RNDr. Eduard Kočárek, PhD., RNDr. Drahuše Novotná, Kamila Novotná, Michal Strnad, Radek Zapletal, prof. MUDr. Petr Goetz, CSc.
Univerzita Karlova v Praze, 2. LF a FN Motol, Ústav biologie a lékařské genetiky
Klíčová slova
chromosomální aberace • cytogenetika • mikrodeleční syndromy • hybridizace isitu • FISH
Roku 1959 byl popsán první patologický chromosomální nález – trisomie chromosomu 21 u pacienta s Downovým syndromem. Vývoj klinické cytogenetiky od té doby ukázal, že postižení spjatých se změnami chromosomů je daleko více, než se původně předpokládalo. Nemalý význam měl v tomto směru i rozvoj molekulární biologie, který klasickou cytogenetiku obohatil novými, citlivějšími metodickými přístupy. Proto je i dnes nedílnou součástí každého většího pracoviště lékařské genetiky cytogenetická laboratoř. Její pracovníci se zabývají diagnostikou chorob podmíněných chromosomálními aberacemi, tj. změnou počtu nebo struktury chromosomů.
Chromosomální aberace jsou zpravidla změnami, které přímo nebo nepřímo ovlivňují větší počet genů. To se projevuje zejména u numerických aberací (tj. změn počtu chromosomů), kdy je zmnožena, nebo naopak chybí celá sada genů na jednom nebo více chromosomech. V případě strukturálních změn jsou geny zpravidla deletovány, přerušeny, popř. fúzovány s jinými geny. U většiny aberací je tak zasažen větší počet genů, často i celý genový soubor na jednom chromosomu. Proto se u pacientů cytogenetické laboratoře většinou nevyskytuje jeden izolovaný defekt, ale mnohočetná postižení různých orgánových soustav. Chromosomální aberace mohou způsobit komplex těžkých postižení v různých lokalizacích a mnohočetné vývojové vady(1, 2, 3, 4). Z tohoto důvodu mají fenotypické projevy chromosomálních vad charakter syndromů. K nejnápadnějším a klinicky nejzávažnějším poruchám patří:
mentální nebo psychomotorická retardace,
poruchy vývoje centrální nervové soustavy,
skeletální anomálie,
růstová retardace,
deformity končetin a prstů včetně výskytu nadpočetných prstů,
poruchy reprodukce nebo úplná sterilita,
poruchy vývoje genitálu,
vrozené srdeční vady,
anomálie ledvin, trávicího ústrojí a dalších orgánů,
abnormální obličejové rysy – např. šikmé postavení očí, mikroftalmie, hypertelorismus, rozštěp rtu, popř. patra, gotické patro, vznik mikromandibuly, abnormální tvar a posazení ušních boltců,
poruchy nitroděložního vývoje plodu, spontánní potraty,
poruchy imunity,
zhoršení prognózy a extrémní zkrácení délky života,
dispozice k některým nádorovým onemocněním.
Chromosomy lze vyšetřovat v buňkách různých tkání. Nejjednodušší a nejčastější je kultivace lymfocytů získaných z periferní venózní krve. Ve tkáňové kultuře můžeme pro cytogenetické účely vypěstovat (a po určitou dobu přechovávat) např. buňky získané biopsií kostní dřeně, kůže, svalu, ovarií, resp. dalších orgánů(5, 6).
Velký význam mají rovněž prenatální vyšetření, která se provádějí při podezření na chromosomální aberaci u plodu. Nejčastěji vyšetřujeme buňky plodové vody odebrané amnio-centézou. Toto vyšetření se provádí zpravidla v 16. týdnu těhotenství. Méně častá jsou vyšetření buněk choria (biopsie choriových klků v 11. týdnu těhotenství) a fetální krve (kordocentéza od 20. týdne těhotenství). Vzácně a v odůvodněných případech lze analyzovat bioptický materiál z jiných tkání plodu nebo z placenty. O případném ukončení těhotenství je nutno rozhodnout do 24. týdne gravidity, proto musí být do této doby uzavřena všechna chromosomální (i ostatní prenatální) vyšetření(7). Různé fetální tkáně lze analyzovat také ze sekčního materiálu potracených plodů pro dodatečné stanovení diagnózy, popř. objasnění příčiny spontánního potratu.
Také u nádorových buněk jsou v mnoha případech diagnostikovány výrazné chromosomální aberace. Při nich jsou porušeny zejména geny ovlivňující buněčné dělení, diferenciaci buněk, apoptózu, replikaci a reparaci DNA. K nim řadíme zejména onkogeny, tumor supresorové geny (tzv. antionkogeny) a mutátorové geny. U některých nádorových onemocnění je známa korelace mezi druhem, popř. rozsahem chromosomální změny, prognózou onemocnění, popř. senzitivitou buněk k různým cytostatikům. V těchto případech lze výsledek cytogenetického vyšetření využít jako důležité diagnostické a prognostické kritérium(6). Proto se jako zvláštní obor vyvinula nádorová cytogenetika, též onkocytogenetika. Pro zjištění chromosomální konstituce nádorových buněk u hemoblastóz vyšetřujeme chromosomy, získané kultivací buněk kostní dřeně(6). V případě solidních nádorů lze kultivovat materiál po chirurgické excizi nebo přímo vyšetřovat nádorové buňky molekulárně cytogenetickými metodami (viz dále). O onkocytogenetické problematice blíže pojednává článek K. Michalové v tomto čísle časopisu.
Při odběru a během kultivace tkání je ve všech případech nutno dodržovat přísně sterilní podmínky a používat speciálně umyté nádoby a nástroje nebo sterilní pomůcky k jed-norázovému použití (zkumavky, injekční stříkačky, špičky k pipetám apod.). Vzhledem k možné infekci (zejména virovými chorobami) musí pracovníci v cytogenetických laboratořích důsledně dodržovat příslušná pravidla bezpečnosti práce(5).
===== Metody vizualizace chromosomů =====
Na Obr. 1 je znázorněn karyotyp lidské somatické buňky (lymfocytu periferní krve) v metafázi. V této fázi buněčného dělení jsou chromosomy nejlépe pozorovatelné a lze je dobře odlišit. Vizualizace chromosomů byla provedena tzv. G-pruhováním („G-banding”). Tato metoda se v klasické cytogenetice používá nejčastěji(6, 5). Spočívá ve speciálním postupu, při němž jsou chromosomy vystaveny krátkodobému působení trypsinu a pak obarveny roztokem Giemsa-Romanowski. Vyhodnocení se provádí pod světelným mikroskopem s využitím imerzního 100krát zvětšujícího objektivu. Na chromosomech jsou patrné nápadné příčné pruhy, jejichž počet a lokalizace jsou pro každý chromosom specifické. Tak je možné určit normální i abnormální chromosomy. Každý pruh má své konkrétní číslo, které vyplývá z mezinárodně platné cytogenetické nomenklatury. Toto označení slouží (zejména u strukturních změn) k přesné specifikaci těch částí chromosomů, kde došlo k aberaci. V molekulární genetice se čísla jednotlivých pruhů udávají k přesné lokalizaci genů na konkrétním chromosomu. S dalšími metodami vizualizace chromosomů seznamuje Tab. 1.
Ke stanovení strukturálních aberací malého rozsahu slouží technika HRT (z anglického „High Resolution Technique”). Spočívá ve zvláštním způsobu kultivace periferních lymfocytů, jenž umožňuje získat protáhlé prometafázické chromosomy. Na nich lze rozeznat i méně patrné strukturální změny, např. delece některých chromosomů(6).
Ke zjištění karyotypu se ve většině cytogenetických laboratoří používají počítače vybavené zvláštní kamerou připojenou k mikroskopu. Speciální počítačový program pak umožňuje rychlou analýzu mikroskopického obrazu, determinaci jednotlivých chromosomů a sestavení příslušného karyotypu(5).
Chromosomální nález a jeho interpretace
Normální lidský karyotyp (Obr. 1) je tvořen 46 chromosomy, tedy 23 páry chromosomů. Z nich 22 párů představují autosomy a jedním párem jsou zastoupeny tzv. pohlavní chromosomy neboli gonosomy. Ty se liší u obou pohlaví – u žen jsou přítomny dva chromosomy X, zatímco karyotyp muže obsahuje dva tvarově odlišné gonosomy – X a Y.
Z nápadného rozdílu v utváření chromosomů X a Y můžeme odvodit, proč existuje řada tzv. pohlavně vázaných (gonosomálně recesívních) chorob, které se manifestují u mužů, zatímco ženy jsou až na vzácné výjimky zdravými přenašečkami. Chromosom Y je ve srovnání s chromosomem X daleko menší, a obsahuje tedy také méně genů. Naprostá většina pohlavně vázaných genů je tedy přítomna pouze na chromosomu X. Pokud je některý z nich poškozen, nelze tuto vadu v mužských buňkách s konstitucí XY nijak kompenzovat. Prenatálním vyšetřením zaměřeným na určení pohlaví plodu lze gonosomálně recesívním chorobám velmi účinně předcházet(4).
V průběhu meiotického (redukčního) dělení, při němž vznikají pohlavní buňky, dochází k redukci diploidní sady chromosomů. Každá normální gameta obsahuje haploidní počet chromosomů – u člověka 23 (tj. 22 autosomů a 1 gonosom).
Během meiózy však může dojít k chybě při rozchodu některého páru chromosomů. Výsledkem této poruchy je vznik gamet, u nichž některý chromosom chybí nebo naopak přebývá. Tento proces nazývaný též nondisjunkce je nejčastější příčinou odchylek v počtu chromosomů – tzv. aneuploidií.
Nejznámější z aneuploidií je Downův syndrom, způsobený přítomností nadbytečného chromosomu 21. V karyotypu jsou tedy přítomny tři chromosomy 21 místo dvou, proto hovoříme o trisomii 21. chromosomu (Obr. 2). Pacienti s tímto syndromem jsou zpravidla hypotoničtí, mají nápadně okrouhlou tvář, hypertelorismus, epikanty a charakteristický mongoloidní směr očních štěrbin (podle něho byl syndrom dříve označován jako mongolismus). Zvětšený jazyk (makroglosie) způsobuje charakteristické poruchy řeči. Závažná je však zejména výrazná psychomotorická retardace (inteligence na úrovni imbecility nebo debility) a v polovině případů také výskyt vrozených srdečních vad, které mohou způsobit podstatné zkrácení délky života(3). Incidence Downova syndromu se udává 1/650 novorozenců(3). Dalšími známými aneuploidiemi autosomů jsou Patauův syndrom (trisomie chromosomu 13) a Edwardsův syndrom (trisomie chromosomu 18). Obě posledně jmenovaná postižení mají ve srovnání s Downovým syndromem daleko těžší klinický průběh a pacienti postižení mnohočetnými vývojovými vadami a malformacemi vnitřních orgánů zpravidla umírají brzy po narození(1, 2, 3).
Riziko chybného rozchodu chromosomů při vývoji vajíčka stoupá s věkem ženy, zvláště po 35. roce života. Tato závislost byla prokázána zejména u Downova syndromu. Proto je těhotným ženám ve stáří 35 a více roků navrhováno prenatální vyšetření(7).
Většina aneuploidií je však již v prenatálním období vývoje plodu letální, a proto je nacházíme pouze v sekčním materiálu ze spontánních abortů. Postnatálně je můžeme prokázat pouze v tzv. mozaikové formě. V tomto případě nacházíme aneuploidii jen u některých buněk pacienta, zatímco zbývající buňky mají normální karyotyp(4).
Příkladem onemocnění s častým výskytem mozaikových forem je Turnerův syndrom (též Ullrichův-Turnerův syndrom). Pacientkám s tímto syndromem chybí jeden chromosom X, mají tedy pouze 45 chromosomů. Hovoříme o tzv. monosomii chromosomu X. Ženy postižené Turnerovým syndromem jsou zpravidla sterilní, mají vrozenou srdeční vadu, nápadně malou postavu a často též nedokonale vyvinuté sekundární pohlavní znaky(1, 3). Většina plodů s tímto chromosomálním nálezem se samovolně potratí. U narozených děvčátek se pak v mnoha případech setkáváme s mozaikovými formami: vedle buněk s jedním chromosomem X jsou přítomny i jiné buněčné linie, např. normální buňky s dvěma chromosomy X(4).
Výjimkami nejsou ani případy monosomie X doprovázené v mozaice výskytem buněk s konstitucí XY, popř. buněk obsahujících jeden normální chromosom X a jeden strukturálně změněný chromosom X nebo Y. Případy mozaiky s výskytem chromosomu Y jsou klinicky velmi závažné, neboť u těchto pacientů zpravidla vzniká testikulární tkáň, v níž se vlivem chybné hormonální regulace (způsobené dysbalancí v počtu pohlavních chromosomů) mohou vytvořit nádorové buňky. Proto je v těchto případech nutná včasná operativní excize gonád(4). Chromosomální vyšetření tak může ve svých důsledcích zachránit pacientovi život. Několik příkladů z našeho souboru pacientek s Turnerovým syndromem a mozaikovým karyotypem představuje Obr. 3.
Druhou skupinou chromosomálních vad jsou strukturální aberace. Vznikají jako důsledek dvou nebo více chromosomálních zlomů a následným chybným spojením poškozených chromosomů nebo jejich částí. Ke strukturálním aberacím dochází de novo při meióze nebo vzácněji v postzygotickém období. Častým případem chromosomálních přestaveb jsou translokace, kdy dochází k přesunu části chromatidy jednoho chromosomu na jiný chromosom nebo k výměně genetického materiálu mezi dvěma a více různými chromosomy. Pokud vlivem zlomů nedojde k porušení nebo ztrátě některých genů, mluvíme o balancované translokaci, popř. obecněji balancované aberaci(1). V těchto případech má její nositel zpravidla zcela normální fenotyp. Aberace se však může po germinální linii předat dalším generacím a zde se vyskytnout v nebalancované formě (Obr. 4). Proto často bývá její existence zjištěna teprve poté, co v rodině dojde k většímu počtu spontánních potratů nebo se narodí postižené dítě s nebalancovanou aberací(4).
Translokační formy nacházíme také asi u 3 % pacientů s Downovým syndromem(3). Počet chromosomů je v těchto případech normální (46), ale třetí nadbytečný chromosom 21 je translokován na některý jiný akrocentrický chromosom (nejčastěji 13, 14 nebo 22), popř. fúzován s jiným chromosomem 21 (Obr. 5). Uvedený typ translokace, při němž dochází ke spojení dvou akrocentrických chromosomů v centromerické oblasti (za současné delece krátkých ramének se satelity), označujeme jako robertsonská translokace, popř. robertsonská fúze nebo centrická fúze. Rodiče těchto pacientů mohou být přenašeči balancované translokace (Obr. 6) a mají zvýšené riziko opakovaného porodu dítěte s translokační formou Downova syndromu(1). U rodičů s robertsonskou translokací dvou chromosomů 21 je toto riziko dokonce 100 %.
Klinicky závažné jsou také ztráty částí některých chromosomů neboli chromosomální delece. Poměrně časté jsou zejména tzv. mikrodeleční syndromy způsobené ztrátou velmi malých částí některých chromosomů. Tyto změny řadíme spolu s mikroduplikacemi a dalšími změnami mezi tzv. submikroskopické chromosomální aberace, neboť jsou běžným cytogenetickým vyšetřením (včetně HRT) zpravidla obtížně zjistitelné. K jejich vyšetření je nutné využít citlivějších metod vycházejících z poznatků molekulární biologie(8). Přehled některých submikroskopických aberací a jejich chromosomálních lokalizací uvádí Tab. 2.
===== Molekulární cytogenetika =====
Moderní molekulárně cytogenetické metody spojují přednosti cytogenetického a molekulárně biologického vyšetření. Umožňují zjištění přítomnosti chromosomů, popř. jejich částí nebo dokonce jednotlivých genů v různých materiálech bez nutnosti preparace chromosomů nebo izolace DNA. V mnoha případech je lze aplikovat i tehdy, když jsou k dispozici pouze buněčná jádra v interfázi (např. na spermiích, ve fixovaných histologických řezech apod.).
Z molekulárně cytogenetických metod má největší význam hybridizace in situ. Využívá tzv. sond, což jsou malé uměle připravené úseky DNA (vzácněji RNA), které jsou komplementární k určitým partiím chromosomální DNA. V současnosti se používají zejména sondy značené fluorescenčním barvivem. Hovoříme proto o metodě fluorescenční in situ hybridizace, zkráceně FISH(6, 5). Při tomto vyšetření se sonda po předchozí denaturaci váže (hybridizuje) k příslušným komplementárním partiím cílové DNA v chromosomu a její přítomnost se projeví při prohlídce fluorescenčním mikroskopem jako nápadný signál (Obr. 7, 8 a 9). Absence jednoho signálu znamená, že chromosom, popř. jeho určitý úsek, není přítomen. Tři signály místo dvou naopak prozrazují zpravidla trisomii daného chromosomu (Obr. 7). Vyšetření je velmi specifické a spolehlivé. Lze ho využít i při prenatální diagnostice nebo v onkocytogenetice, čímž odpadá složitá a dlouhodobá kultivace buněk(7).
Analýza FISH slouží také k identifikaci tzv. marker chromosomů. Tyto chromosomy (často velmi malé a nadpočetné) vznikají rozsáhlými delecemi, popř. dalšími strukturálními aberacemi jiných chromosomů(1). Jejich původ lze běžným cytogenetickým vyšetřením (které hodnotí pouze morfologii a pruhování) jen velmi obtížně zjistit. Obr. 8 dokumentuje výsledek molekulárně cytogenetického vyšetření stigmatizované pacientky s těžkou mentální retardací a častými křečemi. Klasickým chromosomálním vyšetřením byl zjištěn nadpočetný chromosom neznámého původu. Metodou FISH byl tento dysmorfický chromosom jasně identifikován jako duplikovaný fragment chromosomu 15 obsahující dvě centromery (dicentrický chromosom 15).
Dalším uplatněním metody FISH je detekce submikroskopických chromosomálních aberací. Příkladem může být diagnostika syndromu DiGeorge, jehož projevy jsou u naprosté většiny pacientů způsobeny mikrodelecí části dlouhých ramének chromosomu 22. Vzhledem k rozsáhlé fenotypické variabilitě se v některých novějších pramenech používá širšího označení syndrom delece 22q11 (deletion 22q11 syndrome; „22” je označení chromosomu, „q” je zkratka pro dlouhé raménko, „11” je číslo pruhu, který je deletován). Tento pojem zahrnuje kromě syndromu DiGeorge rovněž velokardiofaciální syndrom a další poruchy asociované s uvedenou chromosomální aberací(9). K nejzávažnějším symptomům mikrodelece 22q11 patří zejména vrozená srdeční vada a v mnoha případech také defekt imunity, neonatální hypokalcémie, hypoparaty-reoidismus, anomálie patra a psychické poruchy(8). Výskyt syndromu je poměrně častý – odhaduje se na 1/4000(8, 9). Mikrodeleci chromosomu 22 lze v současnosti spolehlivě prokázat metodou FISH použitím dvou lokus specifických sond značených různými barvivy (Obr. 9). Zelené signály kontrolní sondy jsou přítomny na obou chromosomech 22. Druhá červeně značená sonda hybridizuje s částí tzv. kritického regi-onu, který bývá u syndromu DiGeorge deletován. Nepřítom-nost červeného signálu na jednom chromosomu proto znamená, že v příslušné oblasti tohoto chromosomu došlo k deleci. Stejným způsobem lze vyšetřit i další mikrodeleční syndromy, sondy jsou v mnoha případech komerčně dostupné (Tab. 2).
Spektrum využití FISH je v současné době daleko širší. Aplikací tzv. malovacích sond (painting probes), kterými lze vizualizovat celé chromosomy, můžeme objasnit velmi složité strukturální aberace, zejména translokace (Obr. 10). To má význam zejména při vyšetření nádorových buněk, u nichž se vyskytují velmi komplikované chromosomální přestavby(6). Přehled nejužívanějších sond pro FISH podává Tab. 3.
Předností FISH je možnost detekce chromosomálních aberací i v nedělících se buněčných jádrech. To umožňuje např. rychlou prenatální diagnostiku s využitím nekultivovaných amniocytů. Velký význam má v současnosti také preimplantační vyšetření blastomer po fertilizaci in vitro(7). Podobně je možné vyšetřit také spermie a pólová tělíska oocytů před zamýšlenou fertilizací.
Další perspektivní molekulárně cytogenetickou metodou je PRINS (z anglického „primed in situ labelling”), občas též označovaná jako PCR in situ. Na rozdíl od FISH nevyužívá sond dlouhých několik set a více nukleotidů ale krátkých oligonukleotidových primerů, komplementárních k určité specifické sekvenci v genomu(10). Na začátku PRINS přidáváme do reakční směsi spolu s primery Taq DNA-polymerázu a nukleotidy, z nichž některé jsou označeny fluorescenčním barvivem nebo molekulou s antigenními vlastnostmi. Po hybridizaci primerů s cílovými sekvencemi navodíme podmínky pro syntézu DNA. Taq DNA-polymeráza pak k navázaným primerům připojuje podle pravidel komplementarity další nukleotidy včetně těch, které jsou značené. Tak dochází k syntéze sondy přímo na cílovém řetězci DNA. Takto získané signály se hodnotí stejným způsobem jako v případě FISH (pokud byl použit nukleotid značený antigenem, provádíme před mikroskopickou prohlídkou vizualizaci navázáním fluorescenčně značené protilátky). Metoda PRINS má podobné využití jako FISH, v některých případech je poněkud citlivější (lze jí např. odlišit centromerické oblasti chromosomů 13 a 21, jejichž sekvence v DNA jsou si velmi podobné). Předpokládá se i její využití v prenatální diagnostice(7), v některých případech je ji dokonce možné kombinovat s FISH(10). Určitou nevýhodou PRINS oproti FISH je větší náročnost na přístrojové vybavení a někdy také příliš slabé, popř. obtížně hodnotitelné signály.
Nejnovější aplikace metody FISH
Tzv. klasická FISH pracuje se sondami, které hybridizují s určitým chromosomem nebo jeho částí. Touto metodou lze však identifikovat nebo vyloučit pouze konkrétní chromosomální aberace, na jejichž výskyt máme podezření. Tak např. centromerickou sondou na chromosom X lze vyšetřit pouze aneuploidie tohoto chromosomu nebo strukturální aberace zahrnující jeho centromerickou oblast. U mnoha pacientů s poruchou vývoje genitálu nebo azoospermií je však afekce spojena s aberací jiných chromosomů (např. chromosomu Y) nebo se strukturní poruchou chromosomu X, která však není lokalizována v jeho centromerické oblasti. V tomto případě X- -centromerická sonda selhává a vzorky musíme pracně vyšetřovat dalšími sondami. Vyšetření se tak neúnosně dlouho protáhne. Podobně lokus-specifickou sondou na onkogen N-myc identifikujeme v nádorových buňkách pouze případnou amplifikaci tohoto onkogenu, ale nezjistíme změny jiných onkogenů, popř. delece tumor supresorových genů, které by se mohly u nádoru vyskytovat.
Z tohoto důvodu byly v druhé polovině 90. let 20. století vyvinuty nové molekulárně cytogenetické metody na bázi hybridizace in situ. Ty umožňují současnou identifikaci a lokalizaci chromosomálních aberací, aniž bychom předem museli vyšetření zacílit na konkrétní lokus, chromosom nebo omezenou skupinu 2–3 chromosomů. Nejvýznamnější z nich jsou vícebarevná FISH (multicolour FISH, m-FISH), spektrální karyotypizace (spectral karyotyping, SKY) a komparativní genomová hybridizace (comparative genomic hybridisation, CGH)(5, 6).
Metoda vícebarevné FISH (m-FISH) používá k detekci směs rozdílně značených malovacích sond. Každá malovací sonda hybridizuje s jiným chromosomem, takže lze na základě jediné hybridizace označit všech 24 lidských chromosomů. Odlišnost značení dosahujeme nejen použitím rozdílných fluorochromů, ale také jejich rozdílnou kombinací (např. sonda k chromosomu 1 je značena fluorochromem A, sonda k chromosomu 2 fluorochromem B a sonda na chromosom 3 kombinací fluorochromů A+B atd.). Tak lze pomocí 5 fluorescenčních barviv a jejich vzájemnými kombinacemi označit všechny chromosomy v lidském karyotypu(5, 6). Výsledky hybridizace je třeba vyhodnotit mikroskopem vybaveným alespoň šesti filtry, umožňujícími oddělené pozorování jednotlivých fluorochromů (šestý filtr slouží k identifikaci barviva použitého pro nespecifickou vizualizaci všech chromosomů – tzv. counterstaining, nejčastěji DAPI). Speciální počítačový program pak citlivě rozliší všechny barvy a barevné odstíny, které nejsou pouhým okem při mikroskopickém pozorování patrné. Metoda m-FISH se používá zejména při identifikaci a objasnění složitých chromosomálních translokací zahrnujících větší počet chromosomů. K nim dochází zejména u hemoblastóz, popř. i u dalších nádorových onemocnění. Pro m-FISH je však (stejně jako pro práci s jednotlivými malovacími sondami) nezbytně nutná kultivace buněk a získání dobře pozorovatelných mitóz. Metoda SKY je pouhou variantou m-FISH – k odlišení jednotlivých barviv však používá místo klasických filtrů spektrometru.
Na podobném principu jako m-FISH je založena metoda „multicolour banding”. Její podstatou je označení jednoho konkrétního chromosomu různě značenými sondami. Každá z nich hybridizuje s jinou částí chromosomu, takže hybridizační signály jednotlivých sond vytvářejí různobarevné příčné pruhy po celé délce chromatidy. Tak lze nejen poměrně citlivě determinovat, ale také lokalizovat delece, inverze, popř. jiné strukturální aberace konkrétního chromosomu.
Metoda CGH si rovněž našla své uplatnění především v onkogenetice(5, 6). Umožňuje zpracování DNA z jakýchkoliv tkání bez nároku na kultivaci. Její podstatou je „obrácená FISH”. Jako sondu v tomto případě používáme DNA izolovanou ze vzorku vyšetřované tkáně (zpravidla nádorové) a hodnotíme její hybridizaci s chromosomy normálního jedince. Na začátku vyšetření označíme vyšetřovanou DNA příslušným fluorochromem. Kromě toho připravíme jiný vzorek DNA, získaný ze zdravého člověka, a označíme jej jiným, zcela odlišným fluorochromem. Takto připravené „sondy” necháme společně hybridizovat s normálními chromosomy (tj. získanými ze zdravé osoby) na podložních sklech. Při závěrečném vyhodnocení by měly být všechny chromosomy rovnoměrně obarveny kombinací obou fluorescenčních barviv. Pokud na některém chromosomu jedna z barev převládá (tj. je zde buď víc nádorové, nebo normální DNA), lze usuzovat, že v této oblasti je vyšetřovaná nádorová DNA amplifikována (pokud převládá její fluorochrom), nebo naopak deletována (pokud převládá fluorochrom, jímž byla značena DNA ze zdravé osoby). Vzájemný poměr fluorescenčních barviv, resp. jimi označených sond se opět hodnotí speciálním počítačovým programem, který zvláště hodnotí barevnou denzitu každého fluorochromu(5). Metoda slouží k velmi citlivé identifikaci mikrodelecí nebo amplifikací genů u nádorových chorob, aniž bychom předem věděli, v které části genomu se příslušné chromosomální změny nachází(6). Určitým omezením CGH je skutečnost, že není schopna identifikovat reciproké chromosomální translokace, popř. jiné aberace, při nichž nedochází ke kvantitativním změnám chromosomálního materiálu (tedy v případech, kdy aberace není provázena delecí nebo amplifikací).
Podstatu CGH využívá nová perspektivní metoda označovaná jako „microarray”. V tomto případě hybridizujeme označené sondy z vyšetřované a normální DNA nikoliv s chromosomy, ale s velkým počtem malých úseků genomu (často reprezentujících jednotlivé geny nebo jejich části). Ty jsou ve formě nepatrných mikroskopických teček navázány na nevelké ploše podložního skla. Každý z těchto úseků zde má své přesné umístění v rámci mřížky. Tímto způsobem lze současně zjistit případné delece nebo amplifikace několika tisíc i více genů. Výsledky hybridizace se snímají speciálním skenerem a hodnotí pomocí citlivého počítačového softwaru. Kromě DNA lze podobným způsobem vyšetřovat také mRNA izolovanou z různých tkání a hodnotit tak transkripční aktivitu různých genů. Metoda microarray má tak daleko širší pole využití, které nyní přesahuje do mnoha dalších oborů. V zásadě lze říci, že již nejde o molekulárně cytogenetickou metodu, i když její význam pro cytogenetiku bude v budoucnosti nepochybný. Umožní nejen přesnou identifikaci delecí a amplifikací (a to i takových, které nejsou dostupnými molekulárně cytogenetickými metodami pro jejich malý rozsah zjistitelné), ale zejména stanovení jejich rozsahu. Tím zajisté posune dopředu poznání nejen v onkogenetice, ale přispěje také k přesné charakterizaci mikrodelečních syndromů. Její nevýhodou je prozatím značná finanční nákladnost. Blíže o metodě microarray viz článek R. Brdičky v tomto čísle. Přehled nejvýznamnějších cytogenetických a molekulárně cytogenetických metod uvádí Tab. 4.
Závěr
Článek shrnuje základní poznatky o metodách chromoso-málního vyšetření a jejich významu v klinické genetice. Současně upozorňuje na některé nejčastější syndromy způsobené změnou počtu nebo struktury chromosomů (tj. numerickými a strukturálními chromosomálními aberacemi). Pro klasické chromosomální vyšetření jsou nejvhodnějším materiálem lymfocyty periferní krve, jejichž kultivací získáváme metafázní chromosomy. Ty pak zpracováváme různými metodami, z nichž nejlepší a metodicky nejméně náročnou vizualizaci poskytuje G-pruhování (krátkodobé působení trypsinu s následným barvením roztokem Giemsa-Romanowski). Kromě periferní krve lze pro stanovení karyotypu zpracovat též další tkáně. Při prenatální diagnostice se nejčastěji uplatňuje amniocentéza v 16. týdnu gravidity, vzácněji biopsie choriových klků nebo kordocentéza. Normální lidský karyotyp obsahuje 46 chromosomů (22 párů autosomů a jeden pár gonosomů – XX u ženy nebo XY u muže). Změny jejich počtu (numerické aberace) vedou k vážným poruchám, které se projevují těžkým postižením psychomotorického vývoje (např. u Downova syndromu – trisomie chromosomu 21) a mnohočetnými malformacemi, jež mají za následek špatnou prognózu a brzké úmrtí postižených novorozenců (Edwardsův syndrom – trisomie 18, Patauův syndrom – trisomie 13). U některých syndromů jsou časté mozaikové formy – současný výskyt více buněčných klonů o rozdílném karyotypu u jednoho pacienta. Příkladem je Turnerův syndrom (v klasické formě monosomie X, často však v mozaice doprovázená jinými buněčnými klony – např. normální buněčnou linií se dvěma X). Pacientky s tímto syndromem jsou zpravidla sterilní a trpí vrozenou srdeční vadou. Ke strukturálním chromosomálním aberacím řadíme zejména translokace. Nositelé balancovaných translokací jsou zpravidla zdrávi a netrpí žádnými vrozenými vadami, ale mají zvýšené riziko narození postiženého dítěte s nebalancovanou aberací. To se projevuje i u asymptomatických přenašečů robertsonské translokace chromosomu 21 na jiný akrocentr, jejichž potomci mohou být postiženi translokační formou Downova syndromu. Velký klinický význam mají submikroskopické chromosomální aberace, k nimž řadíme především mikrodeleční syndromy. Jsou způsobeny delecí malé části některého chromosomu a lze je zpravidla vyšetřit jen molekulárně cytogenetickými metodami. K nejfrekventovanějším patří skupina syndromů podmíněná mikrodelecí chromosomu 22q11, jejichž nejznámějším zástupcem je syndrom DiGeorge.
Cytogenetika byla v průběhu minulých let výrazně obohacena molekulárně biologickými metodami, z nichž nejširší uplatnění na tomto poli nalezla hybridizace in situ. Ta využívá uměle připravených úseků DNA (tzv. sond), které jsou označeny nejčastěji fluorescenčním barvivem (tato modifikace je označována jako fluorescenční in situ hybridizace – zkráceně FISH). Sondy mohou být různých typů – centromerické, lokus-specifické nebo malovací. Výhodou hybridizace in situ je nejen poměrná rychlost, vysoká citlivost a možnost identifikace chromosomů neznámého původu (tzv. markerů), ale také schopnost chromosomální analýzy buněk v interfázi, což lze provést s využitím centromerických nebo lokus specifických sond. Tzv. malovací sondy slouží k objasnění složitých chromosomálních přestaveb, zejména translokací. V současnosti byly vyvinuty nové aplikace metody FISH, umožňující komplexní analýzu celého genomu, aniž by bylo nutné zacílit vyšetření na jednu konkrétní chromosomální aberaci. K nim patří zejména vícebarevná FISH (m-FISH), využívající rozdílně značené malovací sondy, a komparativní genomová hybridizace (CGH), která slouží zejména k detekci amplifikací a delecí u nádorových buněk. Velmi progresívní metodou je tzv. DNA- -microarray. Ta již využívá pouze izolované DNA a hybridizací s velkým počtem oligonukleotidových sond umožňuje velmi komplexní, poměrně rychlou a citlivou analýzu genomu.
===== Poděkování =====
V článku byly využity výsledky získané řešením grantových úkolů FRVŠ 2482/2002 G3, IGA NE 5685–3, IGA NE 6912–4, FRVŠ 1399/G3 a výzkumného záměru UK 2. LF č. 111300003.
Literatura
1. MANGE, EJ., MANGE, AP. Basic Human Genetics. 2nd ed., Sunderland : Sinauer Associates Inc., 1999, 530 p.
2. ŽIŽKA, J. Diagnostika syndromů a malformací. 1. vydání, Hradec Králové : Galén, 1994, 414 s.
3. WIEDEMANN, HR., KUNZE, J. Atlas klinických syndromů pro kliniku a praxi. 1. vydání (v českém překladu), Martin : Osveta, 1996, 684 s.
4. KOČÁREK, E., NOVOTNÁ, D. Chromosomální vyšetření v medicíně. Časopis lékařů českých, 2002, 141, s. 12–15.
5. ROONEY, DE. Human Cytogenetics: constitutional analysis. 3rd ed., New York : Oxford University Press Inc., 2001, 282 p.
6. MICHALOVÁ, K. Úvod do lidské cytogenetiky. 1. vydání, Brno : Institut pro další vzdělávání pracovníků ve zdravotnictví, 1999, 172 s.
7. HÁJEK, J., KULOVANÝ, E., MACEK, M. Základy prenatální diagnostiky. 1. vydání, Praha : Grada Publishing, 2000, 432 s.
8. KOČÁREK, E., KRUTÍLKOVÁ, V., PUCHMAJEROVÁ, A., et al. Vztah genotypu a fenotypu u pacientů s mikrodelecí chromosomu 22q11. Česko-slovenská Pediatrie, 2001, 56, s. 427–437.
9. LINDSAY, EA. Chromosomal microdeletions: Dissecting del22q11 syndrome. Nature Rewiews/Genetics, 2:2001, p. 858–868.
10. PELLESTOR, F., QUENESSON, I., et al. FISH and PRINS: A strategy for rapid chromosome screening: Application to the assessment of aneuploidy of human sperm. Cytogenet Cell Genet, 1996, 72, p. 34–36.
11. MAŘÍKOVÁ, T., MAŤOŠKA, V., KOČÁREK, E., et al. Genetická diagnostika neurologických chorob v ČR. Trendy v medicíně, 2002, 4, s. 105–114.
e-mail: eduard.kocarek@lfmotol.cuni.cz
Obr. 1 – Normální karyotyp člověka (muže)
Obr. 2 – Karyotyp pacienta s Downovým syndromem (obsahuje tři chromosomy 21)
Obr. 3 – Příklady některých chromosomálních nálezů u pacientek s Turnerovým syndromem – parciální karyotypy, obsahující pouze gonosomy. Karyotyp se třemi chromosomy X (47, XXX) se v případě Turnerova syndromu vyskytuje pouze v mozaice s monosomickými buňkami (45, X).
Obr. 4 – Balancované a nebalancované strukturální aberace. Jedinec s balancovanou chromosomální translokací (vlevo nahoře) vytváří gamety o čtyřech různých karyotypech, které po splynutí s normálními haploidními gametami dávají vzniknout čtyřem typům zygot. Z první zygoty zleva se vyvíjí plod s normálním karyotypem, ze čtvrté (poslední) vzniká nosič balancované translokace (zpravidla bez fenotypických příznaků stejně jako jeho rodič se stejnou aberací). Sestavy na druhém a třetím místě jsou nebalancované a vedou většinou k zániku embrya nebo narození postiženého dítěte.
Obr. 5 – Karyotyp pacienta s translokační formou Downova syndromu (chromosom 21 je translokován na chromosom 14)
Obr. 6 – Karyotyp přenašečky balancované robertsonské translokace (v karyotypu je přítomen pouze jeden volný chromosom 21, zatímco druhý je translokován na chromosom 14)
A
B
Obr. 7 – Molekulárně cytogenetické vyšetření Edwardsova syndromu (trisomie chromosomu 18) metodou FISH. Byla použita sonda, která hybridizuje s centromerickou oblastí chromosomu 18. Tři červené signály na mitóze (A) i interfázním jádře (B) jasně prokazují nález trisomie. Vyšetření lze provést i prenatálně na interfázních jádrech amniocytů.
Obr. 8 – Dicentrický chromosom 15 (označený šipkou) identifikovaný metodou FISH s využitím sondy, která hybridizuje s centromerickou oblastí chromosomu 15. Výsledek ukazuje, že tento nadpočetný marker chromosom obsahuje dvě centromery chromosomu 15 (dva výrazné hybridizační signály). Jde tedy o dicentrický chromosom vzniklý rozsáhlou delecí dvou chromosomů 15 a následným spojením jejich centrických fragmentů. Tento chromosomální nález byl zjištěn u čtyřleté pacientky s těžkou mentální retardací, hypotonií, křečemi a dalšími závažnými neurologickými příznaky.
Obr. 9 – Molekulárně cytogenetická diagnostika mikrodelece chromosomu 22 u syndromu DiGeorge. Kontrolní zeleně značená sonda je přítomna na obou chromosomech 22, červeně značená sonda hybridizuje pouze s jedním chromosomem 22, zatímco na druhém je příslušná kritická oblast deletována.
Obr. 10 – Vyšetření nebalancované translokace chromosomů 21 a X pomocí malovací sondy pro chromosom X. Žlutým signálem jsou označeny oba chromosomy X a navíc část chromosomu X, která je translokována na chromosom 21 (označen šipkou s popisem).
