Souhrn
V roce 2010 byla monitorována embrya 17 pacientek a transferováno celkem 34 selektovaných embryí. Sedm pacientek otěhotnělo (3krát gemini), 1 pacientka měla mimoděložní těhotenství. Narodilo se 9 zdravých dětí, žádná pacientka nepotratila. V roce 2011 (do června) bylo monitorováno 16 pacientek, transferováno celkem 32 vybraných embryí. Z toho 7 pacientek otěhotnělo (2krát gemini), žádná nepotratila, těhotenství trvají dosud. Podle prvních úspěšně nidovaných embryí byla vytvořena referenční křivka s optimálními délkami dělení a interfází v buněčných cyklech. Křivka se neustále zpřesňuje podle aktuálních výsledků. Obrazová analýza dělení buněk velmi časných embryí umožňuje přesný a objektivní výběr embryí s nejvyšším potenciálem nidace. Embrya vybraná touto metodou vykazují nízké riziko aneuploidií nebo jiných genetických aberací obvykle vedoucích k časným těhotenským ztrátám. Při kamerovém monitoringu kultivace se navíc minimalizuje kontakt embryologa s biologickým materiálem a manipulace s embryi mimo inkubátor.
Summary
Rutarova, J., Koubkova, B., Rezacova, J., Hlinka, D., Lazarovska, S., Pichlerová, M. Selection of human embryos according to the length of cell cycles and regularity of cell division
The selection of embryos for embryonic transfer, on the basis of non-invasive monitoring of embryonic development, according to the length of cell cycles and the regularity of division. Noninvasive monitoring of embryo development in culture is made possible by the Primovision camera system, placed directly in the incubator. Images were transmitted and analysed by a computer program supplied by the system's manufacturer. During the year 2010, embryos belonging to 17 patients were monitored and a total of 34 selected embryos was transferred. Seven patients became pregnant (3 times with twins), one patient had an ectopic pregnancy. Nine healthy children were born, none of the patients suffered a miscarriage.
During the year 2011 (until June) 15 patients were monitored and 30 selected embryos were transferred. Seven patients became pregnant (twice with twins), there were no miscarriages and the pregnancies are still ongoing. Using the data obtained by monitoring the first batch of nidated embryos, a reference curve was drawn up, with optimal length of cell cycles and interphases in cell division cycles. This curve is being constantly updated using new results. Image analysis of cell division in very young embryos allows for a very accurate and objective method of selecting the embryos with the highest potential for successful nidation. The embryos selected by this method have a low risk of aneuploidy or other genetic aberrations usually leading to an early loss of the pregnancy. In addition, monitoring of cultivation using a camera minimizes the direct contact of the embryologist with biological material and the necessity to handle embryos outside of the incubator.
Lidské embryo vzniká, stejně jako u dalších savců, splynutím pohlavních buněk ve vejcovodu ženy. Spermie vznikají a dozrávají v semenných kanálcích varlat od puberty až do pozdního věku muže. Vajíčka (oocyty) jsou vytvořena již v prenatálním věku ženy, jejich nezralé formy přečkávají ve vaječnících do puberty a další vývoj probíhá až při ovulaci a během fertilizace. První stadium embrya, tzv. zygota, vzniká po vniknutí spermie do cytoplazmy oocytu, následně dochází k rýhování (dělení dceřiných buněk). Rýhující se embryo je posouváno pomocí pohybu řasinkového epitelu a peristaltiky vejcovodu do děložní dutiny, kde niduje a prorůstá do endometria dělohy. Při samovolném oplození v těle se embryo dostává do dělohy přibližně pátý den po oplození.
Metody asistované reprodukce zahrnují celou řadu moderních technologických postupů, při kterých se v rámci neplodnosti manipuluje s lidskými pohlavními buňkami. Používají se na specializovaných pracovištích, tzv. centrech asistované reprodukce při neúspěchu konzervativní a chirurgické léčby. Tyto techniky zahrnují chirurgický odběr oocytů ze stimulovaných vaječníků, zpracování a přípravu získaných oocytů a spermií, fertilizaci oocytů, kultivaci embryí a následný přenos do dělohy ženy.
Vývoj embrya po oplození
Při dostatečné kvalitě a počtu spermií se zralá vajíčka oplodní klasicky přidáním spermií k oocytům. Pokud se nachází v ejakulátu výrazně až extrémně snížený počet spermií nebo jsou spermie nekvalitní, užívá se metoda ICSI (intracytoplazmatická injekce spermie). Principem této metody je zavedení jedné spermie pomocí mikromanipulátoru přímo do cytoplazmy oocytu (Obr. 1). Spermii vybírá embryolog podle kritérií WHO. Aby proběhlo oplození úspěšně, musí být oocyt při fertilizaci zralý v tzv. stadiu metafáze II (MII). Znamená to, že u něj došlo k zahájení druhého redukčního dělení a oocyt obsahuje jen jednu sadu chromosomů, tedy je haploidní. Morfologicky se vyznačuje homogenní cytoplazmou a vyděleným prvním pólovým tělískem. Teprve při oplození dojde k dokončení druhého meiotického dělení.(1) Tyto procesy hrají klíčovou roli v prvních fázích vývoje embrya a ovlivňují délky buněčných cyklů.
Hodnocení vývoje embryí spočívá prvotně v kontrole úspěšnosti fertilizace oocytů a následně v každodenním posuzování růstu embryí v kultivaci. Přibližně 16–20 hodin po přidání spermií k vajíčkům nebo po zavedení spermie do oocytu metodou ICSI je kontrolována fertilizace oocytů. Oplozený oocyt obsahuje 2 sady chromosomů (jedna od matky a jedna od otce), je tedy diploidní. Morfologicky jsou v cytoplazmě viditelná dvě prvojádra s několika jadérky a vydělené druhé pólové tělísko. Toto stadium oocytu nazýváme zygota (Obr. 2). Jiný počet prvojader nebo pólových tělísek může signalizovat špatný průběh meiózy při zrání oocytu nebo chybu ve fertilizaci. Takové oocyty jsou z další kultivace vyřazeny. U zygot je kontrolována také symetrie prvojader, přítomnost, rozložení a počet jadérek (neměl by být menší než 3) a pozice pólových tělísek.(2)
Po 20–26 hodinách kultivace od oplození dochází ke splynutí rodičovských prvojader a k prvnímu rýhovacímu dělení. Zygota se tím rozdělí na dvě dceřiné buňky – blastomery a zahájí tak kaskádu mitóz vedoucích k vytvoření celého embrya. Toto první dělení se early clevage a je jedním ze znaků progresivně rostoucího embrya. Druhý den po oplození, za cca 40–50 hodin, jsou embrya čtyřbuněčná a třetí den (asi po 72 hodinách) mají 6–8 buněk (Obr. 3). Jednotlivé blastomery jsou od sebe zřetelně odděleny hlubokými rýhami, takže vyniká jejich kulovitý tvar.(3) Když embrya dorostou do 10–12 buněk, začíná proces kompaktace. Mezi jednotlivými buňkami nelze rozeznat membrány, jednotlivé blastomery jsou spojeny přilnavostí adhezívních molekul CAMs (Cell Adhesive Molecules).(3) Morula vzniká 96 hodin po fertilizaci – zcela kompaktovaný útvar bez zřetelných rýh mezi buňkami (Obr. 3).
Čtvrtý až pátý den (96–120 hodin) den začíná morula kavitovat, uvnitř embrya se vytváří dutina zvaná blastocel a vzniká časná blastocysta (Obr. 3). Blastocysta obsahuje 120 a více buněk a stále zvětšuje svůj objem, tzv. expanduje.(4) Buňky vnitřní buněčné masy se seskupí k jednomu pólu vzniklého váčku jako embryoblast, vnější vrstva buněk tvoří trofoblast. Obal embrya zona pellucida se ztenčuje, až v jednom místě praskne a embryo se uvolní mimo zónu, tzv. hatching. Hatchovaná blastocysta se přichytává na endometrium dělohy a niduje do něj. Embryotransfer (zavedení embryí do dělohy pomocí katétru) se provádí druhý až pátý den po oplodnění, nejpozději právě ve stadiu hatchující blastocysty. „Vyhatchovanou“ blastocystu již nelze dále kultivovat in vitro.
Kultivace embryí
Vlastní kultivace reprodukčních buněk a embryí probíhá v živných médiích v inkubátoru s teplotou 37 °C v atmosféře s 6 % CO2. Kultivační média jsou vyráběna komerčně se specifickým složením pro jednotlivé typy reprodukčních buněk a pro různá stadia embryí. Základem těchto živných roztoků je hydrogenkarbonátový pufr, protože metabolismus savčího vajíčka i spermie je závislý na hydrogenkarbonátovém iontu. Pro krátkodobé udržení optimálního pH se používá pufr, založený na HEPES.(5) Dalšími složkami kultivačního média jsou čištěná voda a anorganické ionty, především Na+, K+,Ca2+ a Mg2+. Vzhledem k tomu, že embrya nejsou schopna do třetího dne kultivace metabolizovat glukózu, jsou v kultivačním médiu obsaženy i jiné energetické zdroje (pyruvát, laktát, glukóza), dále pak také L-aminokyseliny, nukleotidy, fosfátový aniont, makromolekulární složky – albumin, růstové faktory, vitamíny, koenzymy, antibiotika a pomocné látky. Veškerá manipulace s lidskými reprodukčními buňkami a embryi probíhá za přísných sterilních podmínek v laminárních boxech s vyhřívanými plochami. Kontrola embryí pod mikroskopem, odběr oocytů, třídění embryí a další metodiky, které probíhají mimo inkubátor, musí být provedeny v co nejkratším čase, aby nedocházelo ke ztrátám teploty a změně pH. Při delších manipulacích s buňkami (např. při ICSI) je kultivační médium překryto vrstvou minerálního oleje, který pomáhá déle udržet teplotu a pH médií mimo inkubátor.
Selekce embryí na embryotransfer
Jedním z nejdůležitějších kritérií úspěšnosti asistované reprodukce je kvalita embryí zaváděných do děložní dutiny. Výběr embryí se v současnosti provádí na základě subjektivního posouzení určitých znaků charakteristických pro jednotlivá stadia vývoje.(6, 7) V praxi to znamená, že embryolog musí minimálně jednou denně vyjmout kultivační misky s embryi z inkubátoru a zhodnotit jejich kvalitu pod mikroskopem. Tento způsob tedy plně závisí na zkušenostech embryologa. Kontinuální monitorování embryí je založeno na snímání jejich vývoje pomocí kamery, která je uložena přímo v inkubátoru. Obrazový materiál je přenášen do počítače, kde je zobrazován a následně analyzován. Z obrazového materiálu lze určit časové intervaly dělení buněk, pravidelnosti dělení a jejich abnormality.
Vývoj velmi časného embrya je zcela specifický, ovlivněný dozráváním oocytu před fertilizací a během ní. V průběhu 1. mitózy se formují prvojádra od matky a otce a dochází k jejich syngamii (splynutí gamet za vzniku zygoty).
U časného embrya do stadia 8 buněk neprobíhá vlastní transkripce (přepis genetické informace) a embryo využívá zdroje pouze z cytoplazmy oocytu. K zahájení transkripce dochází až po 3. mitóze, kdy se aktivuje embryonální genom. Tomu odpovídají i délky interfází mezi mitózami. Nejdelší interfáze (až 24 h) je po 4. mitóze, kdy probíhá transkripce genů a syntéza embryonálních proteinů. Pro výběr nejvhodnějšího embrya na embryotransfer je klíčovým kritériem dodržení intervalů mezi děleními (délky interfází) a synchronizace mitóz (pravidelnost dělení buněk).(8) Anomálie v časném vývoji embryí mohou souviset s výskytem chromosomálních aberací jako např. aneuploidií, které jsou pravděpodobně nejčastější příčinou časných těhotenských ztrát. Monitorování vývoje embryí umožňuje měření délek těchto intervalů, a tím i objektivní hodnocení kvality embryí. Na základě výsledků vyhodnocení počítačové analýzy lze vybrat embrya, která mají nejvyšší potenciál k úspěšnému uhnízdění v děložní sliznici po embryotransferu.
Soubor a metodika
Pilotní studie probíhala od března 2010 do června 2011. Do studie bylo náhodně vybráno 33 pacientek (průměrný věk 33,3 roku) zařazených do programu asistované reprodukce v centru IVF-ÚPMD. Neinvazívní monitoring vývoje embryí při kultivaci je prováděn kamerovým systémem Primovision vloženým přímo do inkubátoru. Každých 20 minut je kamerou snímána kultivační miska s embryi. Obrazový materiál je přenášen a vyhodnocován pomocí počítačového programu CryoAnalysis dodávaného výrobcem kamery. Embrya jsou umístěna v kultivačních miskách s devíti jamkami (každé embryo je v samostatné jamce).
Podmínky kultivace:
• kultivační medium QA Cleavage Medium
• minerální olej pro překrytí kultivační misky Oil for Tissue Culture
• inkubátor Heracell
• 37 °C, 6 % CO2
Všechny oocyty byly oplodňovány metodou ICSI (intracytoplazmatická injekce spermií). Kultivace embryí probíhala 3–5 dnů. Embryotransfer byl prováděn sterilním silikonovým katétrem Wallace pod ultrazvukovou kontrolou. Standardně byla zaváděna dvě embrya.
Výsledky
Z celkového počtu 33 pacientek, u kterých byl proveden embryotransfer selektovaných embryí, otěhotnělo 14 (42,4 %), z toho 5krát gemini a 1krát GEU (gravidita extrauterina) (Tab. 1). Žádná pacientka nepotratila. Z celkového počtu těhotných dosud porodilo 6 žen (Tab. 2). Tři ženy porodily jedno dítě, tři ženy gemini. V jednom případě jednočetné gravidity byl pro předčasný odtok plodové vody a hrozící hypoxii plodu porod ukončen v 37. týdnu těhotenství císařským řezem, další dva porody proběhly spontánně ve 38. a 42. týdnu těhotenství. Porody gemin proběhly 2krát císařským řezem, a to ve 30. týdnu těhotenství a 31. týdnu těhotenství pro hrozící předčasný porod při neúspěšné tokolýze a nepravidelných polohách plodů. Třetí porod gemin proběhl spontánně ve 38. týdnu těhotenství. Všech 9 novorozenců je zdravých.
Diskuse
Při výběru embryí na embryotransfer se uplatňuje řada kritérií doporučených v ESHRE guidelines (instrukce vydané Evropským společenstvím pro lidskou reprodukci – ESHRE). Jedná se především o posouzení životaschopnosti embryí na základě kontroly počtu a kvality jednotlivých buněk v embryu. Kvalitu embryí hodnotí embryolog vizuálně pod světelným mikroskopem na základě svých zkušeností a praxe. Důležitým znakem je množství fragmentů mezi sesterskými buňkami, které vznikají asymetrickým odštěpováním cytoplazmy embryonálních buněk a snižují životaschopnost embryí. Během časného vývoje embrya dochází k různým odchylkám dělení buněk (asymetrické dělení, fúze buněk, fragmentace buněk atp.), které mohou vést k abnormálnímu růstu embrya a ke snížení jeho kvality.
Kontinuální monitorování vývoje embryí umožňuje pozorovat vznik těchto abnormalit a selektovat embrya s optimálním růstem. Normální vývoj embrya také souvisí se synchronizací buněčných dělení v embryu a s dodržením časových intervalů jednotlivých interfází a mitóz v buněčných cyklech.( 9, 10) Intervaly dělení buněk transferovaných embryí jsou znázorněny časovou křivkou (Obr. 4), která byla vytvořena na základě výsledků analýzy vývoje transferovaných embryí. Tyto výsledky odpovídají referenčním hodnotám intervalů buněčných dělení. Při kontinuálním monitoringu je možné přesně měřit délky těchto časových intervalů a porovnávat růstové křivky embryí s referenčními hodnotami. Délky intervalů buněčných cyklů embryonálních buněk tak lze použít jako objektivní kritérium pro výběr embryí s nejvyšší životaschopností.(8)
Závěr
Obrazová analýza dělení buněk velmi časných embryí umožňuje přesný a objektivní výběr embryí s nejvyšším potenciálem nidace. Embrya vybraná touto metodou vykazují nízké riziko nebo jiných genetických aberací obvykle vedoucích k časným těhotenským ztrátám. Při kamerovém monitoringu kultivace se navíc minimalizuje kontakt embryologa s biologickým materiálem a manipulace s embryi mimo inkubátor.
O autorovi: 1RNDr. Jana Rutarová, Ph. D., 1Ing. Blanka Koubková, 1MUDr. Jitka Řezáčová, 2MVDr. Daniel Hlinka, Ph. D., 2MUDr. Sonja Lazarovská, 2Mgr. Monika Pichlerová
1Ústav pro péči o matku a dítě, IVF, Praha
2Prague Fertility Centre, Praha
e-mail: lab.ivf@upmd.cz