Klíčová slova
drogy • screening na drogy • identifikace drog • interference při imunochemickém screeningu drog
V problematice abúzu drog má svoji nezastupitelnou úlohu i vyšetření v toxikologické laboratoři. Pozitivní výsledek analýzy je totiž jediným objektivním potvrzením aplikace drogy. Výsledky toxikologického vyšetření pomáhají lékaři jak při diagnostice zneužívání drog a závislosti na drogách, tak při kontrole užívání terapie a abstinence od drogy při substitučních léčebných programech. V akutních případech umožní toxikologická analýza rozlišení intoxikace od projevů abstinenčního syndromu.
Při analýze vzorku biologického materiálu na přítomnost drog se provádí nejdříve imunochemický screening, při kterém se vytřídí pozitivní a negativní vzorky. U pozitivních vzorků následuje konfirmace a jednoznačná identifikace drogy metodami založenými na jiném principu, což jsou metody chromatografické. Protože imunochemická vyšetření zahrnují jen omezený počet látek, musí být v některých případech (GHB - „tekutá extáze“, durman - atropin) použity chromatografické metody i pro screening.
Výběr biologického materiálu
Pro úspěšný výsledek analýzy je důležitá volba správného materiálu a jeho dostatečné množství (50 ml moče, 10 ml krve). Pro vyšetření na přítomnost neznámé látky - tedy i drogy - je vhodným materiálem moč. Imunochemické metody pro screening drog jsou vyráběny pro moč, pro krevní sérum existují pouze pro barbituráty a benzodiazepiny. Přehled běžně dostupných testů na drogy je uveden v Tab. 1. Někdy jsou prováděny úpravy postupu, aby bylo možné sety připravené pro moč použít i pro krev. V těchto případech je nutné výsledky hodnotit zvlášť obezřetně a snížit limit detekce. Přesto výsledky nejsou příliš spolehlivé, zvláště pro budivé aminy. Krev je vhodná pouze pro cílenou analýzu na předem známou drogu a pro stanovení její hladiny. Pro tuto analýzu je ale nutné použít chromatografické metody. Vyšetření na drogy je možné provést i ve smolce novorozenců, vlasech a slinách. Tato vyšetření však nepatří mezi každodenní rutinu, jsou časově náročná a jsou požadována specializovanými zařízeními. V poslední době je věnována velká pozornost analýze slin, hlavně v souvislosti s testováním řidičů přímo při kontrole policií.
Časové limity pro detekci drog v jednotlivých typech materiálů jsou různé. Vždy však závisí na velikosti dávky, způsobu aplikace a konkrétní látce. Jejich orientační přehled je uveden v Tab. 2 . Zatímco analýza vlasů a smolky ukazuje historii užívání drog, analýza slin má zachytit přítomnost farmakologicky aktivní drogy v době testování. Byla nalezena výrazná korelace mezi koncentrací látky ve slinách a fyziologickým účinkem a vlivem na chování.(1)
Imunochemické screeningové metody
Pro drogový screening jsou v toxikologické analýze používány především neizotopové homogenní kompetitivní metody, při kterých soutěží analyt ze vzorku (antigen) se značeným antigenem o vazebná místa na protilátce. Přitom dochází v reakční směsi ke změnám, které způsobí změnu měřené veličiny. Podle značení antigenu nebo podle měřeného signálu se tyto metody dále dělí na enzymatické - EMIT (Enzyme Multiplied Immuno Technique), CEDIA (Cloned Enzyme Donor Immunoassay), fluorescenční - FIA (Fluorescence Immunoassay), FPIA (Fluorescence Polarization Immunoassay), a precipitační. Poslední jmenované jsou používány v jednorázových testech.
Imunochemické metody jsou jediné metody toxikologické analýzy, které lze provádět přímo ve vzorku biologického materiálu, odpadá tedy časově náročná izolace. Proto jsou i velmi rychlé, výsledek je za 15-20 minut. Mezi jejich další přednosti patří i malá spotřeba materiálu (100-300 mikro l) a záchyt nízkých koncentrací (limity detekce 1-1000 ng/ml).
Pro screeningové metody jsou připravované převážně polyklonální protilátky, které zachytí celou skupinu strukturně podobných látek, jsou to tedy metody nespecifické. Např. při screeningu na opiáty dochází nejen k záchytu morfinu, proti kterému je protilátka připravena, ale i ostatních derivátů morfinu - kodeinu, etylmorfinu (Diolan), hydrokodonu, dihydrokodeinu (Paracodin), folkodinu (Neocodin) a dalších. Imunochemické screeningové metody neumožňují přesnou identifikaci, proto je nutné každý pozitivní výsledek potvrdit a látku přítomnou ve vzorku přesně identifikovat.
Nespecifičnost imunochemických screeningových metod je charakterizována tzv. zkříženými reakcemi, které znamenají možnost, že protilátka bude reagovat i s jiným antigenem než s tím, proti kterému byla vyrobena. Tato vlastnost, která na jedné straně umožňuje skupinu drog zachytit, je ale i příčinou skutečnosti, že někdy s protilátkou reagují jiné látky než látky ze skupiny, pro kterou byla vyrobena. Objevují se tedy falešně pozitivní výsledky. V některých případech se naopak vyskytují výsledky falešně negativní, což je záležitost mnohem závažnější, protože by v případech intoxikací drogami mohly ohrozit život pacienta.
Falešně negativní výsledky mohou být způsobeny charakterem testované skupiny látek, ve které je příliš mnoho strukturně podobných léčiv, které se výrazně liší dávkováním (10-0,5-0,25 mg v tabletě) i způsobem vylučování (volné, ve formě konjugátů). Protilátka pak není ke všem lékům stejně citlivá. U metod typu EMIT se to týká především benzodiazepinových derivátů. Další příčinou falešné negativity mohou být látky vlastní analyzované matrici i některé léky podané terapeuticky, např. nesteroidní antirevmatika. Terapie, kterou pacient užívá, může ovšem být příčinou i falešně pozitivních výsledků. Výskyt falešně negativních výsledků lze ovlivnit snížením limitu detekce (hodnota cut-off) pro rozlišení negativních a pozitivních výsledků. Laboratoř musí ovšem mít dostatečně citlivé metody k potvrzení nízkých koncentrací zachycených látek.
V laboratořích jsou imunochemická měření prováděna na klinických analyzátorech, které jsou pravidelně kontrolovány a kalibrovány a případná chybná měření rychle zjištěna a jejich příčiny odstraněny. Proto jsou výsledky z analyzátorů spolehlivé. Výsledek je zobrazen jako číselný údaj, který pouze rozlišuje pozitivní a negativní vzorek, neodpovídá skutečné koncentraci drogy ve vzorku.
Dále existují imunochemické testy na jedno použití ve formě proužků či kazet pro jednu či více drog současně. Provedení je jednoduché - ponoření proužku do vzorku moče či aplikace moče kapátkem do označeného bodu. Výsledek se odečítá po určité době, uvedené výrobcem, podle vytvoření barevného proužku v testovací a kontrolní části soupravy. Jedinou kontrolou funkčnosti systému je objevení proužku v kontrolní části; pokud tam není, je souprava nefunkční. Tyto testy jsou silně ovlivnitelné interferencemi a jejich kvalita může být různá pro různé šarže. Při jejich provedení a vyhodnocení je nutné dodržovat přiložené návody. Jednorázové metody jsou vhodné pouze pro hrubou orientaci při měření v terénu.
Konfirmační chromatografické metody
Pro potvrzení pozitivních nálezů imunochemického screeningu musí být použity metody, které umožní jednoznačnou identifikaci látky přítomné ve vzorku, a to v koncentracích nižších, než ve kterých je zachytí imunochemické metody. Tyto požadavky splňují metody chromatografické, především plynová chromatografie s detekcí hmotnostní spektrometrií (GC/ MS) či tandemovou hmotnostní spektrometrií (GC/MS/MS). Ukázka záznamu průkazu morfinu jako trimetylsilylderivátu metodou GC/MS je na Obr., v horní části je průběh chromatografie, v dolní je čárové spektrum trimetylsilylderivátu morfinu s typickými hmotnostními ionty 401, 414 a 429.
Lze ale použít i jiné chromatografické metody, záleží na vybavení laboratoře a koncentraci prokazované drogy. Může to být plynová chromatografie sdetektorem elektronového záchytu nebo detektorem dusík-fosfor, kapalinová chromatografie sUV detekcí a v případech intoxikací i chromatografie na tenké vrstvě. V poslední době nabývá na významu i kapalinová chromatografie sdetekcí hmotnostní spektrometrií (LC/MS, LC/MS/MS). Před vlastní analýzou je vždy nutné provést izolaci ze vzorku biologického materiálu. Používá se podle okolností extrakce kapalina-kapalina nebo extrakce na pevné fázi, případně ve spojení s derivatizací. Analýza chromatografickými metodami je časově náročná, 3-4 hodiny, někdy déle, podle komplikovanosti případu.
Závěr
Imunochemické metody pro screening drog jsou metodami orientačními, které umožňují rychlé vytřídění pozitivních a negativních vzorků, a tím zkracují celkový čas analýzy. Protože mohou být ovlivněny řadou faktorů, je nutné, aby vyhodnocení prováděl zkušený odborník. Číselná hodnota výsledku je pouze kvalitativní jednotkou, která rozlišuje pozitivitu a negativitu a neodpovídá skutečné koncentraci drogy ve vzorku. Také každá laboratoř má jiné limity podle toho, s jakým typem imunochemické metody pracuje. Proto - aby nedošlo k nežádoucím omylům - nemá být toto číslo sdělováno lékaři. Pozitivní výsledky screeningu je nutné potvrdit a drogu přesně identifikovat metodami založenými na jiném principu, což jsou metody chromatografické. Odbornou klinickou interpretaci je nutné provádět ve spolupráci s lékařem a v souvislosti se zdravotním stavem pacienta.
Ing. Eva Nováková, CSc.e-mail: eva.novakova@lf1.cuni.czUniverzita Karlova v Praze, 1. LF UK a VFN, Ústav soudního lékařství a toxikologie
*
Literatura:
CONE, EJ., JENKINS, AJ. Saliva drug analysis. In WONG, SHY., SUNSHINE, I. (Eds). Handbook of analytical therapeutic drug monitoring and toxicology. CRC Press, 1997, p. 303-333.
**