitního systému. Existuje zde řada analogií s únikovými mechanismy infekčních činitelů. Nádorové buňky často produkují transformující růstový faktor ß (TGF- ß) a interleukin 10, které inhibují imunitní reakci. Podobný mechanismus úniku mají buňky infikované např. herpetickými viry. Dalším únikovým mechanismem jsou časté mutace, a to jak v nádorově specifických antigenech, tak např. v genech, které kódují bílkoviny důležité pro prezentaci antigenů v buňkách prezentujících antigen. Jde např. o mutace v genech pro ß2-mikroglobulin nebo v genech kódujících podjednotky proteazomu.
Tyto mutace vedou ke vzniku rezistence k CD8 T-lymfocytům. Tento fakt je obObr. překonat navzdory skutečnosti, že snížená exprese MHC I. vede k vyšší vnímavosti nádorových buněk k NK buňkám.

Předpokládá se, že komplexní stimulace imunitní reakce, zahrnující aktivaci CD4 T-buněk a protilátek produkovaných B-buňkami může vyrovnat tento nedostatek, jak bylo dokázáno ve studiích na myším modelu. Další mechanismy úniku nádorových buněk před imunitním systémem zahrnují vznik imunologické ignorance při nízké hustotě exprese nádorových antigenů, ev. maskování některých epitopů nádorových antigenů např. sialyzací. Některé nádorové buňky exprimují na svém povrchu apoptotický receptor známý jako FasL. Pomocí této molekuly pak mohou indukovat v protinádorových T-lymfocytech apoptózu. Interakce Fas-FasL má však pravděpodobně komplexní důsledky a za určitých okolností může vést jak k potenciaci nádorového růstu, tak k jeho inhibici.

Významným faktorem je působení regulačních (tlumivých) T-lymfocytů, které chrání nádory podobně jako normální tkáně před (auto)imunitními mechanismy. Ukazuje se, že odstraněním těchto buněk se výrazně zvyšuje účinnost protinádorových imunitních mechanismů. Faktory produkované některými nádory přímo inhibují funkce nebo životnost dendritických buněk. Patří mezi ně oxid dusnatý, který indukuje apoptózu DC, dále IL-10 a TGF-ß inhibující zrání DC, nebo vaskulární endoteliální růstový faktor (VEGF), který působí inhibičně na prekurzory DC v kostní dřeni. Porucha funkce DC, a tím porušená antigenní prezentace se všemi důsledky je jedním z nejdůležitějších charakteristik nádorových onemocnění.

Indikace imunoterapie nádorových onemocnění

Existuje mnoho skupin pacientů, u nichž je možné uvažovat o klinické aplikaci protinádorové imunoterapie. Primární prevence vyžaduje identifikaci osob s vysokým rizikem rozvoje nádorového onemocnění. To je dnes nejčastěji možné u pacientů s dědičnými syndromy, které zvyšují zásadním způsobem riziko rozvoje nádorů. Jde např. o pacienty s Li-Fraumeni syndromem, mutacemi v BRCA apod., u kterých mohou být detekovány specifické mutace a také zvýšené riziko nádorových onemocnění.(7) Další skupinu kandidátů na imunoprevenci nádorů představují pacienti s již detekovaným preneoplastickým onemocněním.(8, 9) U těchto pacientů je důležitá prevence progrese do stadia maligního tumoru. Jde například o pacienty s kolorektálními polypy, orální leukoplakií, cervikální intraepiteliální neoplazií či MGUS.

Nejpočetnější skupinu pacientů, u kterých bude zvažována protinádorová terapie, budou však vždy tvořit pacienti s již diagnostikovaným nádorem. V dosud proběhlých studiích byla imunoterapie testována jako poslední přístup u pacientů, kteří byli ve velmi pokročilém stadiu diseminovaného onemocnění a kteří podstoupili chemoterapii. Není překvapující, že za takových podmínek má imunoterapie omezený efekt. Naopak je překvapující a povzbudivé, že většinou došlo k indukci detekovatelné imunitní odpovědi. Rozdíl v charakteru imunitní reakce při imunoterapii časných a pozdních stadií onemocnění je znázorněn na Obr. 2.

Obr.2 Vliv stadia aktivace dendritických buněk na výsledek imunitní odpovědi

V případě protinádorové vakcinace ve stadiu preneoplazie následuje v další fázi tvorba paměťových buněk. Jestliže poté začne nádor růst, může vyvolat aktivaci sekundární imunitní reakce s rychlou expanzí velkého množství efektorových buněk a tvorbou vysokých titrů protilátek.
Má-li být úspěšná imunoterapie nádorového onemocnění v pokročilém stadiu, musí dojít k rychlé indukci velkého množství efektorových buněk, což je velmi nesnadný úkol. Efektorové buňky musí poté migrovat do nádorové tkáně, což je znesnadněno přítomností imunosupresivních látek, které produkuje nádorová tkáň a také nádorové stroma. V pokročilém stadiu onemocnění je navíc populace nádorových buněk heterogenní a některé buňky již nemusí exprimovat nádorové antigeny.

Tyto buňky nemohou být rozpoznány antigen specifickými T-lymfocyty a protinádorovými protilátkami a jsou rezistentní k destrukci mechanismy imunitního systému (Obr. 2). Populace rezistentních nádorových buněk roste nezávisle na přítomnosti imunitní reakce a dává vzniknout nádoru, který je zcela rezistentní k protinádorové imunoterapii. Nové poznatky o účinku chemoterapeutik však vedly ke konceptu kombinované chemo-imunoterapie. Některá chemoterapeutika totiž indukují tzv. imunogenní smrt buňky. Předpokládá se, že vhodné načasování chemoterapie a imunoterapie může zvrátit fázi úniku nádorových buněk do fáze ekvilibria podle výše zmíněné Dunnovy hypotézy a zajistit úspěch imunoterapie i u pacientů s pokročilejšími stadii onemocnění.(10)

Možnosti protinádorové imunoterapie

Existuje celá řada postupů, jak stimulovat imunitní systém v boji proti nádorům. Obecně se tyto postupy dají rozdělit na nespecifické a antigenně specifické. Do první skupiny patří použití např. cytokinů (IL-2 v léčbě renálního karcinomu, interferon alfa u některých hematologických malignit), nespecifická stimulace zánětu (použití BCG vakcíny lokálně u karcinomu močového měchýře), aplikace různých imunostimulačních látek, nejčastěji mikrobiálního původu (bakteriální lyzáty, glukany apod.). Vzhledem k složitosti mechanismů protinádorové imunity je však při použití těchto postupů nebezpečí aktivace např. tlumivých složek imunity, a tím naopak podpora růstu nádorů.

Antigenně specifické mechanismy, které jsou již v klinické praxi aplikovány, jsou využívány např. v podobě monoklonálních protilátek cílených proti některým nádorovým antigenům např. herceptin, monoklonální protilátka proti antigenu Her2-Neu exprimovaném na některých epiteliálních nádorech, např. karcinomu prsu). Tyto postupy eliminují populace buněk, nesoucí příslušný antigen. Další postupy zahrnují např. expanzi ex vivo tumorově specifických lymfocytů, obvykle získaných přímo z nádoru jako tzv. TIL (tumor infiltrující lymfocyty). Imunizace samotnou nádorovou buňkou nebo nádorovým antigenem je obvykle neúčinná a vyžaduje účinné adjuvans. Nejsou však využitelná běžná adjuvans používaná v antiinfekčních vakcínách, neboť ta indukují zejména protilátkovou odpověď proti příslušnému antigenu. Vzhledem k nutnosti stimulace především buněčných složek imunity se pozornost v posledních letech zaměřila na využití dendritických buněk v imunoterapii nádorů. Velmi zjednodušeně řečeno, DC fungují jako určité „adjuvans“, které zajistí rozpoznání nádorové buňky, její zpracování a prezentaci T-lymfocytům (princip imunoterapie DC viz dále).

Dendritické buňky jako centrální spojka mezi nespecifickou a specifickou imunitou

Pro ústřední úlohu dendritických buněk v účinné protinádorové imunitní reakci se nejvíce imunoterapeutických postupů zaměřuje právě na tyto buňky a na obnovení jejich adekvátní schopnosti prezentovat nádorové antigeny. Dendritické buňky jsou jedinné APC, které dokáží aktivovat naivní (panenské) T-lymfocyty. V posledních letech byla objasněna řada mechanismů, jež buňkám umožní rozeznat přítomnost mikroba nebo jiného nebezpečí včetně nádorových buněk v periferních tkáních a zajistí, že je zmíněná informace přenesena do lymfatických uzlin, kde jsou poté stimulovány specifické T-lymfocyty.(11) Dendritické buňky byly pojmenovány podle charakteristické morfologie s množstvím výběžků, dendritů (Obr. 3).(12) V periferní krvi cirkulují dendritické buňky ve velmi malém množství, proto se obtížně studují. Zásadní zlom ve studiu dendritických buněk nastal v polovině 90. let, kdy byly publikovány protokoly popisující kultivaci dendritických buněk z monocytů nebo kmenových hematopoetických buněk zdravých dárců za přítomnosti různých cytokinů, především GM-CSF (Granulocyte-Monocyte-Colony Stimulating Factor) a IL-4. Stadia a subpopulace dendritických buněk

Obr. 3 Morfologie dendritických buněk. Dendritická buňka označená protilátkou proti HLA II. třídy (zeleně), která pohltila apoptotické nádorové buňky (červeně). (Fotografie z konfokálního mikroskopu Olympus, z publikace pracovníků Ústavu imunologie UK 2. LF a FNM v Clinical Immunology, 2007)

Dendritické buňky se diferencují z kmenových hematopoetických buněk v kostní dřeni, odkud jsou již jako nedělící se buňky vyplavovány do krevního oběhu. Z krevního oběhu vstupují do tkání, kde se vyskytují především v takzvaném nezralém stavu. Nezralé dendritické buňky exprimují na svém povrchu velké množství molekul umožňujících pohlcování nejrůznějších antigenních částic (viry, baktérie, infikované, nádorové či odumřelé buňky). V tomto nezralém stavu mají na svém povrchu pouze malé množství MHC a kostimulačních molekul, které nedostačuje k zahájení imunitní odpovědi (Obr. 4). Navíc antigen specifické lymfocyty jsou lokalizovány v sekundárních lymfatických orgánech a pro jejich aktivaci je tedy nutné, aby se dendritické buňky prezentující antigen přesunuly z periferie např. do lymfatických uzlin.(13)

Obr. 4 Nezralé dendritické buňky exprimují na svém povrchu velké množství molekul umožňujících pohlcování nejrůznějších antigenních částic. V tomto nezralém stavu mají na svém povrchu pouze malé množství MHC a kostimulačních molekul, které nedostačuje k zahájení imunitní odpovědi.

Proces, během kterého se z nezralé dendritické buňky stane profesionální APC, je nazýván maturace (zrání) dendritické buňky. Tento proces je zahájen poté, co dendritická buňka pomocí specifických receptorů rozpozná hrozící nebezpečí, nejčastěji průnik infekčního agens do organismu. Proces maturace je charakterizován vymizením schopnosti fagocytovat antigeny. Dochází k výraznému zvýšení exprese HLA molekul I. a II. třídy, CD83 a kostimulačních molekul CD80, CD86. Na povrchu dendritických buněk se objevuje molekula CCR7, která je receptorem pro chemokin MIP-3ß, který se vyskytuje v lymfatických uzlinách. Zrající aktivovaná dendritická buňka migruje do lymfatických uzlin, kde účinně předkládá antigeny na svém povrchu T-lymfocytům, aktivuje je a zahajuje imunitní reakci, která v optimálním případě vede k eliminaci patogenu nebo nádorové buňky.

Mezi dendritickými buňkami lze rozlišit řadu subpopulací. Plazmacytoidní dendritické buňky byly pojmenovány podle morfologie připomínající plazmatické buňky. Lze je identifikovat podle exprese CD123 (receptoru pro IL-3) a jejich hlavní funkcí je obrana proti virovým infekcím. IL-3 je důležitým růstovým faktorem plazmacytoidních dendritických buněk.(14) Myeloidní dendritické buňky jsou druhou subpopulací a patří mezi ně také Langerhansovy buňky v epidermis. Jejich charakteristickým znakem je exprese CD11c. Langerhansovy buňky se vyznačují expresí langerinu (CD207) a molekuly DEC-205 CD205). Nejpočetnější populací myeloidních dendritických buněk jsou intersticiální dendritické buňky, které lze nalézt ve všech tkáních. Tyto buňky jsou nejvíce podobné dendritickým buňkám připraveným in vitro diferenciací z monocytů v přítomnosti GM-CSF a IL-4 – proto je o nich nejvíce informací. Jednotlivé subpopulace dendritických buněk mají různou výbavu pro rozpoznání patogenů a každá je tedy specializována v obraně proti různým infekcím.

Receptory dendritických buněk

Pro řadu mikrobů exprimují dendritické buňky na svém povrchu receptory umožňující specifickou endocytózu. Do této skupiny receptorů patří především zástupci skupiny C-lektinů, které rozpoznávají sacharidové molekuly. Nejvíce studovanými C-lektiny jsou DEC-205 (CD205), manózový receptor (CD206), DC-SIGN (CD209) a langerin (CD207). DC-SIGN je například receptorem pro HIV, virus dengue, cytomegalovirus, mykobaktérie a kandidy.(15) Dendritické buňky mohou také fagocytovat umírající a mrtvé buňky ve svém okolí, ať už jde o buňky nádorově transformované, infikované viry nebo buňky podléhající apoptóze během homeostatické obnovy tkání. Receptory specifické pro proces pohlcování apoptotických a nekrotických buněk patří do skupiny tzv. scavengerových receptorů, některé jsou však neznámé. Velmi důležité v rozpoznávání nebezpečných vzorů jsou tzv. Toll-like receptory.

Toll-like receptory jsou membránové glykoproteiny typu I. Cytoplazmatická část je podobná cytoplazmatické části receptoru pro IL-1 a je označována jako TIR (Toll/IL-1R). Extracelulární část obsahuje tandemové kopie repeticí bohatých na aminokyselinu leucin (tzv. leucin rich repeats, LRR). Tyto sekvence vytváří specifické struktury podkovovitého tvaru, o kterých se předpokládá, že se přímo podílí na rozpoznávání a vazbě ligandů. V současné době je identifikováno u lidí 10 druhů TLR, každý rozpoznává jinou sdílenou mikrobiální strukturu, což dovoluje dendritickým buňkám rozpoznat v podstatě jakoukoli infekci. Zajímavé také je, že exprese jednotlivých TLR vysvětluje specializaci podtypů dendritických buněk v obraně proti různým skupinám patogenů. Plazmacytoidní dendritické buňky například exprimují TLR-7 a TLR-9, které jsou aktivované po stimulaci virovými nukleovými kyselinami. Toto zjištění koreluje s experimentálním zjištěním, že plazmacytoidní dendritické buňky hrají roli v aktivaci protivirové imunitní odpovědi. Myeloidní dendritické buňky exprimují zbylé TLR a zahajují imunitní odpověď proti virům, baktériím, plísním i parazitům. Většina patogenů je navíc rozpoznávána více TLR, čímž je zajištěna lepší obrana proti infekci.

Buněčná lokalizace TLR také koreluje s charakterem jejich agonistů. TLR1, TLR2 a TLR4 jsou lokalizovány na buněčném povrchu a po aktivaci svými agonisty (většinou složkami povrchových struktur patogenů) se dostávají do fagosomů. Na druhé straně TLR3, TLR7, TLR9, které všechny rozpoznávají virové nukleové kyseliny, jsou lokalizovány v membránách intracelulárních kompartmentů, které fúzují s fagosomy. Tato lokalizace pravděpodobně omezuje aktivaci buněčnými nukleovými kyselinami a naopak usnadňuje přístup k ligandům patogenního původu. Aktivace receptorů DC vede ke komplexní reakci DC zprostředkované nejrůznějšími signalizačními drahami. Výsledkem je potom aktivace DC a zahájení imunitní reakce. Podle povahy dalších signálů může být výsledkem jak indukce imunitní reakce, tak vznik tolerance.

Signály zprostředkované cytokiny

Kromě receptorů mohou dendritické buňky rozpoznávat přítomnost „nebezpečí“ i nepřímo – detekcí prozánětlivých cytokinů (např. TNF, IL-1ß, IFN? a IFNß) produkovaných různými buňkami, makrofágy, NK-buňkami, NKT-buňkami, žírnými a endoteliálními buňkami, které se v přítomnosti nebezpečí aktivovaly. Tímto způsobem je dále zvyšována aktivace dendritických buněk a mohou tak být aktivovány i buňky, které přímo nerozpoznaly patogen přes jejich PRR.

Endogenní signály

Důležitým a intenzívně řešeným problémem je otázka, zda dendritické buňky mohou být aktivovány i endogenními signály. To je velmi důležité například v případě indukce imunitní reakce proti nádorově transformovaným buňkám. Do endogenních signálů patří několik skupin molekul, uvolňujících se při tkáňovém poškození, případně při nefyziologické smrti buňky, např. nekrózou. Jde např. o kyselinu močovou, hyaluran, ATP, kalretikulin, proteiny teplotního šoku nebo malé molekuly zvané HMGB.

Využití dendritických buněk v imunoterapii nádorových onemocnění

Poznání klíčové role dendritických buněk v procesu zahájení imunitní reakce a možnost jejich přípravy ve velkém množství in vitro vedly k úvahám o jejich využití v imunoterapii nádorových onemocnění.
Obecné schéma imunoterapie dendritickými buňkami je znázorněno na Obr. 5. Monocyty periferní krve pacientů vybraných pro imunoterapii se získávají v průběhu leukaferézy. Z monocytů se pak připraví velké množství nezralých dendritických buněk v přítomnosti cytokinů GM-CSF a IL-4. Po pěti dnech dojde k diferenciaci monocytů v nezralé dendritické buňky. Další postup závisí na typu nádorového antigenu, který je pro imunoterapii zvažován. Při použití mrtvých nádorových buněk jako zdroje celého spektra nádorových antigenů je prvním krokem inkubace dendritických buněk s nádorovými buňkami.(16, 17) Po pohlcení nádorových buněk jsou následně dendritické buňky aktivovány a zralé dendritické buňky, které nádorové antigeny, jsou poté jako protinádorová vakcína podány zpět pacientovi.

Obr. 5 Obecné schéma protinádorové imunoterapie pomocí vakcíny z dendritických buněk

Při použití přesně definovaných epitopů nádorových antigenů ve formě krátkých peptidů jsou dendritické buňky nejprve maturovány a teprve zralé dendritické buňky, které exprimují velké množství HLA molekul, jsou inkubovány s nádorovým antigenem. Další testované formy nádorových antigenů jsou transfekce dendritických buněk RNA izolovanou z nádorových buněk nebo plazmidy kódujícími nádorový antigen. Jako zdroj nádorových antigenů se dají také použít celé usmrcené nádorové buňky. Ty poskytují široké spektrum nádorových antigenů, ale potenciálně i autoantigenů.
Rychle po objasnění role dendritických buněk v indukci imunitní reakce a publikaci protokolů pro jejich přípravu z monocytů bylo provedeno několik klinických studií u řady nádorových onemocnění (např. maligní melanom, renální karcinom, non-Hodgkinský lymfom a další). U řady těchto studií došlo k laboratorně detekovatelné indukci protinádorové imunitní odpovědi, ale i přes několik popsaných regresí nádorových lezí nebyl klinický efekt většinou dlouhodobý.

Jak bylo uvedeno v předchozím textu, zásadním problémem provedených studií je, že do nich byli výlučně zahrnuti pacienti ve velmi pokročilých fázích onemocnění, u kterých byly již vyčerpány všechny ostatní terapeutické modality. Imunitní systém byl tedy výrazně poškozen jak proběhlou chemoterapií, tak imunosupresivními mechanismy nádorové tkáně. Je také nutné zdůraznit, že v těchto studiích byly použity nezralé či pouze nedokonale aktivované dendritické buňky. Je opět nutno zdůraznit, že v souladu s teoretickými předpoklady i experimentálními daty má protinádorová imunoterapie větší šanci na úspěch v případě, že bude aplikována pacientům v časných fázích onemocnění, případně pacientům po radikálním chirurgickém výkonu ve fázi minimální reziduální nemoci.

Nově plánované klinické studie, včetně studií, které již byly zahájeny ve Fakultní nemocnici v Motole, také počítají s použitím dendritických buněk, které budou aktivovány ligandy TLR. Předmětem intenzívního výzkumu je ovšem řada dalších parametrů. Jde především o množství podávaných dendritických buněk v jedné aplikaci, o frekvenci a celkovou dobu podávání protinádorové vakcíny. Roli v efektivitě podáváné vakcíny zřejmě hraje také způsob podání vakcíny. Jako nejlepší se zatím jeví subkutánní nebo intradermální injekce. Při tomto způsobu je dokázáno, že buňky migrují do spádových lymfatických uzlin, místa imunitní reakce (Obr. 6). Neméně důležitým problémem je také typ testů, které budou používány pro monitoraci efektu terapie.

Obr. 6 Průkaz migrace DC do spádových lymfatických uzlin. Subkutánně podaná vakcína z dendritických buněk (DC) pacientovi s nádorovým onemocněním. DC byly označeny 111 Indiem a snímky byly pořízeny v různých časových intervalech pomocí SPECT-CT. Je patrné, že z místa aplikace se radioaktivita přesunula po 24 h do spádových lymfatických uzlin. Snímky pořízeny ve spolupráci s MUDr. Táborskou z Kliniky nukleární medicíny FN v Motole.

Kromě principiálních problémů kolem vakcinace dendritickými buňkami je zapotřebí brát v úvahu platnou legislativu. Imunoterapie dendritickými buňkami patří do metod moderní buněčné terapie a tento postup spadá podle evropské legislativy pod zákon o léčivech. Znamená to, že veškerá manipulace s buňkami při přípravě vakcíny se musí odehrávat v superčistých prostorách (Obr. 7) za podmínek správné výrobní praxe (GMP) s povolením národních regulačních autorit (v České republice je to Státní ústav pro kontrolu léčiv). Nelze opominout ani finanční hledisko výroby protinádorových vakcín. Ústav imunologie UK, 2. LF a FN Motol získal Certifikát pro výrobu podle GMP od SÚKL, čímž splnil legislativní předpoklady pro výrobu individuální vakcíny. Výsledky probíhajících klinických studií u pacientů s nádory prostaty a pacientek s nádory vaječníků mohou za čas přinést odpověď na otázku, zda si imunoterapie nádorů pomocí dendritických buněk najde v komplexní léčbě nádorových onemocnění své místo.

Obr. 7 Výroba protinádorové vakcíny probíhá v superčistých prostorách. Fotografie pracovníků Ústavu imunologie 2. LF UK při výrobě vakcíny z dendritických buněk.

Grantová podpora: Výzkumný záměr Ministerstva školství MSM 0021620812 a grantu IGA MZ NT-11559.

Seznam zkratek

APC – antigen prezentující buňka
BCR – B-buněčný receptor
CTL – cytotoxický T-lymfocyt
GM-CSF – granulocyty monocyty kolonie stimulující faktor
IL – interleukin
IFN – interferon
MGUS – monoklonální gamapatie nejasného významu (monoclonal gammopathy of unknown significance)
MHC – hlavní histokompatibilní komplex (major histocompatibility complex).
PAMPs – molekulární struktury asociované s patogeny
PRR – receptor rozpoznávající molekulární struktury asociované s patogeny
RAG– gen aktivující rekombinaci
RNA – ribonukleová kyselina
TAP – transportér sdružený s antigenní prezentací
TCR – T-buněčný receptor
Th – pomocný T-lymfocyt
TLR – Toll-like receptor


O autorovi: Prof. MUDr. Jiřina Bartůňková, DrSc.
Univerzita Karlova v Praze, 2. lékařská fakulta a Fakultní nemocnice v Motole, Ústav imunologie

e-mail: jirina.bartunkova@lfmotol.cuni.cz

1)
roky) x AST (U/l
2)
PLT (109/l
Protinádorová imunita
Ohodnoťte tento článek!