Onoho dne roku 1928 si Fleming v laboratoři, kde zkoumal stafylokokové kmeny, všiml na několika miskách rozbujelé plísně a kolem ní jakýchsi „vyžraných“ ostrůvků. Dalšími pokusy zjistil, že tato „plísňová šťáva“ i velmi zředěná nezabíjí jen stafylokoky, ale i jiné mikroby a není jedovatá.
Když se ale po zkoušení na myších (i na kolegovi) snažil vyléčit hnisající ránu člověka, nepovedlo se. Fleming totiž z plísní vydělil jen nepříliš stabilní extrakt a nedokázal izolovat onu účinnou látku, kterou podle rodu plísně Penicillium nazval penicilin.
„Vyčistit“ penicilin se podařilo až v roce 1940 týmu vědců z Oxfordské univerzity pod vedením Ernsta Borise Chaina a Howarda Waltera Floreyho, kteří pět let nato dostali s Flemingem za tento objev Nobelovu cenu. Dalším problémem ale bylo vyvinout postup výroby penicilinu, na což se v Británii nenašly peníze, a tak Florey odjel hledat pomoc do USA.
Díky výzkumu americké vlády se tak mohl na podzim 1943 „superlék“ začít vyrábět a rok nato už léčil vojáky ve válce. V Československu se penicilin začal vyrábět v roce 1949 v Roztokách u Prahy.