Klinická cytogenetika

Cytogenetika člověka je poměrně mladá a velmi úzce specializovaná klinická a vědecká disciplína. Přesný počet lidských chromozómů známe teprve od roku 1956. Avšak množství poznatků, které byly získány v prvním desetiletí od stanovení lidského karyotypu, nové techniky barvení a studia chromozómů člověka, zavedené v sedmdesátých letech, spolu s využitím metod molekulární biologie v letech osmdesátých potvrdily pevné místo, které tento obor má především v lékařské genetice.

V České republice jsou cytogenetické laboratoře součástí Oddělení lékařské genetiky, které jsou ve všech velkých městech a zabývají se genetickým poradenstvím. Dále vznikají cytogenetické laboratoře, které vyšetřují změny chromozómů u hematologických onemocnění a některých solidních nádorů. Cytogenetické vyšetření slouží především ke stanovení karyotypu nemocných s vrozenými vývojovými vadami, v prenatální diagnostice k určení chromozomového vybavení plodů, k zpřesnění diagnózy a určení prognózy některých nádorových onemocnění. V laboratořích hygienické služby se testují mutagenní účinky chemických látek na lidský organizmus na chromozómové úrovni.

Stavba chromozómů

Chromozómy vyšších živočichů mají komplikovanou stavbu, jejíž hlavní složkou je DNA a různé typy proteinů. Maximální kondenzace dosahují v metafázi mitotického cyklu, kdy mají nejlépe identifikovatelný tvar, a proto jsou v této fázi buněčného dělení nejčastěji sledovány a analyzovány. Pro mikroskopické studie jsou užívány buňky s chromozómy fixovanými na podložních sklech.

Typický chromozóm v metafázi sestává z dvou ramen, chromatid, rozdělených primární konstrikcí, kterou nazýváme centromera. Genetický základ chromatidy je dvojitá šroubovice DNA. Genetický materiál jádra barvitelný specifickými barvivy se nazývá chromatin. Jde o název cytologický, který je zavedený pro komplex DNA, RNA a proteinů. Celý genom haploidní lidské buňky obsahuje přibližně 1 m DNA, průměrně velký chromozóm sestává z 5 cm DNA. Průměrná chromatida je přibližně 5 mm dlouhá a zůstává často diskutovanou otázkou, jakým způsobem může být 5 cm DNA zapakováno do 5 mm dlouhé chromatidy.

Standardizace v lidské cytogenetice

Technický rozvoj barvicích metod umožnil přesnou identifikaci každého lidského chromozómu. Na chromozómu rozlišujeme krátké rameno, které označujeme „p“, primární konstrikci, kterou nazýváme centromera a dlouhá ramena, která označujeme „g“. Po obarvení pruhovacími metodami se vytvoří na každém chromozómu kontinuální série pruhů. Pruhy jsou po celé délce chromatid a sled tmavých a světlých pruhů, který je charakterizuje, je typický pro každý pár. K usnadnění popisu cytogenetických nálezů byl vypracován standardizovaný systém nomenklatury, který umožňuje velmi přehledně vyjádřit všechny nalezené odchylky od normy.

Klinická cytogenetika

Každý biologický druh má charakteristické chromozómové vybavení. U normální somatické buňky člověka je to 46 chromozómů, které dělíme na autozómy a heterochromozómy (také nazývané pohlavní chromozómy, sex chromozómy). Autozómů je 22 párů, pohlavní chromozómy jsou u zdravého jedince dva: u muže X a Y, u ženy XX. Při cytogenetickém vyšetření chromozómového vybavení, tzv. karyotypu lidské buňky, používáme nejrůznější typy kultivace nejrůznějších tkání. V běžné klinické praxi je nejčastější vyšetření lymfocytů periferní krve. Dělení lymfocytů stimulujeme rostlinnými lektiny, z nichž nejvíce používaný je výtažek z fazolí – fytohemaglutinin (PHA). Lymfocyty kultivujeme 72 hodin v růstovém mediu s přídavkem telecího séra. Buňky kostní dřeně vyšetřujeme u nemocných s leukémií buď přímou metodou, nebo po krátkodobé kultivaci v růstovém médiu bez přídavků mitogenů. Buňky solidních nádorů vyšetřujeme po krátké kultivaci opět ve vhodném mediu s přídavkem fetálního telecího séra. Při prenatální cytogenetické diagnostice vyšetřujeme buňky choriových klků, nebo placenty (prenatální diagnostika I. trimestru), nebo buňky plodové vody (prenatální diagnostika II. trimestru). V některých případech kultivujeme fetální krev. Při sledování mozaiky buněčných linií u postižených jedinců odebíráme a vyšetřujeme kožní fibroblasty.

Chromozómové odchylky mohou být:

Početní autozómové

heterochromozómové

Strukturní autozómové

heterochromozómové

Odchylky chromozómů mohou být přítomné ve všech buňkách všech tkání nebo jen v některé tkáni. Jsou-li přítomny jen v některých buňkách, nazýváme takový stav chromozómovým mozaicizmem neboli mozaikou.

Fenotypy nemocných s autozomálními aberacemi

U syndromů spojených s autozomálními odchylkami se klinické příznaky značně překrývají. Hlavní společné znaky jsou:

nízká porodní váha

neprospívání

mentální retardace

malá postava

mikrocefalie, anomální umístění očí, dysmorfická tvář, nízko nasazené uši s deformacemi

nejrůznější anomálie horních i dolních končetin

vrozené vady srdeční, mozkové, močového a pohlavního ústrojí.

Kromě těchto společných vývojových vad jsou u většiny syndromů ještě další, zcela typické malformace. Společné příznaky u všech autozomálních syndromů jsou nezávislé na chromozómu, který je buď v nadpočetném stavu nebo chybí.

Syndromy spojené s početními změnami autozómů

Trizómie 21

Downův syndrom se vyskytuje u jednoho z 600 – 800 živě narozených dětí a je nejčastějším syndromem s početní změnou chromozómů. Děti narozené s tímto syndromem můžeme diagnostikovat již ve velmi raném věku. Nejnápadnější je typická tvář – šikmé oči, vpadlý kořen nosu, velký jazyk a svalová hypotonie. U všech postižených je typická mentální retardace. Jedinci s Downovým syndromem mají 15násobně vyšší riziko vzniku leukémie. Asi třetina z nich má vrozenou srdeční vadu, všichni jsou náchylní k infekcím. Riziko porodu trizomického dítěte narůstá s věkem matky: 24 let – 1 : 1550; 25 až 30 let 1 : 700; 40 let – 1 : 100; 45 let a více – 1 : 25. Proto je u všech gravidních žen starších 35 let nezbytná amniocentéza s odběrem plodové vody k vyšetření chromozómů.

Trizómie 18

Trizómie 18 se vyskytuje u jednoho z 8000 živě narozených dětí. Klinický obraz trizómie 18 je velmi typický, prsty rukou jsou překřížené typickým způsobem, druhý přes třetí a pátý přes čtvrtý, při narození jsou děti velmi malé, s charakteristickou tváří a utvářením lebky. Asi 80 % dětí je ženského pohlaví, vždy je výrazná mentální retardace a celkové neprospívání. Nemocní umírají velmi brzy po narození. Věk matek nemá vliv na výskyt trizómie 18.

Trizómie 13

Trizómie 13 se vyskytuje u jednoho z 20 000 živě narozených dětí. Děti s trizómií 13 mají rozštěp patra i rtu, oční změny, změny na horních i dolních končetinách, vrozené srdeční vady, anomálie ledvin, změny na zažívacím ústrojí, pohlavních orgánech. Porodní hmotnost je malá, pláč slabý. Většina dětí umírá v prvních dnech nebo týdnech života. Trizómie 13 je spojena s vyšším věkem matky.

Triploidie

Cytogenetické vyšetření spontánních potratů potvrdilo, že triploidie (tzn. tři haploidní sady chromozómů) je u plodů poměrně častá. Někdy se placenta v začátku gravidity zvrhne na abnormální tkanivovou masu, což je způsobeno neobvyklým růstem choriových klků. Tato abnormalita se nazývá hydatiformní mola. Mola může být úplná bez plodu a normální placenty, pak jsou všechny chromozómy otcovského původu a karyotyp je skoro výhradně 46, XX. Vznik úplné moly vysvětlujeme oplodněním bezjaderného vajíčka spermií 23, X. Chromozómy spermie se zdvojí a všechny genetické markery jsou v homozygotním stavu. U parciální (částečné) moly bývá karyotyp 69, XXY nebo 69, XXX a triploidie je způsobená dvojitou sadou chromozómů otce. Může vzniknout oplodněním vajíčka dvěma spermiemi. Několik jedinců s triploidní chromozómovou výbavou se narodilo živě. Vyznačovali se nízkou porodní hmotností a mnoha nespecifickými vrozenými vývojovými vadami. Přežívali jen velmi krátce po porodu.

Syndromy spojené se strukturními odchylkami autozómů

Delece krátkých ramen chromozómu 4

Syndrom 4p- se vyskytuje velmi sporadicky. Poměrně malá delece krátkých ramen chromozómu 4 vede k výraznému defektu v mentálním vývoji. Postižené děti se nenaučí ani sedět, chodit či mluvit. Jako všechny děti s chromozómově podmíněnými syndromy mají malou porodní hmotnost a špatně prospívají. Jejich růst a kostní věk je opožděný. Nemocní mají charakteristickou tvář, která je pro zkušeného pediatra indikací k cytogenetickému vyšetření. Dále mají typické změny oční (šilhání, hypertelorizmus), nízce nasazené uši a často i anomálie pohlavního ústrojí (u chlapců hypospadie, kryptorchizmus). Časté jsou vrozené srdeční vady, které jsou hlavní příčinou úmrtí.

Delece krátkých ramen chromozómu 5 (syndrom cri du chat)

Tento syndrom poprvé popsal a také pojmenoval J. LEJEUNE z Paříže v roce 1963. Byl to první deleční syndrom a jeho název přeložený do češtiny znamená „syndrom kočičího křiku“. Postižené děti mají anomální tvar hrtanu, který způsobuje, že jejich pláč je slabý a podobný nářku kočky. Tato vada mizí během prvního měsíce života. Nemocní se často nenaučí mluvit, ale není jasné, zda je to způsobeno anomáliemi hrtanu nebo celkovou vývojovou a mentální retardací. Postižené děti se rodí s nízkou porodní hmotností, velmi špatně prospívají, zřídka dorůstají výšky 150 cm a obvykle mají těžké srdeční vady. Přesná četnost výskytu není známa. Odhaduje se na 1 : 20 000. Rozsah delece může být 5 – 80 % délky krátkých ramen, zasahuje však vždy pruhy 5p14 a 5p15. Tento syndrom není spojen s vyšším věkem matky.

Delece dlouhých ramen chromozómu 13

Částečná delece chromozómu 13 je spojena s nejrůznějšími fenotypovými projevy, které jsou spojeny s rozsahem delece. Klasický 13q-syndrom je charakteristický mentální retardací, postižením zrakového ústrojí (mikroftalmie, defekty duhovky, defekty sítnice). U nemocných, kteří mají deletován pruh 13q14, se vždy vyskytuje retinoblastom (tj. zhoubný oční nádor sítnice, který se objevuje v raném dětském věku). Frekvence narození dětí s del(13)je 1 : 15 000 – 20 000. Rodiče nemocných s 13q- syndromem mají obvykle normální chromozómové vybavení, přesto k vyloučení nositelů translokace je nutné vyšetření jejich karyotypu.

Mikrocytogenetika

Zásluhou zavedení nových metod kultivace, synchronizace buněčného dělení a studia chromozómů buněk v profázi nebo prometafázi (tj. tzv. high resolution technique – HRT, česky metoda s maximální rezolucí, nebo technika s maximální rozlišovací citlivostí) můžeme získat chromozómy, na kterých se po obarvení objeví až 850 pruhů v haploidní sadě. Na takto připravených chromozómech byly objeveny u různých onemocnění nebo klinicky definovaných syndromů malé delece, duplikace nebo triplikace, které nebylo možné určit dřívějšími konvenčními metodami. Tento nový trend v klasické cytogenetice se nazývá mikrocytogenetika. Význam-né je, že kromě některých sporadicky se vyskytujících nebo nově vzniklých translokací byly mikrodelece nalezeny i u onemocnění, která jsou genetického původu.

Malé delece byly zjištěny u dobře známých syndromů s vrozenými vývojovými vadami. Intersticiální delece byla určena u Praderova-Williho syndromu na chromozómu 15 del(15)(q11-12), terminální delece 17 del(17)(p13.3) u většiny nemocných s Miller – Diekerovým syndromem, intersticiální delece 8 del(8) (q23.3 – 24.1) u nemocných s Giedion-Langerovým syndromem, intersticiální delece 11 del(11)(pl3) u všech nemocných s WAGR syndromem (Wilmsův nádor, Aniridie, growth retardation- růstová retardace) a řada dalších. Dále kombinace metod HRT a studium markerů DNA umožnila lokalizaci genů pro retino-blastom a objasnění autozomálně recesívního typu mutace a další somatické mutace, při které může být ztracena normální alela v sítnici u retinoblastomu. Podobné studie jsou prováděny i u Wilmsova nádoru a neuroblastomu.

Rovněž u malých delecí X chromozómů, případně při detekcích balancovaných translokací u probandů s onemocněním autozomálně dominantním nebo vázaným na X, přispěly HRT techniky často kombinované s metodami molekulárně biologickými k lokalizaci odpovídajících genů.

Početní a struktuální změny heterochromozómů (pohlavních chromozómů, gonozómů)

Početní a struktuální změny pohlavních chromozómů mohou vzniknout během meióze nebo při následujících děleních. Početní změny jsou častější než změny struktuální. Při početních změnách může mít postižený jedinec následující chromozómový komplement:

Chybí jeden pohlavní chromozóm (monozómie X).

Jeden nebo více pohlavních chromozómů je nadpočetných (trizómie, tetrazómie, pentazómie X, nebo YY).

Následkem mozaicizmu má postižený jedinec dvě nebo více buněčných linií.

Postižený jedinec má dvě buněčné linie: 46,XX a 46,XY a jedná se o pravý chimérizmus. Ten může vzniknout velmi časnou fúzí dvou oplozených oocytů nebo dispermií.

Při strukturálních změnách heterochromozómů dochází k jejich přestavbě několika různými mechanizmy:

Jednoduchými zlomy vznikají delece krátkých nebo dlouhých ramen X nebo Y chromozómu (del(Xp), del(Xq), del(Yq)).

Příčným rozdělením centroméry (místo obvyklého podélného) nebo zlomem chromatidy v těsné blízkosti centroméry s následným zdvojením dlouhých nebo krátkých ramen vznikají izochromozómy. Nejčastější jsou iso(Xq), které znamenají trizómii pro dlouhá ramena X a monozómii krátkých ramen ve výsledném karyotypu.

Dvěma zlomy a následným spojením vzniká kruhový chromozóm (ring, prstencový chromozóm).

Y chromozóm u mužů

Zdravý muž má karyotyp 46,XY, má 22 párů autozómů a dva pohlavní chromozómy X a Y. Y chromozóm je malý akrocentrický chromozóm, téměř stejné velikosti jako jsou chromozómy 21. a 22 párů. Od nich se však liší stavbou i barvitelností.

Genová výbava:

Na Y chromozómu jsou geny určující založení a maturaci testikulární tkáně, některý z genů, které spolupůsobí při růstu postavy do výšky, gen pro spermatogenezi. Další geny, které jsou na Y chromozómu lokalizovány, studuje řada laboratoří metodami rekombinantní DNA.

Početní odchylky Y chromozómu

XYY syndrom

Jedinci se syndromem XYY (někdy nesprávně nazývaným syndrom supermale = supermuž) se rodí s frekvencí 1 : 700 – 1000 chlapců. Svým fenotypem se neliší od svých normálních vrstevníků. Statisticky je však prokázáno, že jsou v průměru vyšší postavy než 46,XY muži. Od roku 1965, kdy JACOBSOVÁ jako první uveřejnila studii, ve které dala do souvislosti nález 47, XYY a sklony k agresivitě, impulzivnímu jednání, případně i zločinnosti, je v odborné literatuře tento problém diskutován. Vzájemný vztah mezi chromozómovým nálezem YY a agresivitou nebyl nikdy jednoznačně prokázán, ani vyvrácen. Plodnost není u těchto mužů snížená; nadpočetný Y chromozóm je ve spermiích eliminován.

Početní odchylky X chromozómu (aneuploidie X ) u mužů – Klinefelterův sy

Tento syndrom popsal Klinefelter již v roce 1942. Z klinických příznaků je nejtypičtější gynekomastie, malá varlata (délkou dosahují jen 2 cm), azoospermie, snížená hladina testosteronu v krvi. Pubické ochlupení a rozložení tuku je ženského typu, vousy buď vůbec nerostou, nebo tvoří jen věneček okolo úst. Syndrom je diagnostikován často až po pubertě, většina postižených přichází k cytogenetickému vyšetření z poraden pro neplodná manželství. Někteří postižení mohou být mentálně retardovaní. Frekvence Klinefelterova syndromu je 1 : 700 až 1000 narozených chlapců.

Klasický cytogenetický nález 47,XXY zjišťujeme u více než 80 % nemocných. U 15 % je tento karyotyp v mozaice s normálním nálezem 46,XY. Specifickou, ale vzácnou variantou je chromozómový nález 46,XX. U mužů s tímto karyotypem byla zjištěna translokace krátkých ramen Y chromozómu na krátká ramena jednoho X chromozómu. Detekce této malé translokace nebyla možná běžnými cytogenetickými metodami, ale jen pomocí in situ hybridizace a DNA analýzou (Southern blot). Vzácné jsou i další varianty Klinefelterova syndromu: 48,XXXY, 49,XXYY. S přibývajícím počtem X chromozómů se objevuje výrazná mentální retardace a zhoršení klinických příznaků.

Početní a struktuální odchylky X chromozómu u žen

Početní a struktuální odchylky X chromozómu u žen vedou k poruchám pohlavního vývoje. Vývojové poruchy vnitřního a zevního genitálu jsou různé. K jejich klasifikaci je nutné mít k dispozici informace:

o chromozómovém vybavení jedince

o morfologii gonád vnitřního a zevního genitálu

o funkci gonád.

Větší část vývojových poruch gonád je způsobena aberacemi pohlavních chromozómů, menší část je způsobena známými defekty v biosyntéze gonadálních a nadledvinových steroidů. Tyto defekty jsou většinou autozomálně recesívně dědičné. Další skupinu tvoří vývojové poruchy gonád s nejasnou etiologií, o kterých však víme, že bývají dědičné (čisté gonadální dysgeneze). Do poslední skupiny patří nemocné s necitlivostí na androgeny, u kterých je prokázána genová mutace vázaná na X chromozóm.

Monozómie X u žen – Turnerův sy

Soubor příznaků popsal TURNER v roce 1938. FORD se spolupracovníky v roce 1959 zjistili, že postižené ženy mají 45 chromozómů a chybí jim jeden X chromozóm. V klidových jádrech není prokazatelný X-chromatin. Incidence se udává 1 : 10 000 živě narozených děvčat.

Klinické příznaky: nízká porodní hmotnost, charakteristický edém u novorozenců, Pterygium coli (kožní řasa na krku), pohlavní infantilizmus, cubitus valgus (snížená pohyblivost loketního kloubu), široký hrudník se vzdálenými prsními bradavkami, koarktace (zúžení) aorty, ovaria tvořená jen vazivovou tkání (lištovité gonády), primární amenorhea. V dospělosti nemocné dorůstají maximálně 135 – 150 cm. Většina nemocných s Turnerovým syndromem má karyotyp 45,X. Není zcela jasné, jak častá je mozaika 45,X/46,XX; odhaduje se, že asi 30 % případů má tuto mozaiku ve všech tkáních. Nejčastější nález při cytogenetickém vyšetření spontánních potratů byl karyotyp 45, X bez zjištěné mozaiky. Proto se předpokládá, že 96 % všech koncepcí s karyotypem 45,X umírá in utero a není vyloučeno, že přítomnost chromozómové linie 46,XX je nutná pro životnost zárodku. Pak by všechny nemocné s Turnerovým syndromem musely mít vedlejší buněčnou linii s normálním karyotypem, kterou současnými cytogenetickými metodami nemusíme vždy odhalit. Správnost takového předpokladu by mohly potvrdit metody analýzy DNA.

U některých nemocných s vyjádřenými příznaky Turnerova syndromu nalézáme struktuální odchylky druhého chromozómu. Nejčastější je izochromozóm dlouhých ramen X (karyotyp 46, Xi(Xq)), méně časté jsou delece dlouhých nebo krátkých ramen X chromozómu (karyotyp 46,X del(Xq) nebo del(Xp)), případně kruhový (ring) chromozóm (karyotyp 46,Xr(X)). Ring chromozóm může být nejrůznější velikosti. U všech struktuálních aberací X chromozómu určujeme všemi dostupnými cytogenetickými metodami původ aberovaného chromozómu. Nejnověji používáme metody molekulárně biologické, zvláště k rozlišení, zda přestavěný chromozóm má svůj původ v X nebo Y chromozómu. Přítomnost Y chromozómu i jeho malé části zvyšuje riziko vzniku zhoubného nádoru v gonadální tkáni (tzv. gonadoblastomu).

Trizómie X u žen

Ženy s karyotypem 47,XXX mají normální fenotyp. Incidence při narození je podobná jako u Klinefelterova syndromu 1 : 1000 narozených děvčat. Syndrom nemá vyhraněné klinické příznaky. Občas je cytogeneticky diagnostikován při vyšetření žen se sníženou fertilitou nebo při vyšetřování poruch menstruačního cyklu. Většina nemocných je plně fertilní a rodí zdravé děti, i když teoreticky má dvojí typ chromozomálního vybavení vajíčka.

Závěr

V tomto přehledu jsme uvedli jen některé z nejčastěji se vyskytujících chromozómových odchylek, se kterými se setkáváme v laboratořích klinické cytogenetiky při prenatálních nebo postnatálních vyšetřeních indikovaných klinickými genetiky. Jak bylo řečeno v úvodu, jsou to odchylky vrozené, charakteristické pro chromozomálně podmíněné klinické syndromy. Nejnovější metody, především molekulární cytogenetiky, přinášejí nové poznatky, které počet těchto syndromů neustále rozšiřují. Samozřejmě další, neméně významnou součástí klinické cytogenetiky je ve stále větší míře i určování chromozómových odchylek získaných, které jsou charakteristické pro zhoubné nádory. Především v onkocytogenetice je nárůst poznatků důsledků početních a struktuálních změn chromozómů na molekulární úrovni obrovský.

n

Ukázka početní odchylky chromozómů

Ukázka strukturní přestavby chromozómů

Ohodnoťte tento článek!