Prof. MUDr. Vladimír Palička, DrSc.1, 2, doc. MUDr. Pavel Živný, CSc.1, 2, MUDr. Pavla Řehořková1, MUDr. Antonín Pohlídal3
1Univerzita Karlova v Praze, FN Hradec Králové, Osteocentrum
2Univerzita Karlova v Praze, FN Hradec Králové, Ústav klinické biochemie a diagnostiky
3FnsP Ostrava, Ústav klinické biochemie
Klíčová slova
kostní remodelace • osteoklasty • osteoblasty • RANKL • osteoprotegerin
Metabolická onemocnění skeletu patří k nejčastějším chorobám civilizované populace a se stoupajícím průměrným věkem bude stoupat i výskyt osteoporózy, která je jejich nejčastějším a nejvýznamnějším představitelem. Již dnes postihuje osteoporóza 5–8 % populace a výskyt jejích komplikací, především zlomenin proximálního femuru, neustále stoupá. Přes pokroky v diagnostice a možnostech velmi účinné léčby lze podle předpokladů SZO počítat v příštích padesáti letech se zdvojnásobením této nejzávažnější komplikace. Ekonomicky představuje osteoporóza a její léčba jednu z největších kapitol rozpočtů plátců zdravotní péče. Každý pokrok v bližším poznání patofyziologie a patobiochemie kostní remodelace nejen zvyšuje medicínské poznání, ale otevírá současně možnosti pro nové účinné metody léčby.
Základy patobiochemie kostní remodelace a možnosti jejího sledování byly podrobně studovány v minulých dvou desetiletích a přinesly množství možností sledování rychlosti kostní přestavby a rovnováhy v syntéze a degradaci kostní tkáně. Laboratorní metody sledování jsou přínosné především v časném zjištění osob s nadměrně rychlou přestavbou kosti, a tedy rizikem rychlé ztráty kostní hmoty (fast losers), a velkou výhodu poskytují v možnostech sledování účinnosti terapie osteoporózy. Parametry typu kostního izoenzymu alkalické fosfatázy, osteokalcinu, propeptidů a telopeptidů kolagenu či jeho degradačních produktů jsou samozřejmě zatíženy mnoha problémy metodickými, ale především velkou intraindividuální variabilitou, která ztěžuje klinickou interpretaci výsledků(2). Přesto jsou dosud nejlépe dostupným a hojně využívaným způsobem. Řízení kostní remodelace je zajišťováno především působením hormonů a lokálních autokrinních a parakrinních působků(6, 12).
Kostní remodelace probíhá na mnoha místech skeletu současně v tzv. základních multicelulárních jednotkách (basic multicellular units – BMU), tvořených osteoklasty a osteoblasty. V posledních letech se objevila řada nových poznatků o regulaci dozrávání, aktivace a aktivity těchto buněk. Osteoblasty pocházejí z mezenchymálních kmenových buněk kostní dřeně, ze kterých mohou diferencovat i chondroblasty, fibroblasty, myoblasty a také adipocyty. Osteoklasty vycházejí z monocyto-makrofágové linie a z širšího pohledu tedy patří do skupiny imunokompetentních buněk. Faktory, které stimulují diferenciaci kmenových buněk, jsou z velké části produkovány přímo osteoblasty nebo osteoklasty. V současné rovině poznání převládají údaje potvrzující především aktivní roli osteoblastů v řízení aktivity osteoklastů. Faktory, které stimulují kostní resorpci, ať již systémové (parathormon, 1,25-dihydroxyvitamín D3), nebo lokální typu interleukinů a prostaglandinů, reagují s receptory osteoblastů a indukují tvorbu lokálních působků regulujících maturaci a aktivaci osteoklastů. Identifikace tří základních lokálních faktorů – osteoprotegerinu, receptoru-aktivátoru nukleárního faktoru kB a jeho ligandu – přinesla bližší poznání vzájemného ovlivnění osteoblastů a osteoklastů.
RANKL – ligand pro receptor-aktivátor nukleárního faktoru kB – je produkován osteoblasty. Patří do rodiny TNF. V počátku byl nazýván osteoklasty-diferencující faktor, což do značné míry vystihuje jeho hlavní roli v organismu. Je produkován osteoblasty v solubilní formě a v membránově vázané formě. Jeho vazba na receptor (RANK) na povrchu osteoklastů a jejich prekurzorů vede k aktivaci diferenciace, maturace a vzniku nových osteoklastů a současně stimuluje i jejich osteolytickou aktivitu.
RANKL je secernován rovněž T-lymfocyty a původně se myslelo, že je produkován pouze lymfatickými orgány a T-buňkami(5). Závažnou skutečností je, že RANKL je produkován i buňkami mnoha typů tumorů s osteolytickými metastázami. Produkce RANKL vede k diferenciaci preosteoklastů z kmenových buněk, k jejich maturaci a fúzi a následně i k aktivaci. Aktivované osteoklasty, paralelně stimulované M-CSF (makrofágy stimulujícím růstových faktorem), pak uzurují kost a přispívají tak ke vzniku osteolytických metastatických ložisek.
OPG – osteoprotegerin je rovněž produkován osteoblasty. Je solubilním produktem, který je schopen jako blokující receptor vázat RANKL a zabránit tak jeho působení na osteoklasty a jejich prekurzory. Byl také dříve nazýván osteoklastogenezi inhibující faktor, což dobře vystihovalo jednu z jeho rolí. Patří do rodiny TNF-receptorů, nemá žádnou transmembránovou doménu a nemá ani sekvenci, která by charakterizovala možnost transdukce signálu. Bývá proto nazýván blokujícím receptorem. Svým blokačním účinkem na diferenciaci a aktivaci osteoklastů zabraňuje například hyperkalcémii, vyvolané účinkem parathormonu nebo vitamínu D3.
Osteoprotegerin je bazický glykoprotein se čtyřmi potenciálně N- -glykosidačními místy. Je secernován jako 55 kD glykoprotein, který je intracelulárně konvertován na disulfidicky vázaný dimer o molekulové hmotnosti asi 110 kD. Může existovat i jako trimer, predominantní extracelulární forma je však dimerická(5).
Koncentrace osteoprotegerinu v krevním séru koreluje s kostní denzitou v krčku femuru a celém proximálním femuru (p je stimulována 17b-estradiolem aktivací estrogenového receptoru alfa. Podobný efekt mají i fytoestrogeny typu genisteinu(11). Stoupá i po frakturách v procesu hojení kosti se dvěma koncentračními peaky: jedním bezprostředně (během 24 hodin) po zlomenině a druhým v období tvorby chrupavky(4). Podobně stoupá i produkce RANKL, ale s jiným časovým rytmem.
Utlumená tvorba osteoprotegerinu je jedním z vyvolávajících faktorů kortikoidy indukované osteoporózy. Glukokortikoidy současně indukují tvorbu RANKL, což výrazně zvyšuje poměr RANKL: osteoprotegerin, stimuluje ještě více kostní resorpci a je pravděpodobně odpovědné za rychlou ztrátu kostní hmoty v počátku léčby kortikoidy. Myši s blokádou tvorby osteoprotegerinu, a tedy nadměrným množstvím volného RANKL, mají těžkou osteoporózu jako výsledek dysbalance mezi těmito dvěma regulátory aktivity osteoklastů. V pokusech na zvířatech je osteoprotegerin velmi účinným terapeutickým faktorem v blokádě kostní resorpce u osteoporózy nebo osteolytických kostních metastáz(7). Existují i předběžné výsledky studie u žen s postmenopauzální osteoporózou, dokladující, že subkutánní injekce osteoprotegerinu snižuje kostní resorpci, a to v přímé závislosti na podané dávce(1).
Mimo pleiotropní funkce v metabolismu kostí má osteoprotegerin také četné jiné, mnohdy překvapující účinky v organismu. U knock outovaných myší s fenotypem –/– OPG se vyvíjejí masívní kalcifikace velkých cév již dva týdny po narození. Kalcifikace jsou většinou lokalizovány v medii cévní stěny, kde je normálně OPG exprimován. Nejsou však provázeny aterosklerotickými plaky. OPG rovněž ovlivňuje přežívání endotelií in vitro. Deprivace produkce OPG spojená s inaktivací NFkB signálu vede k apoptóze endotelií, která je blokovatelná vysokými dávkami osteoprotegerinu(5). Na druhé straně produkce osteoprotegerinu je stimulována vazbou integrinu anb3 s osteopontinem, což představuje silný anti-apoptotický signál pro endoteliální buňky(3).
Na povrchu osteoklastů a jejich prekurzorů lokalizovaný RANK- -receptor, který je současně aktivátorem nukleárního faktoru kB, reaguje s RANKL, a tato vazba spouští kaskádu intracelulárních dějů vedoucích k transkripční aktivitě v osteoklastech, a následně ke kostní resorpci. Mezi intracelulárními působky, které sehrávají významnou roli v přenosu a multiplikaci signálu uvnitř osteoklastu, patří mimo jiné non-receptorová tyrozinová kináza Src.
Src hraje významnou roli v proliferaci osteoklastu, jeho adhezi ke kostnímu povrchu, ale současně i v jeho schopnosti mobility. Je prototypem „rodiny“ kináz uvnitř buňky, do které patří celkem osm členů: Src, Fyn, Yes, Fgr, Hck, Lyn, Lck a Blk. Její aktivita je vázána na mnoho intracelulárních membrán, na kterých zprostředkovává přenos fosfátové skupiny z ATP na tyrosinové zbytky v různých proteinech. Vysoká koncentrace Src se vyskytuje v mozkových buňkách, krevních destičkách a osteoklastech. Arteficiálně vyvolaný deficit Src u pokusných zvířat však nevyvolá detekovatelné změny funkce CNS ani poruchu krevní srážlivosti. Projeví se však defektem kostní resorpce, který vede až ke vzniku osteopetrózy. Je nepochybně zajímavou informací, že Src je současně protoonkogenem a u fibroblastů může vést k transformaci buněk do tumorového fenotypu. U lidských tumorů se Src pravděpodobně podílí na růstu tumorů ve spolupráci s receptorovými tyrozinovými kinázami, např. ErbB rodiny či c-Met. Receptory ErbB aktivují STAT3 (signálový transduktor a aktivátor transkripce 3) cestou Src kinázy a vyvolávají transformaci buňky. Není tedy vyloučeno, že blokáda Src aktivity by mohla být použita i k blokaci růstu maligních buněk, např. karcinomu mamy(10).
Src sehrává ovšem významnou roli v buněčné adhezi, což je v případě aktivity osteoklastů jeden z klíčových momentů jejich činnosti. Adheze osteoklastů ke kostní matrix je zprostředkována především integriny, speciálně integrinem anb3. Složitá signálová cesta je zprostředkována tyrozinovými kinázami typu Fak a Pyk2 a Src, které regulují tvorbu aktinových vláken. U aktivních osteoklastů Src sehrává roli v tvorbě „sealing zóny“, což je kruh polymerizovaného aktinu, který odděluje zónu pod resorbujícím osteoklastem od okolí, a umožňuje tak koncentraci aktivních působků do resorpční kavity a současně chrání okolí. Src má navíc roli v motilitě osteoklastů. Cyklickou aktivací a deaktivací tato sada tyrozinových kináz umožňuje adhezi „přední části“ osteoklastu a aktivací aktinových a stresových fibril pak přisunutí zbytku buňky. Následná deaktivace uvolní adherovanou část a umožní její posun směrem kupředu. Tato role Src v motilitě buněk není ovšem omezena jen na osteoklasty, ale týká se např. i prekurzorů buněk hladké svaloviny v odpovědi na PDGF (platelet-derived growth factor) produkovaný buňkami endotelu během vazogeneze.
Aktivní role osteoklastů v resorpci kosti je závislá na intracelulárním transportu působků, a to jak ve smyslu endocytózy, tak exocytózy. Cestou vezikulo-vakuolárních organel reguluje Src vstup látek do osteoklastu, ale také exocytózu proteáz do aktivní resorpční zóny. Potlačení membránově asociované Src v cytoskeletonu pomocí 17b-estradiolu snižuje genovou expresi lyzosomálních enzymů v osteoklastech a jejich sekreci do aktivní oblasti(8). Zdá se, že Src sehrává významnou roli i v přežívání osteoklastů, které je rovněž ovlivněno RANKL a RANK. Transmembránová signalizace zprostředkovaná RANK vede k aktivaci TRAF-6 (tumor necrosis factor receptor-asociovaného faktoru 6) a proteinové kinázy B, zprostředkované Src. Aktivovaná proteinová kináza B může blokovat aktivitu kaspázy 3, a tím inhibovat apoptózu osteoklastů.
Tato extrémní mnohočetnost účinků Src na tvorbu, aktivaci, adhezi, migraci, aktivitu i přežívání osteoklastů vede samozřejmě k úvahám o možném terapeutickém využití jejího ovlivnění. Inhibici této kinázy je možno dosáhnout např. herbimycinem či syntetickými inhibitory typu pyridopyrimidinů a jiných. Selektivita inhibice je velmi důležitá, především pro mnohočetnost účinků Src v organismu. Znalost skutečnosti, že myši deficitní v Src mají inhibovanou kostní resorpci až ke vzniku osteopetrózy, a znalost toho, že deficit Src vede k absenci aktivní formy buněčné membrány v místě resorpce kosti (ruffled membrane), ústí ve snahu ovlivnit zvýšenou kostní resorpci u osteoporózy terapeuticky blokádou aktivity Src. V současné době jsou známy specifické inhibitory Src v osteoklastech, které v pokusech na zvířatech deklarují terapeutický efekt. Zdá se, že inhibice Src by vedla nejen k blokádě tvorby „ruffled border“ osteoklastů, ale i blokádě RANKL ovlivňovaného přežívání osteoklastů, a dokonce i formaci osteoklastů z prekurzorů(10).
Bližší poznání lokálních dějů v těsné mezibuněčné komunikaci osteoblastů a osteoklastů a především poznání intracelulárních dějů, jejichž ojedinělé momenty byly v této práci zmíněny, tak může přispět i k novým, velmi účinným terapeutickým postupům, které navíc budou specificky zaměřeny na cílovou oblast.
Literatura
1. BEKKER, PJ., HOLLOWAY, A., NAKANISHI, A. Osteoprotegerin (OPG) has potent and sustained antiresorptive activity in postmenopausal women. J Bone Miner Res, 1999, 14, S180.
2. FRIEDECKÝ, B., PALIČKA, V., ŽIVNÝ, P., JABOR, A. Laboratorní metody při osteoporóze. Postgraduální medicína, 2000, 2, s. 323–327.
3. HOFBAUER, LC., SCHOPPET, M. Osteoprotegerin: a link between osteoporosis and arterial calcification? Lancet, 2001, 358, p. 257–259.
4. KON, T., CHO, TJ., AIZAWA, T., et al. Expression of osteoprotegerin, receptor activator of NF-kB ligand (osteoprotegerin ligand) and related proinflammatory cytokines during fracture fealing. J Bone Miner Res, 2001, 16, p. 1004–1014.
5. KOSTENIUK, PJ., SHALHOUB, V. Osteoprotegerin: a physiological and pharmacological inhibitor of bone resorption. Curr Pharmaceut Design, 2001, 7, p. 613–635.
6. PALIČKA, V., JABOR, A., FRIEDECKÝ, B., ŽIVNÝ, P. Selected markers of bone biochemistry. Adv Clin Chem, 2000, 35, p. 255–294.
7. PAPAPOULOS, SE. Catabolic and anabolic signals in bone: therapeutic implications. Curr Opin Clin Nutr Metabol Care, 2001, 4, p. 191–196.
8. PASCOE, D., OURSLER, MJ. The Src signaling pathway regulates osteoclast lysozomal enzyme secretion and is rapidly modulated by estrogen. J Bone Miner Res, 2001, 16, p. 1028–1036.
9. ROGERS, A., SALEH, G., HANNON, RA., et al. Circulating levels of osteoprotegerin are inversely related to biochemical markers of bone turnover measured in serum in a population based cohort of postmenopausal women. J Bone Miner Res, 2001, 16, F300 (abstract).
10. SUŠA, M., MISSBACH, M.,GREEN, J. Src inhibitors: drugs for the treatment of osteoporosis, cancer or both? Trends Pharmacol. Sci, 2000, 21, p. 489–495.
11. VIERECK, V., GRUENDKER, C., BLASCHKE, S., et al. The phytoestrogen genistein stimulates the production of osteoprotegerin by human trabecular osteoblasts. J Bone Miner Res, 2001, 16, SA185 (abstract).
12. ŽIVNÝ, P., PALIČKA, V. Patobiochemie metabolických chorob kostí. Postgraduální medicína, 2000, 2, p. 309–414.
palicka@lfhk.cuni.cz