MUDr. Lenka Dvořáková, CSc., MUDr. Martin Hřebíček, prof. MUDr. Milan Elleder, DrSc.
Univerzita Karlova v Praze, 1. LF a VFN, Ústav dědičných metabolických poruch
Klíčová slova
lidský genom • monogenní nemoci • polygenní nemoci • analýza genotypu • mutace • mutační analýza • prenatální diagnostika
Co je molekulárně genetická diagnostika
Výchozím bodem pro objasnění podstaty dědičného onemocnění je identifikace genů podmiňujících onemocnění a studium změn ve struktuře těchto genů u pacientů – analýza mutací.
Lidský genom, jehož analýza byla v hrubých rysech v minulém roce dokončena, je tvořen přibližně 3 miliardami nukleotidů a obsahuje přibližně 30 000 genů. Úseky kódující proteiny tvoří jen asi 1,1–1,4 % této informace. Význam změn ve struktuře jak kódujících, tak nekódujících oblastí DNA na funkci buňky i organismu z valné části teprve čeká na objasnění. Už dnes je ale zřejmé, že v lidském genomu existuje řada míst, ve kterých dochází ke změnám nukleotidové sekvence, aniž by se takováto změna projevila na zdravotním stavu jedince. K takovým změnám patří nukleotidové záměny (SNPs – single nucleotide polymorphisms, polymorfismy jednoho nukleotidu), kterých dnes známe 300 000, vypuštění (delece) nebo naopak včlenění (inzerce) nukleotidové sekvence. Na druhou stranu je nepochybné, že i záměna jednoho jediného nukleotidu v určitém místě genomu může způsobit závažné neléčitelné onemocnění. Velké změny v genomu lze studovat cytogenetickými metodami. Analýzou změn rozsahem příliš malých pro cytogenetické vyšetření a studiem vlivu těchto změn na zdravotní stav člověka se zabývá molekulární genetika, respektive molekulární medicína. Molekulární diagnostika, tj. analýza mutací v genech asociovaných s genetickými chorobami se dnes již stává běžnou součástí zdravotní péče. Následující text se snaží shrnout základní přístupy a přínos i omezení těchto vyšetření s důrazem na monogenní onemocnění.
Klasifikace genetických onemocnění
Podle rozsahu změn v genomu lze genetická onemocnění rozdělit do tří skupin:
Genomová onemocnění souvisí s nesprávnou segregací chromosomů v průběhu meiózy nebo mitózy a vedou k chybnému počtu chromosomů v buňce (aneuploidie). Asi nejznámějším onemocněním tohoto typu je Downův syndrom způsobený trisomií 21. chromosomu.
Chromosomální onemocněníjsou způsobena změnou struktury části chromosomu nebo chromosomů. K takovým změnám patří např. duplikace, delece či inzerce části chromosomu. Fenotypově se chromosomální onemocnění často projevují prenatálně i postnatálně závažnými malformacemi a mentální retardací.
Genomové a chromosomální změny ovlivňují dávky mnoha genů a způsobují tak velmi závažné fenotypové projevy. Přestože frekvence výskytu těchto poruch je značná (jedno ze sta buněčných dělení pro genomové mutace a 6 z 10 000 buněčných dělení pro chromosomální mutace), jsou málokdy přenášeny na další generaci, protože jsou obvykle neslučitelné s přežitím a schopností normální reprodukce.
Genová onemocnění jsou způsobena změnami sekvence DNA v jednotlivých genech. Změny mohou být tak malé, že se týkají jediného nukleotidu, nebo tak velké, že postihují několik tisíc nukleotidů, ale vždy jsou rozsahem příliš malé na to, aby byly rozpoznány cytogenetickými metodami. Naprostá většina dědičných onemocnění je způsobena mutacemi genovými, jejichž studium náleží metodicky do oblasti molekulární genetiky.
Onemocnění vycházející z postižení jednotlivých genů (genová onemocnění) se v učebnicích často dělí na monogenní a komplexní (polygenní) nemoci. Zvláštní skupinu tvoří onemocnění s maternální dědičností, která jsou způsobena mutacemi v mitochondriálním genomu a kterým je v tomto sborníku věnována samostatná kapitola. U monogenních nemocí je jasný hlavní efekt jediného genu (např. cystická fibróza), zatímco u komplexních onemocnění je výsledný fenotyp ovlivňován několika lokusy, z nichž žádný není dominantní (diabetes, astma, rakovina nebo některá duševní onemocnění). Hranice mezi těmito dvěma skupinami není ostrá. Existují onemocnění, kde kromě dominantního vlivu jednoho genu (podobně jako u monogeních nemocí) působí na fenotyp významně i další geny. Na konečném souhrnu projevů nemoci a vnímavosti pacienta ke genetické chorobě se vždy podílí i prostředí. Z toho vyplývá, že i nemoc způsobená mutací v jednom genu může mít u různých pacientů různé projevy, a naopak obdobný nebo stejný fenotyp může mít u dvou pacientů odlišnou genetickou podstatu.
Přes neostrou hranici mezi monogenními a komplexními nemocemi zůstává pro lékařskou genetiku koncept monogenních nemocí stále užitečný a označuje onemocnění, u kterých má dominantní vliv na fenotyp pouze jeden gen. Monogenní nemoci se dělí do tří skupin. U autosomálně dominantních nemocí stačí k manifestaci nemoci jedna mutovaná alela, nemoc se projeví u homozygota i u heterozygota. Pro autosomálně recesívní nemoci platí, že obě alely musí nést patogenní mutaci, aby nemoc byla manifestována. To znamená, že jedna zdravá alela stačí ke kompenzaci genového defektu. Gonosomálně recesívní nemoci jsou podmíněny genem lokalizovaným na X-chromosomu. Muži, nesoucí jediný X-chromosom, nemohou v případě mutace poruchu kompenzovat a nemoc se u nich téměř bez výjimek projeví (hemizygotní stav). Ženy nesoucí dva chromosomy X mají obvykle podstatně mírnější formu onemocnění nebo jsou asymptomatické. Fenotyp může výrazně ovlivnit inaktivace X-chromosomu (viz níže).
Analýza genotypu je dnes standardní praxí u monogenních nemocí, nazývaných také onemocnění s mendelovskou dědičností. Takových nemocí se známým genem, v němž je možné vyšetřovat mutace, je dnes publikováno přes 1300. Celková frekvence monogenních nemocí je zhruba 1 % (na 10 000 porodů připadá 70 dětí s onemocněním s autosomálně dominantním typem dědičnosti, 25 dětí má poruchu s autosomálně recesívním a 4 děti poruchu s gonosomálně recesívním typem dědičnosti.
Komplexní nemoci jsou zatím spíše předmětem základního výzkumu a příspěvek genetického vyšetření pro praktické využití v lékařství je zatím velmi malý.
Inaktivace chromosomu X, uniparentální
disomie, imprinting a mozaicismus
Kromě samotné mutace se v některých případech na manifestaci nemoci podílejí i další faktory, které přesahují rámec mendelovské dědičnosti a jejichž základem je nerovnováha alel:
Inaktivace chromosomu X. U embrya savců ženského pohlaví dochází k inaktivaci jednoho ze dvou chromosomů X. Tento proces zajišťuje pro geny nacházející se na chromosomu X v samičích buňkách (XX) stejnou genovou dávku jako v samčích buňkách (XY). Během tohoto procesu je náhodně vybrán jeden ze dvou X chromosomů a tento chromosom je inaktivován doposud ne zcela probádaným mechanismem. Inaktivovaný X chromosom se udržuje v kondenzovaném, transkripčně neaktivním stavu po celou dobu života buňky a i chromosomy vzniklé jeho replikací si udržují tento stav. Dělením a diferenciací buňky, ve které došlo k inaktivaci jednoho z X chromosomů, tak vzniká buněčná populace se stejným aktivním X chromosomem (paternálním či maternálním). Přestože je X-inaktivace náhodný proces, poměr maternálních a paternálních inaktivovaných alel bývá často posunut ve prospěch jedné z alel. U žen, které jsou přenašečkami pro gonosomálně recesívní onemocnění, přednostní inaktivace nemutovaného chromosomu X může mít za následek závažnější projevy onemocnění, které v extrémním případě mohou být srovnatelné s onemocněním u hemizygotních mužů. Je to dáno tím, že v případě mutace genu lokalizovaného na chromosomu X představuje organismus ženy mozaiku složenou z postižených a nepostižených okrsků tkáně podle toho, zda je inaktivován chromosom X nesoucí mutovanou nebo funkční alelu. Ženy s gonosomálně recesívním onemocněním jsou tedy mozaikovými hemizygoty.
Imprinting. Důsledkem imprintingu je rozdílná exprese genu pocházejícího od matky a od otce. U některého imprintovaného genu probíhá transkripce pouze maternální alely, zatímco paternální alela je inaktivována, u jiného imprintovaného genu je tomu naopak. Mutace se projeví jen v případě, že je lokalizovaná na aktivní alele. V dnešní době je u člověka známo 60–100 genů, u kterých se imprinting uplatňuje. Asi nejlépe prostudovaná onemocnění spojená s jevem imprintingu jsou Praderův-Williho a Angelmanův syndrom. Praderův-Williho syndrom je zhruba v 70 % případů způsoben delecí oblasti 15q11-q13 v chromosomu zděděném od otce. Jediná genetická informace této oblasti tak pochází od matky, geny jsou však díky imprintingu neaktivní. Angelmanův syndrom zahrnuje zhruba stejnou oblast chromosomu 15, deletovaná oblast však pochází od matky.
Uniparentální disomie. Potomek dědí po jednom rodiči obě kopie části nebo celého chromosomu, zatímco od druhého rodiče nepřijímá žádnou kopii. Uniparentální disomie je další z příčin Praderova-Williho a Angelmanova syndromu. Jak už bylo naznačeno výše, geny způsobující Praderův-Williho syndrom jsou přepisovány jen z paternální alely, zatímco geny asociované s Angelmanovým syndromem jsou přepisovány jen z maternální alely. V případě, že dítě zdědí oba chromosomy 15 od matky, bude mít díky imprintingu inaktivovány obě sady kritických genů a projeví se u něho Praderův-Williho syndrom. Naopak v případě přítomnosti dvou paternálních chromosomů 15 bude mít potomek příznaky Angelmanova syndromu.
Mozaicismus. Jedinec má dvě nebo více geneticky odlišných buněčných linií odvozených od téže zygoty, např. buněčnou linii s mutací a bez mutace. Jestliže se mutace vyskytne v buňkách, ze kterých vzniká germinální linie, mutace se stává dědičnou změnou, která přechází do další generace. Naproti tomu některé mutace vznikají jen v určité buněčné populaci somatických buněk a výsledkem je somatický mozaicismus. Somatické mutace se na další generace nepřenášejí. Zvláštní význam má germinální mozaicismus, u kterého gamety mohou tvořit mozaiku buněk nepostižených a buněk s mutací.
Typy mutací
Na internetové stránce databáze HGMD (viz přehled www adres) najdeme tabulku uvádějící typy a četnost jednotlivých typů mutací. Tabulka aktualizovaná naposledy v listopadu 2001 uvádí celkem 24 220 mutací v 1098 genech. Každá mutace je uvedena jen jednou, protože nikdy nelze jednoznačně určit, zda ta samá mutace pochází od stejného předka, nebo zda je skutečně rekurentní.
Při interpretaci výsledků mutační analýzy je dobré mít na paměti některé specifické aspekty jednotlivých typů mutací.
Missense mutace (mutace měnící smysl kodonu, jejímž důsledkem je aminokyselinová záměna). Zjištění nukleotidové záměny ještě automaticky neznamená, že jsme nalezli skutečnou mutaci (mutace je patogenní změna způsobující onemocnění), a nikoli polymorfismus, který nemá na zdravotní stav pacienta vliv. Představu o vlivu nukleotidové záměny na funkci proteinu získáme porovnáním biologické aktivity mutovaného a normálního proteinu. Změna, zpravidla snížení biologické aktivity mutovaného proteinu (loss-of-function), znamená přítomnost patogenní mutace, zatímco v případě srovnatelné aktivity mutovaného a normálního proteinu se jedná pravděpodobně o polymorfismus. Ve vzácných případech je biologická aktivita mutovaného proteinu patologicky zvýšena (gain-of-function) – např. mutace v proteinech signálních drah může vést k jejich trvalé aktivaci.
Existuje i řada dalších nepřímých kritérií, která s vysokou pravděpodobností indikují patogenitu mutace. Jedním z těchto kritérií je umístění mutace ve strukturně nebo funkčně důležité oblasti proteinu. Celkem snadno si dovedeme představit, že každá aminokyselina začleněná do polypeptidového řetězce není pro funkci bílkoviny stejně důležitá. Můžeme předpokládat, že aminokyselinové zbytky, které se u enzymu podílejí na jeho aktivním centru nebo které ho udržují ve správné konformaci (tj. ve správné trojrozměrné struktuře), budou mít pro biologickou funkci enzymu větší význam než aminokyselinové zbytky nacházející se mi-mo tyto oblasti. Na druhou stranu, u aminokyselinových zbytků nacházejících se mimo biologicky důležitou oblast nelze s určitostí předpovídat, jaký význam pro funkci proteinu bude jejich záměna mít – může např. ovlivnit stabilitu proteinu nebo jeho náchylnost k degradaci.
Důležitost aminokyselinového zbyt-ku může být sledována podle stupně jeho konzervace během evoluce. Jestliže týž aminokyselinový zbytek nalezneme na určitém místě proteinu u člověka, myši a kvasinky, svědčí to pro jeho nezastupitelnost a mutace v tomto místě je považována za závažnou.
Mutaci od běžného polymorfismu (tj. záměny přítomné u více než u 1 % populace) rozeznáme poměrně snadno vyšetřením mutace na 100 a více alelách získaných od zdravých lidí, kteří si nejsou příbuzní. Jestliže ani jedna z kontrolních alel záměnu nenese, výsledek nesvědčí pro běžný polymorfismus.
Dobrým vodítkem je i případ, kdy mutace byla již dříve popsána u jiného pacienta se stejnou diagnózou, případně když je v rámci jedné rodiny mutace přítomna u postižených členů rodiny, zatímco zdraví příslušníci téže rodiny mutovaný gen nenesou (mutovaný gen segreguje s nemocí).
Nonsense mutace (nesmyslná mutace, změna kodonu pro aminokyselinu za jeden ze stop kodonů – UGA, UAA,UAG) vede k předčasnému ukončení translace a zkrácení polypeptidového řetězce. Současně může být významně sníženo množství mutantní mRNA v důsledku tzv. nonsense mediated decay (NMD), procesu, který rozpozná předčasně umístěný stop kodon a zajišťuje degradaci mutantní mRNA již v jádře. Buňka takovým způsobem zřejmě předchází syntéze aberantních polypeptidů z mRNA, které nesou informaci pro zkrácený nefunkční protein. Množství mutantní mRNA, která NMD uniká a je pak překládána do zkráceného proteinu, je specifické pro gen, v němž k nonsense mutaci došlo i pro konkrétní pozici mutace. V některém případě pak detekujeme zkrácený protein v množství srovnatelném s normálním proteinem, v jiných případech (jiné geny, jiné pozice nonsense mutace) je množství zkráceného proteinu výrazně sníženo, případně protein nejsme schopni vůbec detekovat.
Inzerce a delece jsou mutace, při nichž dochází k vypuštění, resp. k včlenění jednoho, ale i řádově miliónů nukleotidů. Důsledky takových mutací závisí na počtu a umístění odstraněných nebo včleněných nukleotidů. Dojde-li k deleci nebo inzerci jednoho nebo několika kodonů, neporuší se mutací čtecí rámec a výsledkem je bílkovina zkrácená o jednu či několik aminokyselinových zbytků („in frame“ mutace). Pokud delece není příliš velká a odstraněné aminokyselinové zbytky nezasahují do biologicky aktivních částí proteinu, nemusí se taková změna na aktivitě proteinu projevit. Daleko zásadnější změny způsobují delece a inzerce narušující čtecí rámec (frame shift). V tom případě jsou pak od místa mutace do bílkovinného řetězce začleňovány jiné aminokyseliny, než je tomu u normálního proteinu. Posun ve čtecím rámci obvyk-le také vede ke vzniku předčasného stop kodonu. Výsledkem inzerce/delece s posunem čtecího rámce je zkrácený polypeptidový řetězec obsahující nesmyslnou aminokyselinovou sekvenci (Obr. 1).
Nukleotidové záměny nebo delece v místech důležitých pro sestřih mRNA vedou k sestřihovým mutacím (splicing mutations). K takovým místům patří hraniční oblasti exonu a intronu a určitý úsek uvnitř intronu (Obr. 2). Sestřihové mutace způsobují výrazné změny v maturované mRNA, dochází k deleci části nebo celého exonu, nebo naopak inzerci části intronu, který je pak translačním aparátem buňky vnímán jako kódující sekvence a překládán do polypeptidu. Doprovodným jevem sestřihové mutace je často posun ve čtecím rámci (frame shift). Některé mutace v exonu nebo intronu mohou aktivovat skryté sestřihové místo (místo, na kterém za normálních podmínek k sestřihu nedochází) nebo ovlivňovat účinnost sestřihu. Mechanismus sestřihu je velmi komplikovaný a není dodnes plně prostudován. Proto je v každém případě nezbytné ověřit sestřihovou mutaci na úrovni transkriptu (mRNA).
Zhodnocení výsledků mutační analýzy
Mutační analýza je velmi prospěšný pomocník při genetickém poradenství, při interpretaci výsledků je však třeba mít na paměti některé aspekty.
Patogenita mutací. Mutační analýza odhaluje změny v sekven-ci DNA. Některé změny však nemusejí mít žádný fenotypový projev. Mutace totiž nemusí zasáhnout oblast genomu, která je funkčně důležitá, nebo změna v kódující oblasti genu ne-ovlivní aminokyselinovou sekvenci, případně ji změní tak, že výsledný protein se neliší ve funkčních vlastnostech od proteinu normálního. Pak zpravidla nemluvíme o mutaci, ale o polymorfismu. Patogenitu mutace obvykle vyhodnocujeme na základě kritérií uvedených v odstavci o missense mutacích.
Nestabilní mutace. Obvykle předpokládáme, že mutace se dědí z generace na generaci v nezměněné podobě. Existují však nemoci (např. fragilní X-syndrom nebo Huntingtonova nemoc), kde lékaři pozorovali, že v dalších generacích se průběh nemoci zhoršuje – fenotyp je závažnější a nástup nemoci probíhá v mladším věku. Vysvětlení přinesla molekulárně genetická analýza: uvedené nemoci jsou způsobeny nadměrným počtem tripletových repetic, které se v následných generacích dále zmnožují. Závažnost onemocnění přímo koreluje s počtem repetic. Fragilní X-syndrom a Huntingtonova nemoc jsou zástupci dvou tříd, na které se onemocnění způsobená nestabilními mutacemi dělí. Huntingtonova nemoc je způsobena expanzí trinukleotidu CAG v kódující oblasti genu. Stabilní alela obsahuje 6–35 trinukleotidů, zatímco u pacientů s Huntingtonovou chorobou bylo zjištěno od 36 do více než sta těchto repetic. Důsledkem expanze trinukleotidu CAG (kodonu pro aminokyselinu glutamin) v kódující oblasti je dlouhý polyglutaminový úsek, který uvnitř určitých buněk tvoří agregáty a buňky zabíjí. Naproti tomu u fragilního syndromu X dochází k expanzi trinukleotidu CGG v 5´nepřekládané oblasti. Zatímco stabilní alela obsahuje 6–54 těchto repetic, výsledkem expanze u pacientů je 200 až více než tisíc trinukleotidů CGG. Taková expanze způsobuje vzdalování sekvencí potřebných pro přepis (transkripci) genu a tím snižuje jeho expresi.
Mozaicismus. Somatický mozaicismus může vysvětlit některé neobvyklé nálezy při vyšetření mutací. Byl např. popsán u chlapce s velmi mírnou formou deficitu ornithin karbamoyl transferázy (OTC), který se při vyšetření jevil jako heterozygot pro mutaci v genu pro OTC. Gen pro OTC se nachází na chromosomu X a u mužů (XY) je heterozygotie vyloučena. Somatický mozaicismus objasňuje jak zdánlivou heterozygotii, tak mírný průběh onemocnění. Mozaicismus je třeba zvážit zejména u gonosomálně dědičných onemocnění v případě, že u matky není zjištěna mutace nalezená u jejího syna. Ačkoli se může jednat o mutaci vzniklou de novo, nelze vyloučit germinální mozaicismus, který představuje riziko pro postižení plodu v dalších těhotenstvích. Většinou je obtížné posoudit výši tohoto rizika, rodiny by měly být podrobně informovány a měla by jim být nabídnuta prenatální diagnostika. K obdobné situaci může dojít u dominantních onemocnění.
Rizika mutační analýzy v prenatální diagnostice. Je-li známá rodinně specifická mutace, můžeme z DNA získané z choriových klků nebo amniocytů určit genotyp plodu. V případě, že mutaci u plodu neprokážeme, obvyklý dotaz maminek je: „Mám teď jistotu, že miminko bude zdravé?“ Odpověď zní ne – při prenatální diagnostice se zaměřujeme pouze na mutace (mutaci) způsobující onemocnění u jiných členů rodiny. Riziko proto nevylučujeme, pouze ho snižujeme na riziko normálního těhotenství.
Využití molekulárně genetické diagnostiky
Metody molekulární genetiky se stávají běžnou součástí vyšetření používaných při stanovení diagnózy. Znalost genoty-pu je základem individuálního přístupu ke každému pacientovi, v některých případech může znalost mutace ovlivnit terapeutický postup. U onemocnění, kde se diagnóza běžně stanovuje vyšetřením proteinu nebo jeho aktivity, např. u dědičných metabolických onemocnění (deficitů enzymů, jejich aktivátorů nebo transportních proteinů), je stanovení mutací často jen doplňujícím vyšetřením. Většinu genetických onemocnění však nemůžeme řadit mezi enzymopatie a zde je vyšetření mutací jedinou možností, jak potvrdit klinickou diagnózu.
Nezastupitelnou úlohu hraje molekulárně genetická diagnostika v genetickém poradenství. Je nejspolehlivějším a mnohdy jediným způsobem identifikace přenašečů a presymptomatických jedinců v postižených rodinách. Znalost predispozice k nemoci umožňuje zavedení preventivních opatření, např. změna životního stylu nebo zahájení farmakoterapie.
V souladu s mezinárodními úmluvami, ke kterým se Česká republika připojila, má být vyšetření mutací poskytováno výhradně na základě informovaného souhlasu (Úmluva na ochranu lidských práv a důstojnosti lidské bytosti v souvislosti s aplikací biologie a medicíny: Úmluva o lidských právech a biomedicíně, viz www stránky). Osoba, u níž je vyšetření prováděno, musí být předem řádně informována o účelu a povaze vyšetření, jakož i o jeho důsledcích a rizicích. Při poskytování informací je třeba pečlivě zvážit všechny možné eventuality, protože vyšetření mutací může např. prokázat, že vyšetřovaná osoba má závažné neléčitelné onemocnění, které se projeví později v životě, nebo že otec dítěte není jeho biologickým rodičem. Sdělení výsledků vyšetření mutací a genetická péče o rodinu pak mohou představovat složitý problém, jehož řešení přesahuje cíle tohoto sdělení – odkazujeme na kapitoly zabývající se genetickým poradenstvím.
Velmi důležitou funkci hraje molekulární genetika v prenatální diagnostice(Obr. 3). V případě některých onemocnění je mutační analýza jedinou možností diagnostiky. Například deficit OTC, nejčastější dědičné onemocnění močovinového cyklu, lze diagnostikovat na základě stanovení enzymové aktivity OTC ve vzorku z jaterní tkáně. Podezření na toto onemocnění lze vyslovit na základě výsledků vyšetření metabolitů v tělních tekutinách, nebo zátěžového testu s allopurinolem. Ani jedna z metod není pro prenatální diagnostiku vhodná. Známe-li však mutaci, která se v rodině s deficitem OTC přenáší, není vyšetření DNA z choriových klků nebo amniocytů problémem. V současnosti se začíná uplatňovat další, mnohem citlivější možnost pomoci postiženým párům, které si přejí mít děti – preimplantační genetická diagnostika. V tomto případě se mutace vyšetřuje u zárodků oplozených in vitro a čtyři dny po oplodnění jsou nepostižená embrya implantována do těla matky.
Při analýze genotypu nesmíme samozřejmě zapomínat ani na etickou stránku problému. Testování predispozice k nemoci v sobě nese riziko zneužití informací zaměstnavateli nebo zdravotními pojišťovnami, ale i potenciál obrovského prospěchu. V každém případě je třeba si uvědomit, že ve své podstatě se nejedná o nic nového. Nový je jen vyšetřovaný materiál (DNA) a s tím související metodika. Populační screening za účelem prevence některých nemocí se v medicíně provádí již dlouho: např. měření krevního tlaku a cholesterolu identifikuje mezi asymptomatickými lidmi jedince s predispozicí ke kardiovaskulárním chorobám. Podobně se v perinatální medicíně provádí populační screening, který identifikuje jedince, kteří mají z včasného zásahu prospěch – např. fenylketonurie. Důvody pro rutinní mamografii, screening krve ve stolici, měření antigenu specifického pro prostatu a screening glaukomu jsou obdobné – včasné rozpoznání nemoci a prospěch ze včasně zahájené léčby.
Podle našich zkušeností však u členů postižených rodin převládá před obavami z etických problémů zpravidla zájem o genetické vyšetření, o poskytnutí genetického poradenství i o prenatální diagnostiku. Zájem je pochopitelný vzhledem k tomu, že řada dědičných onemocnění má velmi závažný průběh a zdaleka ne u všech nemocí je znám způsob léčby. Výskyt nemoci znamená pro rodinu obrovskou psychickou, fyzickou i ekonomickou zátěž.
Výsledky analýzy mutací znamenají nezanedbatelný ekonomický přínos celé společnosti a hlavně podstatné zvýšení kvality života v postižených rodinách.
www stránky
Na stránkách NCBI (National center for biotechnology information) najdeme řadu důležitých informací z molekulárně biologického výzkumu. Z hlediska našeho pojednání jsou asi nejdůležitější dvě databáze – GenBank a OMIM.
GenBank je databáze zaměřená na známé sekvence lidského genomu.
OMIM (Online Mendelian Inheritance in Man) obsahuje katalog lidských genů a genetických onemocnění člověka. Zadáme-li jako klíčové slovo název onemocnění, najdeme základní informace o patologii a patofyziologii onemocnění, zjistíme, zda je známý gen, který je za vývoj onemocnění zodpovědný, jaké byly u pacientů nalezeny mutace apod.
http://archive.uwcm.ac.uk/uwcm/mg/hgmd0.html
Human Gene Mutation database (HGMD) – databáze obsahující zprávy o známých (publikovaných) mutacích v genech zodpovídajících za dědičná onemocnění člověka.
Další dvě databáze shrnují pracoviště, která se zabývají diagnostikou DNA. Rozhodne-li se lékař pro molekulárně genetické vyšetření u svého pacienta a jeho rodiny, najde na stránkách http://www.uhkt.cz/ po zadání dotazu na příslušné onemocnění seznam pracovišť v České republice, která příslušné vyšetření nabízejí. Pokud laboratoře v ČR vyšetření nenabízejí, lze se obrátit na stránky GeneTests (http://www.genetests.org/), které jsou věnovány seznamu laboratoří ve světě.
Plné znění Úmluvy na ochranu lidských práv a důstojnosti lidské bytosti v souvislosti s aplikací biologie a medicíny: Úmluva o lidských právech a biomedicíně, http://www.sagit.cz/_texty/ss01096.htm
Metody užívané k analýze mutací
Amplifikace DNA – PCR
Základním předpokladem úspěšné analýzy je získání dostatečného množství molekul se sekvencí, která nás zajímá. Revoluci v tomto směru způsobila metoda i v českých laboratořích dnes běžně nazývaná PCR (polymerase chain reaction, polymerázová řetězová reakce). PCR je rychlá, snadno použitelná metoda pro amplifikaci určitého úseku DNA in vitro. V praxi to znamená, že ze vzorku obsahujícího celou lidskou DNA jsme pomocí PCR schopni specificky amplifikovat např. jeden jediný exon, v němž chceme hledat mutaci. Princip metody je uveden na obrázku. Na hranicích úseku, který chceme amplifikovat, zvolíme podle určitých pravidel dva krátké oligonukleotidy, které budou sloužit jako primery pro prodlužování řetězců DNA. Samotná reakce probíhá ve třech základních krocích: denaturace, hybridizace primerů a enzymová syntéza nového řetězce DNA. Každý krok probíhá při specifické teplotě. Nově vzniklé i původní řetězce DNA jsou templátem pro syntézu nových řetězců v dalším kole. Amplifikace tedy probíhá exponenciální řadou, z jedné molekuly templátu teoreticky vzniknou ve 2. cyklu 2 molekuly, v dalších cyklech 4, 8, 16, 32, … molekul produktu PCR reakce. S použitím speciálních přístrojů - thermocyklerů, které jsou schopny rychle a přesně měnit reakční teploty, je po 30 cyklech požadovaný úsek DNA přítomen v mnoha milionech kopií (Obr. 4).
PCR umožňuje obvykle bez větších problémů amplifikovat úseky dlouhé stovky až tisíce bází. Jsou publikovány úspěšné amplifikace až 30 000 bází, taková reakce však potřebuje speciální podmínky.
Metody identifikující úsek genu
obsahující mutaci
Tyto metody se nezaměřují na konkrétní identifikaci mutace, ale na určení úseku genu, ve kterém se mutace nachází. Metody umožňují rozpoznat změny ve struktuře studovaného a kontrolního PCR produktu.
SSCP (single-strand conformation polymorphism) je elektroforetická technika, ve které analyzujeme denaturovaný – jednovláknový PCR produkt. Jednovláknová DNA má tendenci se skládat do struktur stabilizovaných slabými intramolekulárními silami, hlavně párováním bází založeným na vodíkových vazbách. Elektroforetická mobilita takových struktur v nedenaturujícím polyakrylamidovém gelu pak nezávisí jen na délce řetězce, ale i na jeho konformaci. Mutace často vyvolá změnu konformace a projeví se potom směnou mobility oproti kontrolnímu vzorku.
Další metody jsou založeny na tvorbě heteroduplexů mutovaných a nemutovaných molekul. Sledovaný PCR produkt zahřejeme na vysokou teplotu, aby se obě vlákna dvojšroubovice od sebe oddělila, a pak vzorek necháme pozvolna chladnout, aby znovu vznikl dvouvláknový produkt. Jestliže některé PCR produkty obsahují mutaci (případ DNA heterozygotního jedince), máme po zchladnutí ve zkumavce tři typy dvojvláknových struktur – dvojvlákno zdravé alely, dvojvlákno mutované alely a heteroduplex, kdy dvouvláknovou strukturu tvoří jedno vlákno se zdravou a druhé s mutovanou sekvencí. K detekci heteroduplexů byla vyvinuta řada metod – jedna skupina využívá skutečnosti, že mobilita fragmentů se silně změní při jejich denaturaci, přičemž heteroduplexy denaturují za jiných podmínek než homoduplexy. Mobilitu můžeme sledovat na denaturačním gelu – denaturační gradientová gelová elektroforéza (DGGE) nebo na chromatografické koloně – denaturační vysokotlaká kapalinová chromatografie (dHPLC). Další skupina metod je založena na enzymovém nebo chemickém štěpení heteroduplexů. Vzniklé heteroduplexy je možné v místě nespárovaných nukleotidů rozštěpit chemicky (OsO4 nebo KMnO4) nebo enzymaticky (skupina enzymů nazývaných resolvasy). Na elektroforetickém gelu pak vidíme dlouhý úsek odpovídající nerozštěpenému homoduplexu a kratší úseky náležející rozštěpenému heteroduplexu.
Sekvenování
Sekvenování je analytická metoda, kterou jsme schopni číst bázi po bázi úsek DNA, který nás zajímá. V současnosti je hojně využívaná metoda cycle sequencing, která vychází z principů PCR a jejíž výhodou je, že potřebujeme poměrně malé množství templátu, jenž hodláme sekvenovat (řádově stovky nanogramů DNA). Jako templát slouží obvykle PCR produkt získaný z genomové DNA nebo z cDNA, v reakční směsi je dále přítomna termostabilní DNA polymeráza, jeden primer komplementární sekvenci na řetězci, který sekvenujeme, deoxynukleotidy (dNTPs) a v určitém malém množství jeden ze čtyř dideoxynukleotidů (ddNTPs), které zabraňují dalšímu prodlužování řetězce. Začleňování dNTPs a ddNTPs do řetězce je náhodné a výsledkem je směs řetězců komplementárních k sekvenci předlohy a lišících se navzájem ve své délce o jeden nukleotid. Abychom mohli číst bázi po bázi celou sekvenci, potřebujeme zařízení – sekvenátor, který je schopen řetězce odlišující se ve své délce pouze o jeden nukleotid rozdělit. Dnes jsou nejčastěji používány dva typy sekvenátorů – deskový a kapilární, které se liší podle toho, zda elektroforetické dělení fragmentů probíhá v planárním gelu nebo v kapiláře. Původní radioaktivní značení a autoradiografickou detekci nahradilo značení primeru nebo jednoho nebo všech čtyř typů dideoxynukletidů fluoroforem. Snímaný fluorescenční signál je průběžně ukládán do souboru v počítači (Obr. 5).
Metody používané pro screening
známých mutací
PCR/RFLP je metoda vhodná pro případ, že mutace vytváří nebo ruší rozpoznávací místo pro restrikční endonukleázu (restrikční enzymy pocházejí z baktérií a rozpoznávají krátkou nukleotidovou sekvenci, zpravidla 4–8 nukleotidů; v tomto místě nebo poblíž něho štěpí DNA). PCR produkt necháme štěpit vhodným restrikčním enzymem a na základě elektroforetické mobility vzniklých štěpů zjišťujeme přítomnost dané mutace (Obr. 6).
ARMS (amplification refractory mutation system) je opět metoda založená na PCR. V tomto případě potřebujeme tři primery – jeden je specifický pro referenční sekvenci, druhý pro sekvenci mutovanou a třetí primer je společný. Pak pro každý vzorek provedeme dvě PCR: v první reakci je primer specifický pro referenční sekvenci, ve druhé je primer specifický pro mutovanou sekvenci, třetí, společný primer je samozřejmě přítomen v obou reakcích. Pokud získáme produkt jen v prvním případě, vyšetřovaná DNA mutaci nenese, produkt v druhém případě ukazuje na přítomnost mutace, pokud jsou produkty v obou reakčních směsích, jedná se o heterozygotii (Obr. 7).
Metody využívané k identifikaci
velkých změn v sekvenci DNA
Southern blotting
Studovaná DNA se rozštěpí jedním nebo více restrikčními enzymy, štěpy se podle velikosti rozdělí na agarosové elektroforéze (čím kratší je fragment, tím putuje rychleji). Dvouřetězcové fragmenty DNA se pak denaturují v silně zásaditém prostředí a vzniklé jednořetězcové molekuly se pak přenesou („přeblotují“) z gelu na nylonovou membránu a vizualizují se hybridizací s radioaktivně značenou sondou (např. cDNA genu, který analyzujeme). Sonda hybridizuje (naváže se), a tím vizualizuje jen komplementární sekvenci imobilizované DNA. Na základě rozdílné mobility fragmentů získaných z kontrolní DNA a pacientovy DNA můžeme odvodit např. přítomnost a případně i přibližný rozsah delece nebo inzerce. Metoda je vhodná pro zjišťování velkých delecí (minimálně stovky bází) (Obr. 8).
DNA čipy
Využití DNA čipů v diagnostice je teprve v začátcích, ale již dnes je patrná řada výhod této moderní hybridizační techniky – jednoduchost, rychlost a velká kapacita – během jednoho pokusu vyšetříme tisíce genů. V tomto sborníku je DNA čipům věnována celá kapitola a zde uvádíme jen dva případy, ve kterých předpokládáme uplatnění čipů v DNA diagnostice. DNA čipy jsou využívány pro detekci známých mutací např. metodou APEX (arrayed primer extension) a lze je využít i pro semikvantitativní stanovení množství hybridizované DNA – díky tomu mohou být také využity pro zjišťování delecí přímo v genomové DNA.
Strategie analýzy mutací
Využití právě popsaných technik v diagnostice dědičných onemocnění umožňuje celkem snadno určit většinu přítomných mutací. Dnes nejsou výjimkou nemoci, v nichž byly identifikovány řádově stovky mutací v příslušném genu (viz www stránky – databáze HGMD).
Jistě existuje celá řada možných postupů při vyhledávání mutace, na tomto místě popsaná metodika vychází ze zkušeností našeho pracoviště.
Zjištění referenční sekvence
Pokud máme zjišťovat změny v genu, musíme vědět, jak vypadá jeho sekvence u zdravého člověka. Analýzu začínáme prací u počítače, kde v některé z databází věnovaných známým sekvencím lidského genomu (např. GenBank) na-jdeme referenční sekvenci genu. Je velkou výhodou, že sekvence lidského genomu je známa – je však třeba mít na paměti, že dostupné sekvence obsahují nezanedbatelné množství chyb. Pro interpretaci výsledků analýzy mutací je nutná znalost polymorfismů, sestřihových variant, repetitivních sekvencí v genu a také příbuzných sekvencí – např. pseudogenů.
Volba metod
Z Tab. 1 vyplývá, že naprostá většina mutací jsou bodové mutace (substituce jednoho páru bází) a malé delece a inzerce. Proto pro analýzu mutací obvykle v první řadě volíme metody, které jsou zaměřeny na identifikaci právě takových malých změn. Teprve v případě, že mutaci těmito metodami nejsme schopni odhalit, přistupujeme k metodám, které slouží k analýze větších změn (Southern blotting).
Výběr metod pro zjištění malých změn
1. V případě, že u genu, který vyšetřujeme, je známa jedna nebo více prevalentních mutací (mutace, které byly nalezeny u značného počtu nepříbuzných pacientů, např. mutace DF508 u cystické fibrózy), je výhodné nejdříve zjistit, zda nový pacient nese prevalentní mutaci (screening známých mutací). Techniky, které se k tomuto účelu často používají, jsou restrikční analýza (PCR/RFLP) nebo ARMS. Je třeba si uvědomit, že takovéto vyšetření nevylučuje přítomnost dalších mutací v genu, dokonce na téže alele.
2. Pokud se nám prevalentní mutaci nepodaří prokázat nebo pokud prevalentní mutace pro daný gen není známá, je potřeba analyzovat všechny důležité oblasti genu.
Vyhledávání neznámé mutace můžeme začít některou z metod, kterými určíme přibližnou polohu mutace v genu (SSCP, analýza heteroduplexů). Nevýhodou těchto metod je, že každý studovaný PCR produkt vyžaduje vlastní optimalizaci podmínek, při nichž lze od sebe odlišit mutovanou a kontrolní sekvenci. Navíc záchyt mutace není stoprocentní. Proto se tyto metody využívají zejména v případě analýzy genu, který zodpovídá za nemoc s vysokou frekvencí výskytu. V případě, že analyzujeme gen vzácného onemocnění, je časově i finančně výhodnější analýzu začít přímo sekvenováním a mutaci pak ověřit nezávislou metodou – např. PCR/RFLP nebo ARMS.
Které oblasti genu jsou pro vyhledávání mutací důležité: na úrovni genomové DNA jsou to kódující oblasti (exony) a oblasti intronů důležité pro sestřih, na úrovni mRNA celá sekvence kódující protein a přiléhající nepřekládané oblasti na 5´ a 3´ konci. Nejvýhodnější pro úplnou charakterizaci mutace je kombinace analýzy genomové DNA a mRNA. Na úrovni mRNA někdy nejsme schopni určit charakter sestřihové mutace. Navíc je tu riziko, že mutace ovlivňuje stabilitu transkriptu, např. díky mechanismu nonsense mediated decay. Může pak dojít k tomu, že v cytosolové mRNA není takový mutantní transkript detekovatelný a v případě heterozygotní mutace analyzujeme pouze druhou alelu, tj. alelu bez mutace. Naopak na úrovni genomové DNA se nám někdy poruchu sestřihu vůbec nepodaří odhalit, protože dnes ještě neznáme všechna místa v genomu, která sestřih ovlivňují.
Literatura
NUSSBAUM, RL., MCINNES, RR., WILLARD, HF. (Eds). Thompson and Thompson Genetics in Medicine. 6th ed., Philadelphia : W. B. Saunders Company, 2001.
SCRIVER, CR., BEAUDET, AL., SLY, WS., VALE, D., et al. (Eds). The metabolic and molecular bases if inherited disease. 8th ed., New York : McGraw Hill Inc., 2001.
STRACHAN, T., READ, AP. Human Molecular Genetics. 2nd ed., New York : John Wiley and Sons Inc., 1999.
Poděkování
Autoři děkují ing. arch. Janu Šimkovi za technickou pomoc při zhotovení obrázků, MUDr. Viktoru Kožichovi, CSc., a MUDr. Evě Hrubé za cenné připomínky k textu.
Na obrázcích 3, 6 a 7 jsou reprezentovány vlastní výsledky vyšetření, která byla podpořena VZ 111100003.
e-mail: ldvor@lf1.cuni.cz
Obr. 1 – Vliv delecí a inzercí na kódující sekvence proteinu
kodon 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
mRNA AAU GGU CAC AAC UUC AUG GUU CGA AAU UUU
polypeptid Asn Gly His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe
Delece 2. kodonu neporušující čtecí rámec:
mRNA AAU CAC AAC UUC AUG GUU CGA AAU UUU
polypeptid Asn His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe
Inzerce kodonu UUG neporušující čtecí rámec:
mRNA AAU GGU UUG CAC AAC UUC AUG GUU CGA AAU UUU
polypeptid Asn Gly Leu His Asn Phe Met Val Arg Asn Phe
Delece UC v 5. kodonu porušující čtecí rámec:
mRNA AAU GGU CAC AAC UAU GGU UCG AAA UUU U . .
polypeptid Asn Gly His Asn Tyr Gly Ser Lys Phe . . .
Inzerce AAU v 8. kodonu způsobující posun v čtecím rámci a předčasný stop kodon:
mRNA AAU GGU CAC AAC UUC AUG GUU CAA UGA AAU UUU
polypeptid Asn Gly His Asn Phe Met Val Gln Stop