Prof. MUDr. Zdeněk Kolář, CSc., Mgr. Jan Bouchal, MUDr. Jiří Ehrmann jr.
Univerzita Palackého v Olomouci, Laboratoř molekulární patologie CMBM UP a Ústav patologie LF UP
Klíčová slova
patogeneze • molekulární úroveň • mutace • metody detekce • aplikace
Pojem „patologie“ je chápán jako označení vědy studující patogenezi nemocí a jejich etiologii. V současné době je etiologie některých chorobných stavů poznána velmi dobře. Týká se to především protozoálních, bakteriálních a virových infekcí. Příčiny jiných chorob nejsou vždy tak dobře vysvětleny a někdy je zatím nezbytné je označovat jako choroby kryptogenní nebo idiopatické. Patogenezí chorob rozumíme soubor dějů, které provází vznik a vývoj chorobných stavů. Tyto děje jsou provázeny změnami jak morfologickými, tak i funkčními. Protože morfologické a funkční změny nelze od sebe dost dobře oddělit, stírá se v současnosti rozdíl mezi klasickou a dříve čistě morfologicky chápanou patologickou anatomií a funkčně zaměřenou patologickou fyziologií. Pro studium nemocí na úrovni organismu, orgánů, tkání, buněk a subcelulárních organel užívají patologové celou škálu „nemolekulárních“ technik, zahrnujících jak prosté makroskopické pozorování, tak i vyšetření pomocí světelného nebo elektronového mikroskopu v růz ných modifikacích. Pro průkaz patogenních agens, bu něčných a mimobuněčných struktur a me ta bolických produktů v patologicky změněných tkáních a buňkách používají metody založené na histochemickém nebo imunohistochemickém (cytochemickém/imunocytochemickém) prin cipu. Diagnózu nemoci však často stanovují až po důkladném srovnání výsledků morfologických vyšetření s biochemickými, mikrobiologickými, hematologickými a imunologickými nálezy. Vyšetřování tkání a buněk získaných post mortem představuje jen zlomek náplně práce patologa. Naprostou převahu tvoří vyšetření buněk a tkání získaných in vivo při chirurgických intervencích, punkcích nebo z tělních sekretů a tekutin. Praktická aplikace těchto uvedených metod (i když v případě imunohisto(cyto)chemických technik lze již vzhledem k jejich citlivosti někdy hovořit o vy šetření na molekulární úrovni) přináší pa cientům enormní prospěch. Bez jejich existence by často bylo nemožné stanovit přesnou diagnózu a zajistit optimální terapii. Týká se to především pacientů s onkologickými onemocněními, kde přesná diagnóza patologa je rozhodující pro způsob terapie i další průběh nemoci.
Výrazné pokroky, kterých bylo v uplynulých desetiletích dosaženo v oblasti molekulárních technologií, vedly k ustavení zvláštní větve patologie a podle některých koncepcí samostatného oboru, který se nazývá „molekulární patologie“. Tento obor se rovněž zabývá studiem procesů souvisejících se vznikem a rozvojem chorob, a to na úrovni nukleových kyselin a proteinů, resp. jiných molekul, které jsou jimi regulovány. Využívá přitom technik molekulární biologie a výsledky dává do kontextu s nálezy ostatních biomedicínských oborů včetně patologie. Tento pohled umožňuje nahlédnout až k samým počátkům vzniku nemoci, až na jejich genovou úroveň. Očekává se, že právě molekulární patologie bude schopna vnést nové světlo na „staré nemoci“ a vysvětlit příčiny některých nemocí, kterým jsme doposud dobře neporozuměli.
V únoru roku 1999 se konala v Bethesdě ve Spojených státech konference amerických molekulárních patologů, která se zabývala významem molekulární patologie pro zlepšení výsledků léčby pacientů (Arch. Pathol. Lab. Med. 1999: 123, 1000-1001). Na této konferenci se diskutovalo ve čtyřech sekcích, zahrnujících podobory molekulární patologie: molekulární mikrobiologii, molekulární genetiku, molekulární onkologii a molekulární forenzní medicínu, a o nejrůznějších aspektech tohoto oboru, včetně aspektů eticko-právních. Bylo konstatováno, že v případě molekulárních technologií se nestalo to, co s mnoha jinými nadějnými postupy, které po zavedení do praxe nesplnily do nich vkládaná očekávání. Naopak, v amerických nemocnicích dochází k nebývalému rozvoji těchto nových detekčních a diagnostických metod. Například v oblasti molekulární mikrobiologie došlo díky nim k revoluci v diagnostice a léčbě infekčních chorob, která umožňuje úspěšně monitorovat např. výskyt HIV a zavádět účinnou protivirovou terapii. V rámci molekulární patologie se rozvíjejí i nové podobory jako např. molekulární epidemiologie. Testování somatických mutací a defektů proteinové exprese v nádorech umožňuje přesné určení prognózy a konstrukci individuální terapie. V případě hematologických malignit tyto metody umožňují s dosud nebývalou senzitivitou detekovat minimální reziduální chorobu. U četných vrozených chorob dovoluje přesná detekce mutací stanovit diagnózu (často již prenatálně) nebo provádět screening, a to i v případech, že u pacientů nejsou patrné žádné biochemické nebo histopatologické změny. Velkého úspěchu bylo dosaženo při detekci mutací spojených se syndromy hereditárních nádorů (mléčné žlázy, ovarií, tlustého střeva, MEN atd.). Také v oblasti forenzní medicíny a určování otcovství dosáhly techniky detekce „DNA fingerprinting“ ve srovnání s dříve používanými metodami nebývalé senzitivity a specifity. Na této konferenci byla zdůrazňována role patologa jako konzultanta, který musí mít nejen klinické, vědecké a epidemiologické znalosti, ale který zároveň musí dostatečně ovládat informatiku, statistiku a administrativu. Jeho postavení v systému zdravotní péče se stává klíčovým pro výsledek léčby každého pacienta. Vzdělání patologa v oblasti molekulární patologie je nezbytné. Z důvodu rychlého a dynamického vývoje tohoto oboru bude třeba, aby se patolog v oblasti péče o pacienta stal aktivním rádcem klinika a koordinátorem používání metod molekulární patologie v praxi. Je žádoucí, aby i v menších a středně velikých zdravotnických zařízeních se patolog stal expertem na molekulární medicínu, na kterého se budou klinici obracet s dotazy o vhodnosti použití toho kterého testu a na jeho interpretaci, a to dokonce v případech, že určený test nebude prováděn v místních laboratořích. Proto bude nutné, aby všichni lékaři, a to i ti, kteří ukončili svůj základní vědecký a odborný výcvik před více lety, se začali systematicky vzdělávat v moderních molekulárních metodikách a diagnostice, a tím získali alespoň rámcový přehled o možnostech, které molekulární patologie nabízí. Závěry zmiňované konference byly jednoznačné: molekulární patologie musí být integrována do běžných léčebných protokolů. To povede k redukci nákladů na méně senzitivní, méně efektivní a méně specifické testy, k poklesu zbytečných diagnostických přístupů a k efektivnější terapii.
Lze očekávat, že podobný trend zaznamenáme dříve nebo později i u nás. Při současných ekonomických potížích by se mohlo zdát, že zavedení nových molekulárních diagnostických metod v naší republice bude enormně nákladné a přesáhne možnosti našeho zdravotnictví. Podrobné ekonomické analýzy provedené v USA však ukázaly, že ve skutečnosti bude finanční dopad příznivý, protože terapie založená na tomto metodickém přístupu bude úspěšnější a z tohoto hlediska výrazně levnější. Úkolem seriálu článků bude poukázat na molekulární aspekty některých chorob a podat rámcový přehled diagnostických možností, které molekulární patologie nabízí.
Metody molekulární
patologie a jejich aplikace
Tak jako u jiných oborů, byl i rozvoj molekulární patologie přímo závislý na rozvoji její metodické základny. Formálně je vhodné používané metody rozdělit na metody molekulární patologie v širším slova smyslu a na metody molekulární histopatologie. Následuje přehled některých používaných technik se stručným popisem jejich významu a principu.
Obecné metody molekulární patologie
Autoradiografie a neradioaktivní detekce
Je metodou pro získání informací o přesné lokalizaci intracelulárních substancí značených radioaktivními izotopy (nejčastěji jsou užívány 32P, 35S a 3H). Radioaktivní záření je detekováno na fotografickém filmu nebo pomocí speciálních přístrojů. Metoda může sloužit i pro studium buněčných funkcí a metabolismu látek, k určení, které orgány metabolizují danou látku a jak rychle, i k určení rychlosti syntézy nukleových kyselin. Je vhodná rovněž pro detekci značených molekul na ultrastrukturální úrovni. V posledních letech se v některých aplikacích upouští od radioaktivního značení a využívá se fluorescenčního nebo enzymatického značení založeného na principu interakcí antigen/protilátka nebo biotin/avidin (streptavidin). Senzitivita nově vyvinutých detekčních systémů je srovnatelná s radiografií.
===== Extrakce a purifikace nukleových kyselin =====
DNA může být extrahována z čerstvého, stejně jako fixovaného biologického materiálu (buněk, tkání). Byly vypracovány přesné mikrodisekční techniky pro izolaci jednotlivých buněk nebo dokonce buněčných jader ze zmražených nebo parafínovou technikou zpracovaných tkáňových řezů. Získané vzorky obvykle bývají přeneseny do speciálního natravovacího (digesčního) pufru, v kterém jsou buňky lyzovány a pomocí proteolytického enzymu (nejčastěji proteinázy K) dochází k odstranění histonů z DNA. Následuje oddělení DNA od proteinů (obvykle klasickou fenol-chloroformovou metodou) a precipitace DNA v alkoholu. Vysušená DNA je rozpuštěna v pufru a skladována při –20 či –70 °C. Při fenol-chloroformové metodě dochází k fragmentaci DNA, což může být pro některé aplikace nežádoucí. Tento problém je možné obejít pomocí komerčně dostupných kitů využívajících šetrnou absorpci DNA na silikonové filtry.
Klasickou metodou pro izolaci RNA je obdoba fenol-chloroformové metody pro DNA, kdy hlavními rozdíly jsou lyzační pufr obsahující gunidinum thiocyanát a speciální vodou, saturovaný fenol. Touto metodou je možno izolovat pouze celkovou buněčnou RNA, avšak pro některé účely je třeba získat čistě mediátorovou RNA. V tomto případě je vhodné zakoupit komerční kit, jehož principem je selektivní vychytání mRNA pomocí jejich poly-A konce. Obecně při práci s RNA je třeba dbát úzkostlivé čistoty, protože je snadno degradovatelná všudypřítomnými RNáza mi.
Využití restrikčních enzymů
Restrikční endonukleázy jsou bakteriální enzymy štěpící DNA v přesné sekvenci 4 až 6 nukleotidů. Fungují jako specifické nůžky umožňující získání přesně definovaných DNA fragmetů pro nejrůznější účely. Prosté restrikční štěpení DNA a její elektroforéza je podstatou metody RFLP (viz níže).
===== Elektroforéza nukleových kyselin a proteinů =====
Touto metodou je možno rozdělit fragmenty nukleových kyselin (NK) či proteiny podle velikosti pomocí jejich mobility v elektrickém poli. Studovaný vzorek je vložen do agarozového (NK) nebo polyakryl amidového gelu (NK, proteiny) a díky svému zápornému náboji (NK mají přirozeně záporný náboj a u proteinů je zajištěn navázáním molekul dodecylsulfátu) putují ke kladné elektrodě. Migrace je však zpomalována síťovitou strukturou gelu, kdy velké fragmenty jsou brzděny proporcionálně více, a proto migrují pomaleji než menší. Během tohoto procesu dojde k separaci NK i proteinů do jednotlivých proužků. Ty mohou být vizualizovány pomocí různých fluorochromů v ultrafialovém světle přímo v gelu (NK) nebo DNA sondou či specifickou protilátkou po přenesení (blottingu) vzorku na membránu (NK, proteiny).
Southern, Northern, Western blotting
Southernův blotting je metoda popsaná Southernem v roce 1975, při které je možné přenést působením elektrického pole fragmenty DNA z gelu, kde byly rozděleny pomocí elektroforézy, na kladně nabitou nitrocelulózovou membránu a tam je vizualizovat. DNA, která přijde do kontaktu s nitrocelulózou, se k ní silně naváže a může být v této formě dlouhodobě uchovávána. Podobné metody sloužící k přenosu a analýze RNA a proteinů byly nazvány analogicky podle jména Southern jako Northern a Western analýza. Nejsou to tedy jména svých autorů.
===== Hybridizace nukleových kyselin =====
Jde o arteficiální spojení dvou vláken DNA (popřípadě vlákna DNA a RNA) na principu komplementarity bází obou vláken, kdy jedno vlákno je úsek analyzovaný a druhé vlákno je úsek o známé sekvenci – tzv. DNA sonda. Hybridizací a detekcí sondy je možné zjistit, zda hledaná sekvence je ve vzorku přítomna. Vzorkem může být parafínový řez, buněčná jádra či jednotlivé chromosomy (metoda FISH, viz níže) nebo membrány s přenesenou nukleovou kyselinou po elektroforéze. Pro správné napojení DNA sondy je třeba zajistit speciální podmínky, jejichž popis přesahuje možnosti rozsahu tohoto textu.
Produkce DNA sond a klonování
DNA sondy jsou radioaktivně, fluorescenčně či speciální sloučeninou značená vlákna DNA o délce desítek až stovek nukleotidů, které slouží k hledání komplementárních sekvencí ve zkoumaném vzorku. Mohou být připraveny umělou syntézou (oligonukleotidy o délce řádově desítek nukleotidů) či naznačením izolovaného DNA fragmentu (restrikční fragment nebo PCR produkt). Pro masívní a opakovanou produkci prób je vhodné žádanou sekvenci klonovat do bakteriálních plazmidů. Plazmidy jsou extrachromosomální kruhové molekuly DNA schopné autonomní replikace, které v baktériích fyziologicky kódují různé adhezní molekuly, proteiny odpovědné za rezistenci baktérií k antimikrobiálním látkám atd. Jejich vlastnosti umožňují využití pro klonování a množení žádané DNA. Nejdříve je plazmid rozštěpen pomocí specifické restrikční endonukleázy a je spojen cílovou DNA naštěpenou stejnou endonukleázou. Vzniká chimerický plazmid, který je schopen neomezené replikace v bakteriální kultuře. Po namnožení je plazmidová DNA izolována, cílová DNA opět restrikční endonukleázou vyštěpena a naznačena.
===== Polymerázová řetězová reakce =====
Vývoj PCR znamenal technologický zlom v molekulárně biologických metodách, protože znamenal nejen zvýšení senzitivity detekce DNA, ale zjednodušil amplifikaci DNA, která do té doby mohla být uskutečňována jen pomocí klonovacích technik. Podstatou metody je opakovaná denaturace dvoušroubovice DNA a dosyntetizování komplementárních řetězců. Denaturace probíhá při teplotách kolem 95 °C. Ná sle duje ochlazení reakční směsi na teplotu kolem 50 °C, kdy se k jednořetězcům DNA napojí primery-oligonukleotidy, které slouží jako specifická místa začátku polymerace. Cyklus se uzavírá dosyntetizováním komplementárního řetězce termostabilní polymerázou při teplotách kolem 70 °C. Dvacet až třicet cyklů znamená miliónové až miliardové zmožení žádaného úseku DNA (Obr. 1). Podobným způsobem může být amplifikována i v buňce transkribovaná mRNA, která však napřed musí být konvertována do sekvence DNA pomocí enzymu reverzní transkriptáza (RT). Tato modifikace PCR je označována jako RT-PCR.
Sekvenování DNA
Tímto termínem se rozumí zjištění přesné lineární sekvence nukleotidů v DNA. Pro diagnostické účely se používá metoda enzymová, kdy studovaný jednořetězec DNA je hybridizován s radioaktivně značeným primerem a podroben polymeraci ve čtyřech oddělených zkumavkách s normálními nukleotidy s příměsí dideoxynukleotidů (odděleně adenin, thymin, guanin, cytosin). Dideoxy-modifikace nukleotidu znamená, že není možné k němu napojit další nukleotid a polymerace v místě jeho začlenění do syntetizovaného řetězce končí. Takto se pomocí náhodného ukončování polymerace získají čtyři směsi fragmentů ukončených ve všech pozicích adeninu, thyminu, cytosinu nebo guaninů původního jednořetězce. Jednotlivé směsi jsou rozděleny v polyakrylamidovém gelu a sekvence nukleotidů je možné po autoradiografii odečíst (Obr. 2). Moderní automatické sekvenátory provádějí sekvenační reakci v jedné zkumavce s fluorescenčně značenými dideoxynukleotidy, jejichž průchod polyakrylamidovým gelem je pak monitorován laserem a počítačově je přímo vyhodnocena sekvence nukleotidů.
===== Aplikace obecných metod v diagnostice a výzkumu =====
Vesměs jde o hledání mutací či specifických produktů asociovaných s některou chorobou. Mutace DNA jsou změny (variace) v sekvenci nukleotidů a mohou být dvojího druhu: bodové mutace znamenají chybění nebo výměnu jednoho páru bází, zatímco delece, inzerce a duplikace znamenají ztrátu nebo získání delšího úseku genetické informace. Přibližně 23 % bodových mutací se klinicky nijak neprojevuje, jde o tzv. němé mutace. Je to způsobeno buď tím, že výměnou jedné báze za druhou nedojde ke změně smyslu tripletu kódujícího konkrétní aminokyselinu, nebo že změnou aminokyseliny nedojde ke změně struktury nebo aktivity výsledného proteinu. Asi 73 % bodových mutací je spojeno s alterací struktury nebo funkce proteinu (tzv. „missense“ mutace) a jen 4 % bodových mutací indukuje ukončení (terminaci) translace, tím že substitucí báze vznikne tzv. „stop codon“ („nonsense“ mutace). Protože genetický kód je založen na tripletech bází, každá ztráta nebo získání bází, které není dělitelné třemi, vede k totální změně smyslu genetického kódu a k syntéze aberantních proteinů. Detekce mutací je možná mnoha technikami. Zde uvádíme:
===== Hybridizace alelově specifických oligonukleotidů (ASO) =====
Lze použít pro případy, kdy je zjišťována přítomnost známé bodové mutace spočívající ve výměně jednoho nebo dvou nukleotidů. Jde o hybridizaci PCR produktu navázaného na membránu v denaturovaném stavu s oligonukleotidovými sondami specifickými pro známou mutaci.
Metoda SSCP (Single-Strand Conformation Polymorfism)
Jde o jednu z nejčastěji užívaných technik pro detekci mutací. Nemutovaná DNA (tzv. „wild“ typ DNA) a analyzovaná DNA jsou nejdříve amplifikovány pomocí PCR a pak denaturovány. Získané molekuly jednořetězcové (single-strand) DNA vytvářejí specifické trojrozměrové struktury závislé na sekvenci nukleotidů v DNA. Pokud tyto molekuly migrují v elektrickém poli přes nedenaturující gel, je jejich migrace závislá na konformační struktuře. Pokud je v testované DNA (úseku či fragmentu DNA) přítomna mutace, bude se oproti nemutované formě lišit svou migrační schopností a její vizualizované pásy (bandy) se nebudou krýt. Senzitivita SSCP je okolo 70–90 % pro fragmenty DNA menší než 200 párů bází, avšak rapidně klesá, pokud fragmenty mají velikost blížící se 400 párům bází.
===== Analýza heteroduplexů DNA =====
Tato technika závisí na faktu, že pokud jsou PCR produkty mutovaného i normálního vzorku podrobeny společné denaturaci a opětovné renaturaci, tak dochází také k vzájemnému spojení mutované i normální DNA (tzv. heteroduplexy). Tyto heteroduplexy migrují při elektroforéze v polyakrylamidovém gelu jinak než homoduplexy. Senzitivita této metody je podobná SSCP a klesá při užití fragmentů větších než 300 párů bází.
Zvýšení senzitivity je možné elektroforézou hetero-homoduplexů v denaturující gradientové gelové elektroforéze (DGGE). Z důvodu neúplného párování dvou rozdílných řetězců je stabilita heteroduplexu nižší než u homoduplexu (dva stejné, plně homologické jednořetězce), a tak se budou rozpojovat v gradientovém gelu dříve, což se projeví v mobilitě detekovaných proužků. Heteroi homoduplexy jsou u této metody opatřeny pomocí PCR na jednom konci asi 40 páry G-C, které mají vysokou stabilitu a zabrání úplnému oddisociování jednořetězců. DGGE je jednou z nejsenzitivnějších metod pro detekci mutací, protože je pomocí ní možné určit až 100 % mutací ve fragmentech až 600 párů bází.
Přímé sekvenování
Je nejpřesnější metodou pro detekci mutací. Dává bezprostřední informaci o povaze mutace. Prakticky se metoda dá používat zejména pro analýzu malých genů nebo malého souboru pacientů.
===== Metoda RFLP (Restriction Fragment Length Polymorfism) =====
Prvním využitím této metody je detekce bodových mutací, které způsobí vznik nebo zánik restrikčního místa určité restriktázy. Po restrikčním štěpení a elektroforetickém rozdělení normální a mutované DNA vzniknou charakteristická rozdílná spektra proužků o různé délce (např. při mutaci způsobující vznik dalšího restrikčního místa bude jeden proužek normální DNA rozdělen u mutovaného vzorku v proužky dva). Druhá aplikace využívá existence tzv. mikrosatelitů. V chromosomech nejsou obsaženy jen geny exprimující se do určitých proteinů, ale překvapivě obsahují hlavně nekódující sekvence, mezi něž patří i mikrosatelity. To jsou různě dlouhé úseky DNA složené z tandemových repeticí (krátké sekvence nukleotidů, které se za sebou stále opakují), které jsou u každého jedince (s výjimkou jednovaječných dvojčat) různě dlouhé a v genomu různě rozložené. Při určitém restrikčním štěpení tak vzniká pro každého jedince charakteristické spektrum proužků, čehož se využívá v paternitních sporech a soudním lékařství (odtud název DNA otisky analogicky podle otisků prstů). V lékařství má tato metoda využití hlavně pro detekci alel způsobujících dědičné choroby. Jednotlivé alely jsou totiž asociovány s různě dlouhými mikrosatelity, způsobujícími charakteristické spektrum po restrikční analýze úseku chromosomu, který byl amplifikován pomocí PCR.
In situ hybridizace, fluorescenční in situ hybridizace (ISH, FISH)
Tato technika umožňuje zjišťování přítomnosti a lokalizace jisté sekvence DNA nebo RNA přímo v buňkách, tkáních nebo izolovaných chromosomech a vychází z klasické hybridizace nukleových kyselin. Při fluorescenčním naznačení sondy je možné pozorovat signál fluorescenčním mikroskopem přímo v buněčném jádře a detekovat hrubé změny genomu – chromosomální aberace (translokace, inverze, aneuploidie ap.).
===== Srovnávací genomová hybridizace (CGH – Comparative Genomic Hybridization) =====
Tato metoda umožňuje komplexní analýzu DNA z patologického vzorku, nejčastěji z nádorových buněk, u kterých se výrazně projevuje nestabilita genomu. Dva vzorky DNA (analyzovaná a normální) jsou označeny rozdílnými fluorochromy, a pak jsou hybridizovány k třetímu, normálnímu vzorku lidských chromosomů nacházejících se v metafázi buněčného dělení. Fluorescenční signály jsou kvantifikovány pomocí obrazové analýzy a je určen poměr signálu obou fluorochromů po celé délce určitého chromosomu (Obr. 3). Je tak možné zjistit, zda v DNA izolované z patologické léze dochází v určitých oblastech genomu k nadměrnému zvýšení signálu (abundantní genetická informace), nebo naopak k jeho snížení (ztráta genetické informace). Modifikace této metody, při které DNA z nádorové tkáně je nejdříve amplifikována pomocí DOP-PCR (DOP – degenerate oligonucleotide primed), může být použita i na formalínem fixovaných a do parafínu zalitých vzorcích tkáně.
DNA čipy („microarray“ analýza DNA)
Tato technologie umožňuje získat komplexní informaci o aktuálním stavu buněk. Přesněji, v jednom kroku dostaneme odpověď, které mRNA (a tím i které proteiny) jsou v daných buňkách právě syntetizovány. Na podložním sklíčku či membráně o několika čtverečních centimetrech jsou speciální technologií naneseny desetitisíce až statisíce DNA sond. K tomuto sklíčku či membráně se hybridizuje vzorek srovnávací mRNA značený jedním fluorochromem a zároveň lyzát studovaných buněk obsahující mRNA značenou druhým fluorochromem. Fluorescenční signály jsou počítačově vyhodnoceny a podle jejich poměrů (podobně jako u CGH, viz výše) usuzujeme jednak na přítomnost určité mRNA a zároveň na její kvantitu. Tato metoda je zatím velice nákladná a doménou pouze základního výzkumu, ale je velkým příslibem do budoucnosti, protože umožňuje současnou analýzu tisíců genů z minimálního množství vzorku.
===== Metody molekulární histopatologie =====
Zahrnují aplikace molekulárně biologických metod, které je možné provádět na tkáňových řezech, přímo na podložních sklech. Patří mezi ně řada výše popsaných metod sloužících k analýze genové exprese na úrovni DNA a RNA, dále metody sloužící k analýze exprese na úrovni proteinů (zejména metody založené na imunohistochemickém a imunocytochemickém detekčním principu) a metody sloužící k analýze proliferační a apoptotické kinetiky (imunocytochemický průkaz proteinů buněčného cyklu, inkorporace značených nukleotidů, detekce zlomů DNA např. pomocí metody TUNEL či ISEL, detekce substrátů enzymů zapojených do efektorové fáze apoptózy atd.). Podrobnější popis těchto technik přesahuje rozsah tohoto článku.
1. DARNEL, J., LODISH, H., BALTIMORE, D. Molecular cell biology. 2nd ed., Scientific American Books Inc., 1990.
2. MacDONALD, F., FORD, CHJ. Molecular Biology of Cancer. Bios Scientific Publishers, 1997.
3. SAMBROOK, J., FRITSCH, EF., MANITIAS, T. Molecular cloning. A laboratory manual. New York : Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989.
e-mail: matejiko@tunw.upol.cz
Literatura
**