Laboratorní vyšetření

Barvení močového sedimentu

Lékařská i sesterská veřejnost si často neuvědomuje, že vyšetření močového sedimentu, považované za jedno ze základních, patří mezi časově nejnáročnější biochemické metody. Zatímco moderní analyzátory chrlí kvantitativní biochemická vyšetření všeho druhu v několikavteřinových intervalech a také kvalitativní chemické vyšetření moči indikátorovými proužky (s nebo bez odečítání reflektančními fotometry) se významně urychlilo, ztrácí laborant nad jedním poctivě vyšetřeným močovým sedimentem pět i více minut.

Vyšetřování močového sedimentu se provádí více než 150 let. V polovině našeho století se mu systematicky věnoval Thomas Addis, jehož jméno nám již něco napovídá, v 70. – 80. letech se výrazně zasloužila o standardizaci laboratorního zpracování močového sedimentu trojice českých autorů – Tobiška, Nejedlý, Zahradníček.

Zdokonalily se mikroskopy, ale v praxi vyšetřování močových sedimentů v našich laboratořích se toho mnoho nezměnilo. Větší laboratoře se potýkají s velkým počtem vyšetření které jen s obtížemi zpracovávají v režimu „lege artis“. Poslední léta jsou charakterizována i vývojem průtokových cytometrických analyzátorů moči a vývojem automatizované mikroskopie. Úroveň analýzy močového sedimentu u těchto přístrojů neustále roste, ale zatím je taková, že představuje více nebo méně spolehlivé síto, snižující potřebu klasické mikroskopie na zvládnutelný objem. Přístroje jsou pro české poměry velmi drahé, a tedy použitelné jen ve velkých laboratořích. Vyšetření moči a močového sedimentu je však třeba provádět po celé šíři zdravotní sítě, neboť ho prakticky nelze centralizovat.

Klasická mikroskopie močových sedimentů je nejen časově náročná, ale je zatížena – zvláště při prohlížení nativního preparátu (což bylo a v řadě laboratoří dosud je běžnou praxí) – značnou mírou nejistoty vyplývající z povahy metody samé. Je to pochopitelné, poněvadž močové elementy pocházejí z různých tkání (epiteliální vrstvy močového a genitálního traktu, z krve, pojivových tkání, nádorů) a jen málokdy mají zcela typický vzhled. Vykazují totiž velmi výrazný stupeň variability daný degenerativními změnami (vliv různé osmolality moči, fluktuace pH prostředí, účinek enzymatických, toxických a bakteriálních látek), změnami strukturálními i objemovými. To vše se přidává k nejistotám pramenících z malého kontrastu mezi močovými elementy a tekutým médiem. Diferenciace elementů při běžné světelné mikroskopii je tedy často frustrujícím problémem, s nímž se potýkaly všechny generace laborantů, a to i těch nejzkušenějších.

Již od dob před druhou světovou válkou se datují pokusy o usnadnění diferenciace elementů močového sedimentu jejich barvením. Většina z barvících postupů barvila jen některé z přítomných součástí močového sedimentu a v širším měřítku se neuplatnila. Platí to i o soupravě na barvení močového sedimentu SU – 40, kterou od 80. let donedávna vyráběla brněnská Lachema. Nestálost pracovního reagens s peroxidem, jež se muselo postupně upravovat, nutnost pečlivého sledování pH moči, nestandardnost zbarvení elementů v závislosti na přítomnosti redukujících látek v moči a na počtu přítomných leukocytů i erytrocytů způsobila, že se uvedené soupravy v ČR používaly jen výjimečně.

Autoři Sternheimer a Malbin již od 50. let vyvíjeli „supravitální“ barvení (barvení elementů těsně po jejich smrti) močových sedimentů. Po řadě úprav a s využitím různých variant barviček publikoval už samotný Sternheimer v roce 1975 v časopise JAMA barvicí postup, který odstraňoval některé nedostatky dřívějších barvicích metodik a byl vyzkoušen v široké míře především v severských evropských zemích, zvláště ve Finsku (od roku 1983). Sternheimerova barvička je směsí alciánové modři s pyroninovou červení, pracovní reagens je stálé a je-li chráněno před světlem a zabrání-li se bakteriální kontaminaci, vydrží tři měsíce při laboratorní teplotě.

Směs barví v sedimentu krevní elementy, epiteliální buňky, a to benigní i maligní, barví močové válce včetně jejich inkluzí. Barví i bakterie a amorfní mukus i spermie. Naopak se nebarví tukové kapénky v buňkách a válcích, nebarví se krystaly, pigmentové válce (hemoglobinové, krevní, bilirubinové), nebarví se kvasinky ani houby a trichomonády, které navíc barvička znehybňuje.

Znamená to, že u některých sedimentů je optimální vedle obarveného sedimentu vyšetřit i nativní preparát, nejlépe ve fázovém kontrastu nebo preparát barvit např. na tuky (tuková tělíska, inkluze a válce u nefrotického syndromu), na hemosiderin, či eozinofily atd.

Zatímco alciánová modř barví mukopolysacharidové matrix válců (obsahujících Tamm-Horsfallův mukoprotein) a mukus, barví pyroninová červeň přednostně cytoplasmu buněčných elementů. Výhodou je okamžitý start barvení po smísení barvičky se zkoncentrovanou močí a velmi důležitý je i fakt, že s narůstajícím časem nedochází k fenoménu přebarvení, takže laboranti nepracují pod časovým stresem (viz počítání elementů bílé řady ve Fuchs–Rosenthalově komůrce u likvoru).

Barvení močových sedimentů na našem pracovišti – začátek

Bezprostředním impulzem našeho zájmu o barvení močových sedimentů se staly kontroly SEKK v ČR (Systém externí kontroly kvality), prováděné od roku 1996 formou barevných fotografií močových sedimentů barvených Sternheime-rovou barvičkou a získávaných z Finska. V době zavádění těchto kontrol nebyl k dispozici žádný atlas barvených močových sedimentů (a není dosud) a nikdo z nás, laborantek, neměl s hodnocením barvených sedimentů sebemenší zkušenosti. Každé kolo SEKK kontroly močových sedimentů bylo malým dobrodružstvím, ale současně – často dodatečně – velkým poučením pro celou laboratoř.

V laboratoři jsme pak využili Zeissova mikroskopu FLUOVAL R, opatřeného fotoaparátem, opatřili jsme si první šarže Sternheimerovy barvičky v SEKKu a od června 1998 jsme začali experimentovat s barvením močových sedimentů. Veškerou fotodokumentaci jsme provedli na čs. diapozitivním filmu FOMACHROM CR 100. Postupně se podařilo připravit na 300 barevných diapozitivů, které se prezentovaly na oddílenských seminářích.

Na „močárně“ došlo ke kádrové stabilizaci v podobě dvou laborantek, které zvládly dokonale jak techniku barvení, tak i interpretaci nálezů a rozhodovaly o preparátech, které se nafotografují. U těchto dvou laborantek se pak postupně vyučilo dalších 20 laborantek a po roce popsané přípravy se zavedlo barvení do rutiny – od června 1999.

Barvení přineslo překvapení

Byly jsme překvapeny, jak barvení rozšířilo spektrum nalézaných elementů. Překvapováni byli i kliničtí lékaři, kteří se s nálezy jako např. „třpytivé buňky“ (nabobtnalé leukocyty v hypotonických močích, jevící Brownův pohyb granul v cytoplazmě, typické pro pyelonefritidy), erytrocytární válce, voskové válce, atd. v éře před barvením prakticky nesetkávali. OKB muselo v souvislosti se zavedením barvení vydat pro lékaře písemné informace.

Vlastní varianta barvení

Naše roční experimentování s barvením a fotografováním močových sedimentů vyústilo nakonec ve vypracování naší vlastní modifikace barvení, kterou pro ilustraci ukazuje obrázek. Důvodem k této modifikaci byla potřeba zachovat si část zcentrifugované a zkoncentrované moči pro eventuální další potřebná vyšetření a konečně i značné zjednodušení a urychlení barvící procedury.

Ověření spolehlivosti naší varianty a naprosté srovnatelnosti s výsledky doporučeného postupu (viz návod firmy Lachema, která od léta 1999 převzala výrobu a prodej finské modifikace Sternheimerovy barvičky) jsme věnovali velké úsilí. Detaily podpory tohoto závěru by byly nad rámec této stručné informace.

n

Na podložní sklo naneseme 2 ml barvy.

Do kapky barvy vkápneme 10 ml močového sedimentu.

Kapku zakryjeme krycím sklem velikosti 18 x 18 mm.

Mikroskopujeme při 200 a 400násobném zvětšení.

Ohodnoťte tento článek!