Mikromanipulační techniky

30. 8. 2000 0:00

Mgr. Gabriela Tauwinklová

REPROMEDA, s. s r. o., Centrum asistované reprodukce, Brno

Klíčová slova:

reprodukční medicína • oplození in vitro • kultivace embrya • mikromanipulace

Laboratorní postupy spojené s odběrem, oplozením oocytů a kultivací embryí do období transferu jsou nejcitlivějším článkem v procesu umělého oplození. Gamety a raná embrya jsou extrémně senzitivní. Základem jejich úspěšné kultivace in-vitro je napodobení optimálních podmínek pro vývoj embryí při využití standardizovaných technologií a dodržení zásad sterility.

Kultivační prostředí

Důležitým faktorem ovlivňujícím vývoj embryí je kultivační prostředí. Kultivační box zajišťuje stálou teplotu 37 °C, složení plynné fáze s 5 % CO2 a nasycením vodní parou. I malé rozdíly v teplotě, pH nebo fyzikálních vlastnostech médií mají zhoubný vliv na výsledek IVF cyklu. Proto jakákoli manipulace s oocyty a embryi mimo kultivační systém musí být prováděna rychle a účelně. Všechen spotřební materiál užívaný při kultivaci – zkumavky, kultivační misky a média – je sterilní, jednorázový a musí být testován na embryotoxicitu.

Pro kultivaci využívá dnes většina pracovišť kompletní kultivační roztoky, které dodává několik světových výrobců. Složení různých kultivačních médií se může lišit. Obecně obsahují hydrogenkarbonátový pufr, základní anionty a kationty, energetické zdroje pro vývoj embrya, antibiotika, albumin. Důležitá je stabilita pH v rozmezí 7,2 až 7,4 a osmotická koncentrace asi 280 mmol/l při kalibraci média na 37 °C a nasycení CO2.

Příprava spermií v programu umělého oplození

Hodnocení spermiogramu

Spermiogram je základní andrologické vyšetření určující normu nebo stupeň narušení spermiogeneze. Kromě diagnostického významu při léčbě mužské infertility je v asistované reprodukci vodítkem pro volbu vhodné techniky umělého oplození.

Nejdůležitějšími funkčními parametry při hodnocení kvality ejakulátu z hlediska asistované reprodukce jsou koncentrace, motilita a zastoupení patologických forem spermií. Koncentrace a pohyblivost se hodnotí z nativního vzorku např. v Thomově nebo Bürkerově počítací komůrce. Morfologie se hodnotí v barveném nátěru. Kromě základních parametrů se sleduje přítomnost jiných buněčných elementů v ejakulátu a míra aglutinace spermií. Lze provést testy na spermatické protilátky nebo kultivaci ejakulátu.

Komplexní andrologické vyšetření by mělo obsahovat také biochemickou analýzu seminální plazmy k došetření funkce přídatných pohlavních žláz a hormonální vyšetření muže. Nebývá však v běžném spektru metod pro asistovanou reprodukci.

Pro standardizaci výsledků vyšetření spermiogramu vznikl WHO – Manual for Semen Analysis (1987, aktualizován 1992, 1999), který uvádí široký rozsah základních i specifických vyšetření a parametry normálního ejakulátu (4).

Normální hodnoty (dle WHO manuálu) – uvádíme pouze základní parametry důležité pro určení vhodného postupu při asistované koncepci (4):

Objem: 2 – 5 ml

pH: 7,2 – 7,8

Koncentrace spermií: 20×106/ml (a více)

Celkový počet spermií: 40×106/ml (a více)

Motilita: 50 % (a více) s pomalou

a rychlou progresivní motilitou

25 % (a více) s rychlou

progresivní motilitou

Morfologie: 30 % (a více) spermií normální stavby

Podíl živých spermií: 50 % (a více)

Leukocyty: Preparace ejakulátu pro techniky oplození in vitro

K oplození technikami IVF se za použití různých metod selektuje ze spermatu čistá kultura kapacitovaných spermií. Kapacitace je fyziologický proces probíhající in-vivo v ženském pohlavním ústrojí. V podmínkách in-vitro je nutné zbavit ejakulát seminální plazmy, která obsahuje dekapacitační faktory. Pro preparaci ejakulátu se v různých modifikacích obvykle používají dvě základní metody:

Swim-up je metoda založená na separaci spermií na základě jejich motility. Je vhodná pro zpracování ejakulátu dobré kvality s minimální příměsí nežádoucích buněk. Po spontánním zkapalnění se ejakulát mísí s promývacím médiem a opakovanou centrifugací se oddělí seminální plazma od sedimentu buněk. Peleta spermií se převrství kultivačním médiem. Vitální spermie migrují a kapacitují v kultivačním roztoku. Výtěžnost metody je vyšší než u gradientových metod, a proto je volena pro klasickou IVF, kdy je třeba k oplození vyššího počtu spermií.

Metoda centrifugace hustotního gradientu je používána pro vzorky semene se sníženými parametry, k přípravě spermií pro ICSI, případně ke zpracování materiálu získaného přímo z testes. Hustotní gradient se vytvoří vrstvením koloidních roztoků různé denzity. Ejakulát se navrství nad gradient. Během centrifugace buňky, včetně nezralých forem spermií, a ostatní částice spermatu sedimentují gradientem, dokud nedosáhnou rozhraní s vrstvou o vyšší hustotě. Zralé spermie mají nejvyšší denzitu a sedimentují do pelety na dno zkumavky. Sediment se resuspenduje v kultivačním médiu. Výsledkem je suspenze spermií o nižší koncentraci, než by byla získána metodou swim-up, ale prostá baktérií a balastních buněk.

Odběr oocytů, inseminace a kultivace raného embrya

Ultrastruktura oocytu

Zralý oocyt má organely většiny živočišných buněk, pouze neobsahuje drsné endoplazmatické retikulum a má velmi málo ribozomů. Na povrchu oocytu je zona pellucida – extracelulární plášť, který obklopuje savčí oocyt a rané embryo do doby implantace. Zprostředkovává iniciální děje oplození, především interakce se spermií, ale zřejmě slouží i k dalším funkcím. Například před kompaktací zabraňuje uvolňování adherentních blastomer z embrya během jeho transportu oviduktem nebo ektopické vazbě vyvíjejícího se embrya ve vejcovodu.

Pod zona pellucida zralého oocytu je perivitelinní prostor s 1. pólovým tělískem, které obsahuje zbývající chromozomy po I. meiotickém dělení. Kostru buňky tvoří systém aktinových mikrofilament a mikrotubulů. Pod plazmatickou membránou oocytu – oolemou se nacházejí unikátní organely oocytů – kortikální granula zabraňující polyspermii (6).

Zralost oocytu

Hormonální stimulace vyvolává produkci folikulů různé velikosti, které nejsou zcela synchronní ve svém vývoji. Počet a maturační status oocytů determinuje stimulační protokol, časování podání HCG, interval mezi injekcí HCG a punkcí vaječníků a samozřejmě individualita každé pacientky. V době odběru nacházíme oocyty ve třech maturačních stadiích. (Jaderné a cytoplazmatické děje jsou v souhře s měnícím se vzhledem kumulu folikulárních buněk obklopujících oocyt – Obr. 1):

GV oocyt (germinal vesicle) obsahuje velké jádro a bývá obklopen malým, kompaktním kumulem (Obr. 2).

M1 oocyt (metafáze I) po rozpadu jádra (GVBD = germinal vesicle breakdown) je chromatin organizovaný v chromozomech, nemá pólovou buňku, kumulus oocytu je expandující (Obr. 3).

M2 oocyt (metafáze II) je zralý, ovulační oocyt. Má vřeténko s chromozomy, vydělené 1. pólové tělísko v perivitelinním prostoru a expandovaný rosolovitý kumulus. V tomto stadiu oocyt setrvává do doby oplození.

Během dozrávání probíhá v oocytu řada morfologických změn: pod jeho povrchem vzrůstá počet kortikálních granul, bránících polyspermii, corona radiata nasedající v GV-stadiu těsně na oolemu se postupně stahuje nad zona pellucida, vazebná kapacita zona pellucida pro spermie se zvyšuje a vrcholí v M2-stadiu, kdy je oocyt připraven k fertilizaci (6).

Vyhledání a klasifikace oocytů

Folikulární tekutinu získanou punkcí ovarií prohlíží embryolog pod mikroskopem a vyhledává v ní oocyty. Oplachem v médiu dojde k odstranění folikulární tekutiny a krve. Hodnotí se předběžně zralost oocytů podle stupně expanze kumulární hmoty obklopující oocyt. Vyhledané a klasifikované oocyty jsou v kultivačních miskách nebo zkumavkách obsahujících kultivační médium umístěny na dobu 2 až 6 hodin do inkubátoru, aby proběhla synchronizace zrání oocytů před inseminací.

Inseminace oocytů

Určení způsobu inseminace oocytů vyžaduje komplexní zhodnocení anamnestických údajů, faktorů neplodnosti, výsledků fertilizace v předchozích cyklech, aktuálních hodnot spermiogramu a počtu a kvality oocytů.

Standardní (klasická) in-vitro fertilizace

V případě vyhovujících podmínek pro klasickou kultivaci se oocyty inseminují společnou inkubací s kapacitovanými spermiemi v kultivačním médiu přes noc. Alternativní metodou je krátkodobá expozice oocytů spermiemi na dobu 1 hodiny. Použitím tohoto způsobu oplození bylo dosaženo vyššího podílu embryí s vynikajícím skóre kvality a vyššího pregnancy rate (2).

Intracytoplazmatická injekce spermie

Mikromanipulační aplikace jedné spermie do oocytu (viz Mikromanipulační techniky).

Fertilizace

K fúzi s oocytem musí spermie podstoupit kapacitaci a úplnou akrozomální reakci. Spermie za pomoci hyperaktivní motility získává schopnost penetrovat vaječné obaly, cumulus oophorus, zona pellucida a vstoupit do perivitelinního prostoru oocytu. Plazmatické membrány spermie a vajíčka fúzují a jádro spermie expanduje do cytoplazmy oocytu ve formě samčího pronukleu. Zároveň s fúzí dokončuje oocyt II. meiotické dělení a zbytek mateřských chromozomů je vypuzen do perivitelinního prostoru jako II. pólové tělísko, zatímco chromozomy v cytoplazmě formují samičí pronukleus. Po fúzi kortikální granula pod oolemou uvolňují svůj obsah do perivitelinního prostoru a interakcí s glykoproteiny zony dochází k jejímu chemickému zpevnění, což působí jako bariéra vstupu nadpočetných spermií do oplozeného oocytu. Po formaci pronukleů, 12 až 16 hodin po fertilizaci, migrují prvojádra do středu oocytu, ale nefúzují (Obr. 4). Syngamií jader, asi 20 hodin po inseminaci in-vitro, fertilizace vrcholí (6).

Hodnocení oplození

14 až 20 hodin po inseminaci hodnotíme fertilizaci oocytů. Oocyty se mechanicky čistí denudační pipetou od zbytků kumulárních buněk. Kontrolujeme přežívání spermií v inseminačním médiu, počet spermií v zona pellucida oocytů, zralost oocytů a přítomnost prvojader v cytoplazmě oocytu. Za regulérně oplozené se považují oocyty se dvěma prvojádry a vyděleným 2. pólovým tělískem. V případě, že do vajíčka vnikne více než jedna spermie, což je signalizováno přítomností více než dvou prvojader v cytoplazmě, se jedná o polyspermii. Důvodem je nejčastěji příliš časná inseminace oocytů spermiemi (není ukončena migrace kortikálních granul pod zona pellucida).

Preimplantační vývoj embrya

Preimplantační vývoj je charakteristický buněčnou proliferací bez výrazného buněčného růstu = reduktivní dělení. Objem embrya tak zůstává konstantní od jednobuněčného stadia až do stadia rané blastocysty. K prvnímu dělení = rýhování do dvou buněk dochází 24 až 28 hodin po inseminaci (Obr. 5). Od dvoubuněčného stadia je rýhování asynchronní. Délka jednoho buněčného cyklu je 12 až 20 hodin, podobně jako u mnoha somatických buněk. Během prvních dvou buněčných cyklů embryo podstupuje kritický maternálně-zygotický přechod.

Do osmibuněčného stadia (Obr. 7) jsou blastomery zřetelné a snadno rozlišitelné. Vícebuněčné embryo se dále nazývá morula. V tomto stadiu začíná proces kompaktace, který způsobuje tvorba spojení mezi individuálními blastomerami.

Přibližně 90 hodin po inseminaci, v asi 32buněčném stadiu, dorůstá embryo do stadia rané blastocysty (Obr. 8), které je charakterizováno vznikem kavity, zvané blastocoel, vyplněné tekutinou. U blastocysty dochází k první diferenciaci na dva typy buněk: Vnitřní buňky inner cell mass (ICM) dávají vznik vlastnímu embryu. Diferencované buňky trofektodermu tvoří transportní epitelium zodpovědné za akumulaci tekutiny v blastocoelu. Hromadění tekutiny vede ke zvýšení objemu blastocysty (Obr. 9).

Posledním dějem preimplantačního vývoje embrya před jeho implantací je spontánní hatching blastocysty ( = opuštění zona pellucida 5. až 6. den po oplození) umožňující kontakt trofektodermu a endometria.

Raná stadia rýhování probíhají in vivo ve vejcovodu. Embryo se dostává do dělohy přibližně 4. až 6. den po oplození, ve stadiu asi 16buněčné moruly nebo již blastocysty.

Hodnocení kvality embryí in vitro

V podmínkách in vitro je jako jeden z parametrů určujících kvalitu embrya hodnocena jeho morfologie. Řada autorů uvádí vyšší implantaci u embryí s výborným stupněm kvality (3, 9). Sleduje se především počet, velikost a pravidelnost blastomer, množství a distribuce cytoplazmatických fragmentů, cytoplazmatické defekty.

Důležitým predikčním parametrem viability embrya je rychlost rýhování. Transferem embryí s raným rýhováním (dosahujících dvoubuněčného stadia 25 hodin po inseminaci) lze docílit dvojnásobného zvýšení pregnancy rate oproti transferu embryí, které časné rýhování nevykazují (7). Při kultivaci proto selektujeme a pro transfer preferujeme embrya s dobrou dynamikou vývoje, u nichž je nejvyšší záruka, že všechny biologické a biochemické děje probíhají bezchybně.

Kultivační podmínky pro vývoj blastocysty in-vitro

U dříve používaných kultivačních systémů někdy docházelo k zástavě růstu embryí, nejčastěji ve stadiu aktivace genomu. Běžná kultivace embrya tedy trvala 48, maximálně 72 hodin. Jako dočasná technologie k dosažení vyšších vývojových stadií byla využívána kokultivace embryí, nejčastěji na Vero buňkách. Působením kokultivačních buněk docházelo k částečnému odstraňování toxických komponent z média a současně k vytváření metabolického spádu dodáním některých růstových faktorů nutných pro vývoj embryí (5).

Pokrok v technologiích kultivačních médií vedl k vývoji sekvenčního kultivačního systému (dr. Gardner, Colorado Center for Reproductive Medicine), který umožňuje prodloužit růst embrya in-vitro z klasické 2 – 3denní kultivace na 5 až 6 dnů do stadia blastocysty.

Systém se skládá z několika druhů specializovaných médií rozdílného složení, vhodných jen pro kultivaci embrya určitého vývojového stupně. Tak jsou respektovány různé nutriční nároky embrya během jeho vývoje a růst embrya se fyziologicky synchronizuje.

Na média určená k oplachu oocytů po odběru, jejich dozrání před inseminací, k oplození a kultivaci embrya prvních 48 hodin, navazují roztoky na prodlouženou kultivaci. Médium určené ke kultivaci embrya 48 až 72 hodin po oplození obsahuje stejné hladiny výživných látek, jako jsou obsaženy ve vejcovodech, a neesenciální aminokyseliny a glutamin ke stimulaci rýhování. Médium pro kultivaci embrya, od 8 buněk až do stadia blastocysty (72 až 120 hodin), je založeno na takovém obsahu hladin glycidů jako v děloze a obsahuje esenciální i neesenciální aminokyseliny k povzbuzení vývoje blastocysty a procesu diferenciace.

Výhody prodloužené kultivace do stadia blastocysty

1. Umožňuje překlenout dobu projevení se vývojového bloku mezi 4 až 8 buněčným stadiem a vybrat vitální embrya k transferu.

2. Deselektuje embrya s nízkým růstovým potenciálem (geneticky defektní embrya a embrya s abnormálním paternálním genomem po ICSI).

3. Napodobuje fyziologické podmínky transferem blastocyst do dělohy (embryo se dostává do dutiny děložní ve stejném vývojovém stadiu jako v přirozeném cyklu).

4. Poskytuje čas k obnově a umožňuje sledovat další dynamiku vývoje rozmražených embryí (kryokonzervovaných v pronukleárním stadiu nebo ve stadiu prvního rýhování).

5. Napomáhá v reparačním procesu po mikromanipulačních procedurách (ICSI, AH, biopsie).

6. Redukuje časový interval mezi dalším embryonálním růstem a implantací po transferu do dělohy, a tím i vliv nežádoucích faktorů na embryomaternální dialog (1).

Mikromanipulační techniky

Mikromanipulační metody se provádějí pomocí mikroskopu vybaveného speciálními ovládacími prvky pro manipulaci s gametami. Zahrnují techniky mikroinseminace oocytu především u andrologických faktorů sterility, operace na povrchu embrya s cílem zvýšit šanci na nidaci, metody odběru buněčného materiálu ke genetické diagnostice a některé další doplňkové techniky.

Intracytoplazmatická injekce

spermie do oocytu – ICSI

Jedná se o metodu, při které je jediná mechanicky imobilizovaná spermie zavedena pomocí mikromanipulační pipety přímo do cytoplazmy oocytu. Technika ICSI (Intracytoplasmic Sperm Injection – Obr. 10, poprvé Palermo, 1992) zcela vytěsnila dříve používané, méně efektivní metody parciální disekce zony (PZD) = narušení obalu oocytu před klasickou inseminací a subzonální inseminaci (SUZI) = mechanický přenos 3 až 8 motilních spermií do perivitelinního prostoru oocytu, kdy k dosažení fúze s oolemou bylo třeba vitální spermie. Dnes je již ICSI běžnou technikou rutinně prováděnou ve většině embryologických laboratoří po celém světě.

Indikace:

1. Těžká oligospermie, asthenozoospermie nebo teratozoospermie u partnera.

2. Případy, kdy nelze získat ejakulované spermie:

– spermie nejsou v ejakulátu přítomny, ale mohou být získány testikulární nebo epididymální extrakcí,

– dysfunkce ejakulace,

– retrográdní ejakulace.

3. Dysfunkce akrozomu spermií.

4. Maligní onemocnění (po terapii dochází k nezvratné poruše spermatogeneze; proto je před léčbou nutné založit kryobanku spermií a po léčbě v cyklu umělého oplození k ICSI využít rozmražený materiál).

5. Imunologická sterilita (při zjištění zvýšených koncentrací antizonálních, antispermoidálních, antifosfolipidových protilátek v krvi).

6. Selhání klasické IVF (nevysvětlené narušení interakce gamet = oocyty nefertilizují ani při kvalitním spermiogramu partnera). Další postup:

– v tomtéž cyklu – 24 hodin po klasické IVF opakovat inseminaci pomocí ICSI,

– v následujícím IVF cyklu primárně indikovat ICSI.

7. Nízký počet získaných oocytů u pacientek (low responders).

8. Oocytární faktor (nízký počet oocytů špatné kvality).

9. Infekce ejakulátu baktériemi (není žádoucí oocyty vystavit v inseminačním médiu kontaktu se spermiemi, a tudíž riziku kontaminace).

Asistovaný hatching – AH

Technika prováděná na narýhovaném 2 – 3denním embryu většinou těsně před transferem do dělohy. Narušením zona pellucida embrya usnadňuje pozdější spontánní hatching výstup blastocysty ven ze zóny.

Indikace:

1. Věk pacientky nad 35 let, kdy může být snížena produkce lytických enzymů, které se podílejí na spontánním hatchingu embrya.

2. Transfer rozmražených embryí, u kterých vlivem kryoprotektiva a procesu kryokonzervace dochází k efektu zone hardening.

3. Opakovaný transfer u pacientek, které absolvovaly 2 embryotransfery kvalitních embryí bez efektu gravidity.

4. Transfer embryí s nadměrně silnou zónou.

Způsoby provedení:

1. Partial zone disection (PZD) = mechanické otevření zona pellucida skleněnou mikromanipulační jehlou (Cohen a kol.) (Obr. 11).

2. Zone drilling (ZD) = vytvoření otvoru v zóně chemicky – působením kyselého Tyrodova roztoku (Gordon a Talansky).

3. Laser assisted hatching = narušení obalu embrya laserovým infračerveným paprskem.

4. Enzymatické odstranění zona pellucida (Obr. 12) se provádí u blastocyst těsně před transferem. Oplachem v roztoku enzymu (Pronasy) lze šetrně odmýt celou zonu. Metoda eliminuje riziko kolapsu blastocysty z důvodu nadměrné pevnosti zony. Transfer zone free blastocyst rovněž podporuje přímý kontakt trofektodermu blastocysty s endometriem.

Mikromanipulace na rozmražených (nebo fragmentujících) embryích

U embryí částečně poškozených během procesu rozmražování lze provést odstranění lyzátu z rozpadlých blastomer odsátím mikromanipulační pipetou. Podobně u fragmentujících embryí je možné odsávat vznikající buněčné fragmenty. Jedná se však o metody méně používané.

Mražení spermií v prázdné zona pellucida

Ve speciálních případech je třeba kryokonzervací uchovat ojedinělé spermie muže s těžkou poruchou spermatogeneze, případně spermie získané technikami odběru z varlat. Při klasickém postupu kryokonzervace se ve velkém objemu kryoprotektiva nízký počet spermií rozptýlí a šance na jejich nalezení po rozmražení je minimální. Proto je vhodné mikromanipulací injikovat několik motilních spermií do prázdné zona pellucida (získané například odstraněním cytoplazmy z neoplozeného oocytu). Ta slouží jako schránka na nízký počet vzácných spermií, který v těchto případech máme k dispozici.

Biopsie embrya a pólové buňky oocytu

pro preimplantační diagnostiku

Jde o metody získání materiálu pro preimplantační diagnostiku – nejčasnější formu prenatální diagnostiky. Biopsií se získává u oocytů 1. nebo 2. pólové tělísko, u třídenního embrya 1 až 2 blastomery (Obr. 13). Z blastocysty se odebírá obvykle 10 až 30 buněk trofoblastu.

Odebrané buňky jsou podrobeny analýze DNA. K preimplantační diagnostice se užívá techniky PCR ( = polymerase chain reaction) k analýze monogenně dědičných chorob, jako jsou cystická fibróza, Ducheneova svalová dystrofie nebo syndrom fragilního chromozomu X, atd. Metody FISH ( = Fluorescent in Situ Hybridization) se používá hlavně k sexování preimplantačních embryí pro riziko chorob vázaných na pohlaví, ale lze ji aplikovat i na screening aneuploidie a dědičných translokací.

Nukleární transfer a transfer cytoplazmy lidského oocytu

Toto jsou mikromanipulační metody, které jsou v humánní medicíně vyvinuty v experimentální rovině a jejichž dopad je zatím v centru vědeckého zkoumání. Zamýšlené využití je v programu dárcovství oocytů v případech infertility, kdy jsou produkovány oocyty s insuficiencí ooplazmických faktorů.

Transfer cytoplazmy z dárcovského oocytu mladé ženy do oocytu pacientky vyššího věku má zlepšit kvalitu a fertilizační potenciál vajíčka příjemkyně při zachování většiny její genetické informace.

Princip metody transferu jádra oocytu příjemkyně do darovaného, enukleovaného oocytárního cytoblastu by v budoucnu navíc mohl být eventuálně využit v oblasti humánního klonování (8).

Závěr

Rozvoj embryologie v oblasti asistované reprodukce je velmi dynamický. Dnes je díky intracytoplazmatické injekci spermie do oocytu a operačním metodám odběru spermií přímo z testikulární tkáně v podstatě vyřešen problém andrologické sterility. Nevídaným způsobem se zvýšila úspěšnost umělého oplození díky transferu selektovaných embryí vyšších vývojových stadií. Těžiště výzkumu se přenáší do oblasti molekulární genetiky. Metody vedoucí k určení pohlaví a odhalení chromozomálních abnormalit a některých chorob již ve stadiu preimplantačního embrya existují a jsou čím dál více využívány. Jednou z perspektiv embryologie do budoucna je určení a možná i reparace konkrétních genů.

Literatura

1. Bongso A.: Handbook on blastocyst culture, Sydney Press Indusprint, Singapore, 1999

2. Dirnfeld M., Bider D., Koifman M., Calderon I., Abramovici H.: Shortened exposure of oocytes to spermatozoa improves in-vitro fertilization outcome: a prospective, randomized, controlled trial; Hum. Reprod. 1999; 14: 2562-2564

3. Giorgetti C., Terriou P., Auquier P., Hans E., Spoch J. L., Salzmann J., Roulier R.: Embryo score to predict implantation after in-vitro fertilization: based on 957 single embryo transfers; Hum. Reprod. 1995, 10: 2427-2431

4. Kubíček V.: Spermiologické vyšetření; III. Andrologické sympózium ČUS, Andrologie, 1999

5. Menezo Y., Dumont M., Hazout A., Nicollet B., Pouly J. L., Janny L.: Culture and co-culture techniques, In: Fertility and sterility: A Current Overview:Proceedings of the 15th World Congress on Fertility and sterility, Montpellier, France, Edited by Hedon B., Bringer J., Mares P., Parthenon Publishing Group, London, 1995: 413-418

6. Sathananthan H., Soon-Chye Ng, Brongso A., Trounson A., Ratnam S.: Visual Atlas of Early Human Development for Assisted Reproductive Technology; Singapore, 1993

7. Shoukir J., Campana A., Farley T., Sakkas D.: Early cleavage of in-vitro fertilized human embryos to the 2-cell stage: a novel indicator of the embryo quality and viability; Hum. Reprod. 1997, 12: 1531-1536

8. Tesarik J., Nagy Z. P., Mendoza C., Greco E.: Chemically and mechanically induced membrane fusion: nonactivating methods for nuclear transfer in mature human oocytes; Hum. Reprod. 2000; 15: 1149-1154

9. Ziebe S., Petersen K., Lindenberg S., Andersen A. G., Gabrielsen A., Andersen A. N.: Embryo morfology or cleavage stage: how to select the best embryos for transfer after in-vitro fertilization; Hum. Reprod., 1997, 12: 1545-1549

e-mail: repromeda.ivf@seznam.cz