Spermie v IVF laboratoři – několik postřehů z rutinní praxe

S rozvojem lidského poznání na poli biologie a medicíny došlo k výraznému pokroku také v oblasti reprodukce…

RNDr. Lucie Vlachová

GEST, Centrum reprodukční medicíny, Praha

Klíčová slova

ejakulát • spermie • IVF • ICSI

S rozvojem lidského poznání na poli biologie a medicíny došlo k výraznému pokroku také v oblasti reprodukce. V minulosti jedna z mála dostupných metod – umělá inseminace, a to jak spermiemi manžela, tak dárcovskými, byla zčásti nahrazena postupy asistované reprodukce. Nejprve to byla prostá in vitro fertilizace (IVF), kdy oocyty jsou spontánně oplozovány předem upravenými spermiemi. Následoval rozvoj mikromanipulačních technik, jako byla parciální disekce zona pellucida (PZD), subzonální inseminace (SUZI) a nyní již jedině intracytoplazmatická inseminace (ICSI). Spolu s uvedením těchto technik do rutinní praxe se změnil i požadavek na vývoj různých testů, které měly s větší či menší mírou spolehlivosti odpovědět na otázku, zda jsou určité spermie schopné oplodnit vajíčka mimo tělo ženy.

Nejjednodušší vyšetření, nativní spermiogram, má, jak praxe ukazuje, velmi malou prediktivní hodnotu. Popisuje pH, objem, vzhled a viskozitu ejakulátu, počet spermií, z nich podíl pohyblivých a podíl morfologicky abnormálních. Dále vyčísluje ostatní příměsi, jako například leukocyty. Nic však nevypovídá o kvalitě spermií. Na základě nativního spermiogramu nelze vynést kvalifikovaný odhad plodnosti vyšetřovaného muže. Situace je ještě o to složitější, že ejakulát je značně nehomogenní a i po dokonalém zkapalnění známe stále jen výsledek zkoumaného vzorku. Kvalita ejakulátu je také velmi proměnlivá v čase a odráží tělesný i psychický stav muže. Nativní spermiogram je tedy pouze vstupní informace a říká v podstatě jen, zda spermie jsou, či nikoliv.

Aby mohl být ejakulát použit k intrauterinní inseminaci, musejí být spermie separovány ze seminální plazmy. Nejjednodušší metodou je prostá opakovaná centrifugace ve fyziologickém nebo Ringerově roztoku. O něco složitější, ale co se týká kvality získaných spermií výhodnější postup, je metoda swim-up. Ejakulát je promíchán s kultivačním médiem, centrifugován, po odstranění supernatantu je sediment převrstven médiem a spermie se nechávají vyplavat. Tento postup lze libovolně obměňovat. Vyplaváním získáme populaci živých a dobře se pohybujících spermií, které lze použít jak pro inseminaci, tak pro IVF a ICSI.

Swim-up byl posléze částečně nahrazen centrifugacemi ejakulátu přes hustotní gradienty. V současnosti jsou používány komerčně dodávané roztoky, které zaručují vysokou biologickou bezpečnost. Výtěžnost je vyšší než u metody swim-up a získané spermie jsou velmi kvalitní.

V době neexistence asistovaného oplození (PZD, SUZI, ICSI) se velmi usilovně hledaly funkční testy, od kterých se očekávalo, že pomohou při rozhodování, zda bude možné použít zkoumané spermie, nebo bude nutné použít spermie dárce.

Mezi nejznámější a ve své době hojně používané testy patřil např. „zona free hamster eggs“ test, kdy byly předem zona pellucida zbavené křeččí oocyty vystaveny lidským spermiím a po kultivaci se vyhodnocovalo množství dekondenzovaných hlaviček spermií v oocytu.

Podobný byl i test, kdy se naopak spermie nechávaly procházet lidskou zona pellucida – „hemizona assay“. Obě tato vyšetření jsou v současnosti již jen historií.

Další vyšetřovací metodou byl hypoosmotický test („hypoosmotic sperm swelling test“). Spermie byly vystaveny hypoosmotickému prostředí a na základě tvarových změn bičíku pak bylo možno odečíst podíl spermií s intaktní membránou. Při kombinaci tohoto testu s barvením eozinem byla získána ještě i informace o stavu membrán akrosomu.

Vyšetřením vyššího řádu je sledování kinetiky akrosomální reakce. Tento test může vysvětlit idiopatické selhání fertilizace u jinak normospermických mužů.

Všechny výše uvedené testy však mají, mimo metodické, časové a ekonomické náročnosti, jednu zásadní nevýhodu. Prozkoumané spermie nelze použít k vlastnímu oplozování. Získané informace tak můžeme použít jen jako hrubou charakteristiku plodnosti vyšetřovaného muže.

Tento podstatný nedostatek však nemají metody swim-up a centrifugace přes gradient, kdy při zachování sterility zpracování lze spermie bez problémů použít k oplozování. Navíc, na základě dlouholeté zkušenosti, se výsledek metody swim-up ukazuje jako solidní prediktivní faktor pravděpodobnosti oplození metodou IVF. Při zisku jednoho a více miliónů spermií/ml po swim-up z 1 ml ejakulátu je pravděpodobnost cca 70 %, že se oocyty oplodní. Při méně než jednom miliónu spermií/ml je to jen kolem 30 %. Na našem pracovišti proto používáme metodu swim-up jako součást vyšetřovacího algoritmu neplodného páru. Na základě výsledku pak plánujeme, samozřejmě s ohledem na anamnézu, intrauterinní inseminaci, IVF nebo ICSI.

Množství spermií získaných centrifugací přes gradient tak jasný prediktivní význam nejeví.

V současnosti se velmi rozvíjí vyšetřování spermií metodou FISH („fluorescence in situ hybridization“), díky které se dozvíme více o genetické výbavě spermií. Bohužel, neexistuje přímý vztah mezi morfologií spermie a její genetickou výbavou, není proto možné od sebe oddělit „zdravé“ a „nezdravé“ spermie. Výsledek vyšetření pomocí FISH poskytuje tedy jen informaci o procentu geneticky abnormálních spermií ve zkoumaném vzorku, ale nic nevypovídá o spermiích, kterými se oplozuje.

Zásadní přelom nastal v polovině devadesátých let, kdy do rutinní praxe vstoupila metoda intracytoplazmatické inseminace – ICSI. Tato technika umožňuje oplozovat oocyty s vysokou účinností i při minimálním počtu spermií, které se navíc nemusejí ani dobře pohybovat.

Díky tomu většina dosud používaných testů byla v rutinní praxi z velké části opuštěna. Rozhodování, jak se budou oocyty oplozovat, nakonec vždy vyplyne z aktuálního stavu ejakulátu v den zisku oocytů.

Na základě výše uvedeného vyvstává otázka, která vyšetření ejakulátu mají biologickou, medicínskou a v neposlední řadě i ekonomickou opodstatněnost. V obavách ze selhání fertilizace se totiž ve všech jen trochu sporných případech oplozují oocyty metodou ICSI.

Z pohledu klinického pracovníka by pak největší význam měl takový test kvality spermií, který by zároveň umožňoval použít prozkoumané spermie k oplozování oocytů.

Human Reproduction. Abstracts from the 8th Annual Meeting of the European Society of Human Reproduction and Embryology, 1992.

Human Reproduction. Abstracts from the 10th Annual Meeting of the European Society of Human Reproduction and Embryology, 1994.

Human Reproduction. Abstracts from the 17th Annual Meeting of the European Society of Human Reproduction and Embryology, 2001.

Human Reproduction. Abstracts from the 19th Annual Meeting of the European Society of Human Reproduction and Embryology, 2003.

Mortimer, D., Henman, MJ., Jansen, RPS. Development of an Improved Embryo Culture System for Clinical Human IVF. 1st ed., 2002, Australia, W. A. COOK.

e-mail: lucie.vlachová@gest.cz

Ohodnoťte tento článek!