Genová terapie nádorů

Genová terapie je jedním z nejnadějnějších důsledků vstupu molekulové biologie do medicíny. Její postupné zavádění však provázejí nemalé problémy. Hlavní brzdou rychlého rozvoje je nedostatečnost současných vektorů. Z tohoto důvodu se velká část probíhajícího výzkumu zaměřuje na jejich zdokonalení.

Souhrn

V současné době se genová terapie nejvíce uplatňuje v onkologii, ve které existuje nejméně zábran pro její využití. Nabízí se řada postupů vhodných pro její uplatnění. Asi nejvíce perspektivní je vývoj genetických terapeutických vakcín, jež by se mohly uplatnit v léčbě nádorů v širším měřítku již v průběhu příštích pěti let. Postupné řešení problémů genové terapie může sloužit jako příklad toho, jak je neospravedlnitelné v současném biomedicínském bádání oddělovat základní a aplikovaný výzkum.

Summary

Vonka, V. Gene therapy of cancer

Gene therapy is one of the most fascinating consequences of the penetration of molecular biology into medicine. However, its introduction is associated with serious problems. The main obstacle preventing a more rapid development is the insufficiency of the present vectors. For this reason a significant portion of the contemporary research in the field of gene therapy aims at their improvement. In the present time gene therapy is mostly being used in oncology, where the barriers against its employment are weaker than in the other medical disciplines. In addition, there is a number of strategies which can be applied. For the next period the development of genetic therapeutic cancer vaccines seems to be the most promising. The gradual solution of gene therapy problems may serve as an example how unjustified are the efforts to separate basic and applied research in the conpemporary medical sciences.

Genová terapie (GT) je nový léčebný postup, který využívá jako aktivního činitele sekvence nukleových kyselin. Obvykle se definuje jako přenos genetického materiálu, který má léčebný účinek. Děje se tak proto, že cílovým buňkám nějakou novou funkci přidává anebo jim nějakou nežádoucí funkci odnímá. GT nepochybně představuje jeden z nejvýznamnějších a nejnadějnějších důsledků průniku molekulové biologie a genového inženýrství do medicíny. Společně s paralelně se rozvíjející buněčnou terapií patří k nejvíce diskutovaným novým léčebným postupům a oba léčebné postupy vyvolávají rozporuplné reakce u laické i odborné veřejnosti. Přesto, že se ani zdaleka nepodařilo naplnit velká očekávání, která byla s GT spojována na začátku 90. let, zdá se však být jistým, že v blízké budoucnosti výrazně ovlivní lékařskou praxi, zejména pak léčbu těch patologických stavů, které nejsou současnými prostředky účinně léčitelné. Ačkoli původním hlavním záměrem GT byla léčba monogenních dědičných chorob, v současné době převažuje zájem o choroby získané. Mezi nimi dominují zhoubné nádory. Jich se týkají přibližně tři čtvrtiny všech dosud provedených klinických studií. Důvodů pro to, že se onkologie stala hlavní doménou GT, je několik. Jsou shrnuty v Tab. 1.

Tab. 1 – Důvody pro preferenční uplatnění genové terapie v onkologii

Problémy současné GT jsou značné. Můžeme je rozdělit do tří kategorií – na technické, metodické a etické. Bude třeba se s nimi vyrovnat, alespoň z velké části, před tím, než bude možné povýšit GT na součást rutinní terapie. Dříve než se pustíme do jejich popisu, je nutné objasnit několik termínů, které se budou vyskytovat v následujícím textu a které asi nejsou blízké všem čtenářům. Gen, který se přenáší, se označuje jako transgen. Přenašeče genů nazýváme vektory, mezi nimiž velmi důležitou roli hrají plasmidy, což jsou malé, cirkulární, nezávisle se replikující genetické elementy bakteriálního původu. Termín transfekce popisuje přenos cizího genu prostředGenová nictvím „nahé“ DNA. Proces přenosu genů označujeme jako transdukci, její pomocí pozměněnou buňku jako transdukovanou. Vnesený genetický materiál přetrvává v buňce velmi často v podobě episomu, což je cirkulární extrachromosomální, nezávisle se pomnožující genetický element. V transdukované buňce zůstávají v episomální formě plasmidy, ale v případě některých virů i genetický materiál vnesený virovými vektory. Jako transpozony se označují krátké mobilní sekvence nukleových kyselin, které se mohou replikovat a začleňovat do nahodilých míst buněčného genomu.

Problémy technické

Hovoříme-li o technických problémech GT, máme zpravidla na mysli problémy vektorů. Ty mají zásadní význam pro účinnost transdukce a její důsledky pro buňku, ale též pro rizika s ní spojená. Stávající nedokonalost vektorů je hlavní brzdou rychlejšího rozvoje GT.
Jak by měl ideální vektor vypadat? Jeho vlastnosti jsou popsány v Tab. 2. Vektor, který by splňoval všechny uváděné požadavky, není dosud k dispozici. Vývoji nových přenašečů genetického materiálu, které by se přiblížily vytčenému ideálu, se věnuje mimořádné úsilí. Mnozí jej dokonce považují za nejdůležitější složku veškerého současného výzkumu v oblasti GT. Užívané vektory se nyní obvykle dělí na nevirové a virové, které se liší nejen svou povahou, ale i postupy užívanými pro jejich vpravení do buňky. Nejužívanější z nich jsou v Tab. 3.

Tab. 2 – Ideální virový vektor

Tab. 3 – Nejužívanější vektory

Jako nevirové vektory označujeme „nahou“ DNA ve formě nelinearizovaných či linearizovaných plasmidů, které se do buněk vnášejí fyzikálními či chemickými postupy, případně jejich kombinací. Zvláště oblíbené a účinné jsou tzv. lipofekce, které využívají spojení DNA s kationickými lipidy. Vzniklé liposomy, označované též jako lipoplexy, splývají s buněčnou membránou a vstupují do buňky. Jiná technika, která využívá spojení DNA s různými polymery, se nazývá polyplexe. Cílem je usnadnit endocytózu zprostředkovanou buněčnými receptory a zvýšit stabilitu DNA. Vzrůstající pozornost se věnuje tzv. hydrodynamické metodě využívané zvláště při systémovém podání v experimentálních systémech. Zvýšení intravenózního tlaku, jehož se dociluje rychlým podáním relativně velkého množství tekutiny, výrazně zefektivňuje účinnost transdukce. Hlavními výhodami vektorů založených na plazmidech je nízká toxicita, nízká imunogennost a snadnost přípravy. Jejich nevýhodami jsou malá stabilita in vivo, nízká účinnost (zvláště při systémovém podání) a obtíže s orgánovým zacílením. K integraci transgenu do buněčného genomu dochází jen vzácně, a exprese z episomální DNA je většinou krátkodobá. Na vylepšení nevirových vektorů se intenzívně pracuje.(1)

Tab. 4 – Vlastnosti nejužívanějších virových vektorů

Mnoho nadějí se spojuje s nově zaváděnými vektory na bázi transpozonů, z nichž nejznámější nesou romantická pohádková jména jako Spící kráska (Sleeping Beauty)(2) či Žabí princ (Frog Prince).(3) Naděje budí i možné využití bakteriofágových integráz,(4) což jsou enzymy zajišťující integraci cizí DNA do buněčného genomu. Zkouší se i hybridní vektory virus-transposon, jež by spojily výhody obou typů vektorů.(5) Ve většině klinických studií bylo – a prozatím stále je – využíváno virových vektorů. Přehled a základní vlastnosti nejužívanějších z nich jsou v Tab. 4. Mají před nevirovými vektory tři základní výhody. První z nich je skutečnost, že jejich povrchové struktury je předurčují k interakci s receptory buněčného povrchu a vnesení genetického materiálu do buňky. Za druhé, genetický materiál viru je vybaven regulačními elementy, které buňka snadno rozpozná. Konečně za třetí, některé viry umožňují integraci cizího genetického materiálu do buněčného genomu, což zajišťuje dlouhodobou expresi transgenu. Naopak, virové vektory mají několik podstatných nevýhod. Za prvé, jejich konstrukce je náročný proces, proveditelný pouze ve vyspělé virologické laboratoři.

Za druhé, většina virů je silně imunogenních, což je na překážku opakovanému použití týchž vektorů. Za třetí, malé rozměry virů omezují velikost genetického materiálu, který jsou schopné přenést. Za čtvrté, biologická rizika spojená s virovými vektory jsou daleko vyšší než u nevirových vektorů. Ta sice snižuje, ale neodstraňuje skutečnost, že jsou geneticky upraveny tak, aby pozbyly schopnosti se množit. Toho se dosahuje delecí části původního virového genomu. Defektní virové partikule se pro transdukci připravují na patřičně geneticky pozměněných buněčných liniích, které dodají chybějící funkce potřebné pro vznik virových částic, ale nejsou s to vytvořit částice infekční. Všechny z několika tragických událostí, k nimž došlo v minulosti při GT (vesměs šlo o terapii vrozených chorob), byla zaviněna neinfekčními, tj. reprodukce neschopnými virovými vektory.(6, 7) Dodejme, že z železného pravidla neinfekčnosti virů užívaných při GT existují dvě výjimky. Prvním jsou onkolytické viry, jejichž účinek je založen právě na replikaci viru vedoucí ke zničení nádorové buňky.

Druhou představují živé oslabené rekombinantní viry experimentálně používané jako protinádorové terapeutické vakcíny. Přesto, že virové vektory mají velkou transdukční účinnost, problémem může být jejich přirozený široký tkáňový tropismus. Značné úsilí se zaměřuje na modifikace virových vektorů, jež by zvýšily tkáňovou specifitu. Ta hraje velkou úlohu zvláště při systémovém podání vektoru. Pro řešení se nabízí široké spektrum možností.(8) Vývoj se ubírá hlavně dvojí cestou. Jeden směr usiluje o využití specifických receptorů, čehož se dociluje tak, že se úpravou virového genomu začlení do povrchových struktur virových částic příslušná liganda. Mluví se o transdukčním zacílení. Jinou možností je začlenění promotoru, který je rozpoznán pouze v cílové buňce. Takové zacílení se označuje jako transkripční. Intenzívně se bádá nad přípravou virových vektorů se sníženou imunogenností. Příkladem může být tzv. gutless (česky bychom mohli říci „vykuchaný“) adenovirus.(9) Hodně pozornosti se v poslední době věnuje vývoji tzv. umělých virových vektorů, jejichž příprava spadá mezi nanotechnologie. Jde o poměrně složité konstrukty napodobující strukturu virových částic. Mnozí jim přisuzují velkou budoucnost. Svými vlastnostmi by se měly přiblížit ideálu vylíčenému v Tab. 2.

Vzrůstá však i zájem o biologické vektory jiné, než jsou virové částice.(10, 11) Jde především o některé baktérie, jako je třeba Listeria monocytogenes, které byly genetickou manipulací zbaveny patogenity, ale nikoli schopnosti proniknout do buněk. Takové systémy, náležitě geneticky upravené, by mohly zajistit dlouhodobou expresi transgenu bez toho, že by došlo k vývoji silných imunitních reakcí namířených proti vektoru. Velkou výhodou je, že při perzistentní infekci – buď nitrobuněčné, nebo probíhající v mezibuněčném prostoru – by mohla být tvorba žádaného proteinu regulována a – nastala-li by potřeba – mohla by se ukončit pomocí antibiotik. Dalšími výhodami jsou velká kapacita baktérií pro začlenění cizorodého genetického materiálu a nízké náklady spojené s přípravou vektorů.

Vnášení genů do savčích buněk se označuje jako baktofekce. Někteří omezují tento termín na situaci, kdy je exprese transgenu po zániku baktérie záležitostí cílové buňky, zatímco pro perzistující infekci, kdy producentem zůstává baktérie, razí termín alternativní genová terapie.(10) Mezi biologické vektory patří i tzv. biologické liposomy, jako jsou sférické fragmenty erytrocytů („erythrocyte ghosts“) či exosomy. Mezi jejich hlavní výhody patří minimální imunogennost. Předmětem mimořádného zájmu je vývoj vektorů, s jejichž pomocí by bylo možné zacílit transgen na určité místo lidského genomu. Přesto, že se cíle dosud nepodařilo dosáhnout, mezi těmi, kteří se tímto obtížným úkolem zabývají, nechybí optimismus. Je zřejmé, že jeho vyřešení by změnilo tvář současné GT, zejména léčbu monogenních dědičných chorob.

Metodické (strategické) problémy

GT v onkologii disponuje dlouhou řadou různých strategií. Zmíníme se o těch, které jsou nejužívanější či které podle názoru autora mají největší naději na uplatnění v blízké budoucnosti. Pokusíme se i o jejich klasifikaci, přičemž jsme si vědomi, že jde o úkol, který nemůže být přesně splněn, protože chybí jasné fundamentum divisionis. Jednotlivé strategie se totiž mohou kombinovat, do určité míry se překrývají a jejich zásahy se uplatňují na různých rovinách. V současné GT nádoru se rýsuje 5 základních skupin přístupů. Jsou vyznačeny v Tab. 5.

Tab. 5 – Strategie genové terapie nádorů

První skupinu tvoří ty, jejichž cílem je přímá modifikace nádorových buněk. Většina postupů vychází ze skutečnosti, že získání maligního fenotypu je podTab. míněno alterací dvou skupin buněčných genů označovaných jako onkogeny, jejichž produkty podněcují buněčný růst, a antionkogeny, jejichž produkty zabraňují nekoordinovanému množení buňky (pro antionkogeny se v anglosaské literatuře užívá termínu tumour suppressor genes, tj. geny, které potlačují růst nádorů). Aby vznikla buňka s onkogenním potenciálem, je třeba aktivace onkogenů a inaktivace antionkogenů, což vede k narušení kontroly buněčného růstu. První ze strategií je založena na využití antisense oligonukleotidů. Jde o to vpravit do nádorových buněk krátké sekvence antisense deoxyribonukleotidů, které se naváží přímo na aktivovaný onkogen či – častěji – na jeho mRNA. V prvém případě zabrání přepisu genetické informace, v druhém jejímu překladu. Rozrušení mRNA je výsledkem aktivity všudypřítomné ribonukleázy H, která rozpozná vzniklý duplex a rozštěpí jeho RNA složku.

Přitom ponechává intaktním vlastní antisense, který se pak naváže na další molekuly mRNA.(12, 13) Nevýhodou antisense je nízká stabilita. Tu se však daří podstatně zvýšit náhradou atomů kyslíku atomy síry. Výrazné vylepšení přineslo zavedení tzv. PNA (protein nucleic acid), která zvyšuje stabilitu antisense. PNA je jakýmsi analogem molekuly DNA. Páteř konstruktu tvoří peptid, na který jsou navázány báze ve sledu, který zajišťuje jejich vazbu na cílovou molekulu. Zvláštní formou jsou krátké synteticky připravené molekuly RNA, pro které se vžilo označení siRNA (short interfering RNA).(14–16) Jde o synteticky připravené dvouzávitnicové, nekódující molekuly zpravidla o délce 19–22 ribonukleotidů. Dalšími úpravami je v buňce jeden řetězec zničen a druhý, komplementární k mRNA, se na ni naváže a způsobí její degradaci. Hovoří se o posttranskripčním umlčení genu. Molekuly siRNA mají vysokou, ale obvykle jen krátkodobou účinnost. Problémem jsou toxické efekty, které jejich podání provázejí, a nízká stabilita. Obtížnost zacílení se překonává navázáním ligandů k povrchovým buněčným receptorům.(17)

Mnoho zájmu se soustřeďuje na geny pro ribozymy, tj. molekuly RNA s katalytickou aktivitou.(18, 19) Ribozymy se osvědčily jako vysoce účinné modulátory genové exprese. Konstruují se tak, aby vyhledaly a rozložily cílovou molekulu, kterou je zpravidla mRNA. Další možností je využití genů pro protilátky proti produktům aktivovaných onkogenů.(20) Vytvoří-li se v buňce takové protilátky – označují se jako intrabodies – jsou s to neutralizovat nitrobuněčně účinek nežádoucího proteinu. Jiný přístup představuje využití plně funkčních antionkogenů.(21) V této souvislosti se někdy hovoří o opravě mutovaného genu. Nejvíce pozornosti v nedávné minulosti poutal gen pro p53, jehož poruchy jsou nejčastější jednotlivou genetickou změnou v lidských nádorech. Exprese funkčního genu vede ke ztrátě fenotypu nádorové buňky anebo způsobí její apoptózu.

Všechny dosud zmíněné postupy se osvědčily při práci v systémech tkáňových kultur. Problémy s jejich účinným využitím nastávají in vivo. Genetický materiál nelze vpravit do všech buněk nádoru. Ty, které nebyly zasaženy, mají růstovou výhodu před buňkami, jejichž maligní fenotyp byl narušen, a brzy v populaci nádoru začnou dominovat. Popsané postupy mají největší naději na úspěch, jsou-li kombinovány s jinými formami léčby, ať již genové či negenové.

Více pozornosti zasluhují dvě další genetické modifikace nádorových buněk, které nabízejí možnost, jak se s problémem vyrovnat. První využívá skutečnosti, že pravděpodobně všechny nádory se liší od normálních buněk svou antigenní výbavou, že proti nádorovým buňkám vznikají imunitní reakce a že intenzita těchto reakcí se dá zvýšit podáním různých cytokinů a chemokinů. Vzhledem k jejich toxicitě je však jejich systémové podání většinou špatně tolerováno. Zavedení genů kódujících různé imunostimulační faktory přímo do nádorových buněk zajišťuje jejich vysokou lokální koncentraci. Tím se zvyšuje pravděpodobnost vzniku silné imunitní odpovědi, která může mít výrazný systémový léčebný účinek, aniž by bylo třeba obohatit všechny buňky nádoru terapeutickým genem.(22, 23) Nejčastěji používané jsou geny pro IL (interleukin)-2, IL-12 a GM-CSF (granulocyte-macrophage colony stimulation factor). Stejně tak není třeba modifikovat celou nádorovou populaci při užití tzv. sebevražedných genů (SG).(24)

Označujeme tak geny, často virového nebo bakteriálního původu, jejichž produkty jsou schopné pozměnit primárně neškodné substance tak, aby se staly pro buňky vysoce toxickými. Buňka, která takové geny exprimuje, ničí sama sebe – odtud název. Prvním užitým a dosud nejužívanějším SG je gen pro tymidin-kinázu viru herpes simplex (HSV-TK). Jeho produkt dokáže pozměnit některé analogy nukleosidů, které byly původně vytvořeny a jsou užívány k léčbě nemocí vyvolaných herpetickými viry. Tak například ganciklovir (GCV) je pozměněn pomocí HSV-TK v GCV-monofosfát. Toho se pak chopí buněčné kinázy a přemění jej v GCV-trifosfát, který je vysoce cytotoxický (Obr. 1). Důležité je, že produkt těchto reakcí se šíří mezibuněčnými spoji do sousedních buněk a rovněž je zabíjí. Tento jev se označuje jako „by-stander effect“. Je možné, že toxická substance proniká do sousedních, ale i vzdálenějších buněk rovněž prostřednictvím apoptických měchýřků (Obr. 2).

Obr. 1 – Metabolické mechanismy vedoucí ke smrti buňky, která tvoří tymidin-kinázu viru herpes simplex

Obr. 2 – Tzv. „by-stander effect“ geneticky modifikovaných buněk na sousední geneticky nemodifikované buňky převodem toxických substancí mezibuněčnými spoji ( „gap junctions“) nebo apoptickými měchýřky

Terapie pomocí SG má, alespoň v některých systémech, ještě další účinek: uvolnění velkého množství nádorových antigenů vytváří podmínky pro stimulaci imunitního systému a vznik systémové protinádorové reakce.(25) Tomu napomáhá i nekróza části buněk v místě nádoru a vznik zánětu. Další možností je vnesení genů, které vyvolají apoptózu. Silná protinádorová aktivita TNF? (tumour necrosis factor ?) je dobře známa, ale jeho využití v klinice silně omezuje jeho toxicita. Vpravení virových vektorů s genem pro TNF?, který byl pod kontrolou promotoru aktivovatelného zářením, se ukázalo být velmi účinné jak v pokusu na zvířeti,(26) tak i v prvních klinických testech.(27) Další možností je využití endoteliálních progenitorových buněk. Ty se dají poměrně snadno izolovat a kultivovat in vitro. Mají vysokou tendenci usadit se v místě nádorů. Když jsou ex vivo modifikovány tak, aby exprimovaly SG (například HSV TK), pak jsou s to výrazně přispět k destrukci nádorů.(28)

Druhou velkou skupinu strategií GT při léčbě nádorů tvoří ty, které se zaměřují na genovou modifikaci nenádorových buněk. Opět se nabízí celá řada postupů k příznivému ovlivnění průběhu nemoci. Tak například jedním z cílů je zvýšit rezistenci buněk kostní dřeně vůči cytostatikům, jejichž toxicita je důležitým limitujícím faktorem chemoterapie. Mezi nejčastěji užívané patří gen označovaný jako MDR-1 (multidrug resistence gene 1).(29) Jeho produkt, protein P3, funguje jako pumpa, která odčerpává cytostatikum z nitra buňky. Jinou možností je vpravit do okolí nádorů buňky modifikované tak, aby tvořily některý ze známých imunostimulačních faktorů. Tím se docílí jeho vysoké koncentrace v místě nádoru, což zlepší podmínky pro vznik účinné imunitní reakce. Jako další příklad uvádíme začlenění SG do T-lymfocytů dárce před provedením alogenní transplantace u leukémie. Po transplantaci může dojít k životu nebezpečné reakci štěpu proti hostiteli (GVHD, graft-versus-host-disease), vyvolané transplantovanými buňkami T.

Jestliže byl do dárcovských T-buněk zaveden gen pro HSV TK, podáním vhodného nukleosidového analogu pacientovi lze takové buňky odstranit a GVHD potlačit.(30) Do této kategorie strategií patří i pokusy o modifikaci T-buněk tak, aby exprimovaly vyklonované geny receptorů pro specifický nádorový antigen.(31) Takové buňky, po namnožení ex vivo a následné reimplantaci, by měly být vysoce účinným prostředkem k likvidaci nádorů. Jde však o proceduru technicky velmi náročnou, s nejasnou účinností a obtížně definovatelnými riziky.

Třetí skupinu tvoří postupy, jejichž cílem je negativně ovlivnit angiogenezi. Neoangiogeneze je nezbytně nutná pro růst nádorů a jejich metastazování. Jde o biologický velmi složitý proces, do něhož zasahují desítky faktorů, které angiogenezi buď podporují, nebo brzdí. Cílem léčby je narušit poměr mezi proa antiangiogenními faktory ve prospěch druhých. Postupně byla rozpoznána řada substancí (jako jsou třeba endostatin, angiostatin či trombospondin 1), které mají silný protinádorový účinek, protože brzdí angiogenezi a tvorbu metastáz. Vnesení genů pro tyto substance do nádorových buněk může zabránit růstu nádoru.(32) Antiangiogenní léčba má oproti jiným typům protinádorové léčby několik výhod. Mezi ně patří malá závislost zákroku na typu nádorů a to, že při jejím uplatnění nevzniká rezistence, která tak často komplikuje chemoterapii. Důvodem je, že primárním cílem jsou endoteliální buňky, jež jsou geneticky vysoce stabilní.(33)

V úvahu přichází i vpravení genů pro antiangiogenní faktory do buněk nacházejících se v těsné blízkosti nádorů, což zajistí dlouhodobou přítomnost produktu tam, kde je ho zapotřebí. Účinku lze však dosáhnout i jinými způsoby. Tak například lze blokovat funkčnost hlavních proangiogenních faktorů, jakými jsou členové rodiny VEGF (vascular endothelial growth factor) či FGF (fibroblast growth factor) pomocí příslušných antisense.(34) Jinou možností je již zmíněná transdukce endoteliálních prekurzorových buněk pomocí SG. Ale dají se uplatnit i další postupy z dílny GT. Za součást GT nádorů se dnes považuje i léčba pomocí onkolytických virů (OV). Počátek zájmu o ně se datuje už do druhé poloviny 50. let minulého století a od té doby se vrací ve vlnách podmíněných vždy významným posunem poznání buď biologie nádorové buňky, nebo replikace virů. Zájemce o tuto problematiku odkazujeme na nedávnou obsáhlou monografii.(35) Jako onkolytické se označují viry, které se množí výhradně v nádorových buňkách anebo aspoň v nádorových buňkách rostou podstatně lépe než v buňkách normálních (Obr. 3).

Obr. 3 – Schéma účinku onkolytických virů na nádorové a nenádorové buňky

Jsou s to zabíjet nádorové buňky vzdorující apoptóze. Podání OV lze zdárně kombinovat s jinými léčebnými postupy, například s chemoterapií, chirurgickým zákrokem či imunoterapií, a dosahovat tím synergického efektu.(36) OV se dají upravit tak, aby se zvýšila jejich afinita k různým typům buněk, třeba tak, že se modifikuje jejich povrch, což zúží jejich tropismus, anebo zavedením promotoru, který je rozpoznáván jen nádorovými buňkami. Dělíme je do dvou skupin: na ty, které se chovají jako OV pro své přirozené vlastnosti, a na mutanty jiných virů. Vlastně pouze práci s nimi můžeme řadit do GT, protože jejich užití předchází genetická úprava. V experimentálních systémech i v klinických studiích se jako první objevily mutanty viru HSV, zbavené některých neesenciálních genů. Takový zásah činí jejich replikaci závislou na biochemických pochodech probíhajících v nádorových buňkách. V zájmu posílení bezpečnosti se užívá mutant, v němž byl inaktivován gen, jehož produkt přispívá k neurotropismu viru. V centru zájmu jsou též adenoviry.(37, 38) Nejčastěji se užívají mutanty, které se nemohou množit v buňkách s plně funkčním antionkogenem p53, ale dobře rostou v buňkách, v nichž je aktivita tohoto genu narušena, což se týká více než poloviny lidských zhoubných nádorů.

Za zmínku stojí, že bylo s úspěchem použito adenoviru upraveného pro onkolýzu, který byl dále modifikován začleněním dvou SG.(39) Další variantou je genetická manipulace OV tak, aby exprimovaly ligandy tzv. smrtících povrchových receptorů („surface death receptors“), což vede k apoptóze.(40, 41) Nový rozměr může dát léčbě pomocí OV postup označovaný v anglicky psané literatuře jako „hitchhiking“, tj. slovem, které se do češtiny překládá jako „autostop“. Užít v našem textu tohoto termínu by bylo nešťastné vzhledem k povaze nově navržené procedury. Její princip spočívá v tom, že se ex vivo infikují specificky aktivované T-buňky onkolytickým virem, který se v nich nereplikuje. Reimplantované buňky donesou virus k nádorovým buňkám.(42) Po kontaktu s nimi by mělo dojít ke kumulaci cytotoxické aktivity T-buněk a virem vyvolané onkolýzy. Jinou formou „hitchhikingu“ je ex vivo infekce progenitorových endoteliálních buněk,(29) které mají po implantaci vysokou afinitu k místům neoangiogeneze.

Nevýhodou OV, stejně tak jako už zmíněných virových vektorů, je imunitní odpověď léčeného organismu, která limituje šíření viru v nádoru. Je proto dosti běžné, že se imunitní odpověď potlačuje, například podáním cyklofosfamidu.(43) Nejrychleji a nejnadějněji se rozvíjející úsek GT v oblasti onkologie se týká genetických terapeutických vakcín. Těžiště výzkumné práce je dosud v oblasti experimentálních modelů, ale první klinické studie se už uskutečnily a jiné jsou v běhu. Je pravděpodobné, že k rychlému vývoji vakcín tohoto typu dojde již v příštích několika letech. Genetické vakcíny se nepochybně uplatní i ve vývoji preventivních vakcín, ale vzhledem k tématu (jde o genovou terapii!) se omezíme na vakcíny terapeutické a z nich pouze na ty, jejichž příprava vyžaduje genové manipulace. (Pozn.: V poslední době se v literatuře objevil termín „preventivní genová terapie“. Domníváme se, že takové posouvání hranic GT je nesprávné a že by termín neměl být používán. Jde o oxymóron.) V současné době se uvažuje především o léčbě nádorů, jež mají dobře definovaný nádorový antigen, a zvláště pak o nádorech virového původu. Produkty virových onkogenů označované jako virové onkoproteiny totiž představují velké a dobře definované terče pro imunitní reakce.

To umožňuje poměrně snadné monitorování jejich síly a kvality. Existuje několik zásadně odlišných typů vakcín. Prozatím nejvíce pozornosti patří DNA vakcínám. V podstatě jde o bakteriální plazmidy, do nichž byl vnesen gen pro specifický nádorový antigen, případně doplněný genem pro některý imunostimulační faktor. Geny musí být ve formě, která zajišťuje, že se v savčích buňkách budou exprimovat. DNA vakcíny mají oproti jiným typům vakcín několik velkých výhod. Jsou shrnuty v Tab. 6.

Tab. 6 – Výhody DNA vakcín

Dalším typem genetických terapeutických vakcín jsou rekombinantní vakcíny. Mezi ně patří rekombinantní proteiny. Peptid nesoucí imunodominantní epitop(y) je začleněn do jiného proteinu, o kterém se ví, že má silný, burcující účinek na imunitní systém. Příkladem může být detoxifikovaný toxin CyaA B. pertussis. (44) Více zájmu se soustřeďuje na využití virových rekombinant, ve kterých byl některý neesenciální gen nahrazen genem pro nádorový antigen. Použije-li se velký virus, jako je například virus vakcinie, jehož genom obsahuje více než 20 neesenciálních genů, lze genetickou výbavu rekombinanty doplnit geny kódujícími různé cytokiny, o nichž se ví, že mají silný imunostimulační efekt. Nevýhodou virových rekombinantních vakcín je silná imunogennost virových vektorů. Vytvořená imunita brání opakovanému podání. DNA a rekombinantní vakcíny mají jedno společné omezení. Předpokladem jejich užití je znalost příslušného nádorového antigenu a gen, který jej kóduje, musí být k dispozici ve vyklonované formě.

Další skupinou genetických terapeutických vakcín jsou vakcíny buněčné, o kterých je autor tohoto článku přesvědčen, že mají největší naději na úspěch v blízké budoucnosti. Nejvíce zájmu se soustřeďuje na dva typy vakcín. První jsou založeny na dendritických buňkách (DB), které jsou nejdůležitějšími mezi tzv. antigen-prezentujícími buňkami. Zpravidla se používá autologních DB, které lze namnožit in vitro. DB se vystaví působení nádorových antigenů (v nejrůznější podobě) a faktorům, které umožní jejich dozrání. Opracované buňky se pak reimplantují pacientovi. Osvědčilo se i vpravení specificky aktivovaných DB přímo do nádoru.(45) Druhou možností je použít genově modifikované nádorové buňky, které byly ex vivo geneticky pozměněny tak, aby tvořily některý imunostimulační faktor. (Jako buněčných protinádorových vakcín lze užít i zabitých nemodifikovaných nádorových buněk; sensu stricto takový postup nemůžeme řadit do GT.) Nejčastěji jde o ty, o kterých jsme již hovořili, tj. IL-2, IL-12 či GM-CSF. Podle výsledků experimentálních studií může taková modifikace vést k snížení, případně k úplné ztrátě onkogenního potenciálu.(46, 47)

I kdyby se tak stalo, z etických důvodů v humánní medicíně nepřipadá v úvahu použít k léčbě živých nádorových buněk, byť se jednalo o pacienty s maligním onemocněním. Uvažovat lze pouze o buňkách usmrcených, například zářením, nebo o jejich lyzátech. Velkou výhodou buněčných vakcín je, že znalost příslušného nádorového antigenu není nutná. Krom toho jejich použití respektuje skutečnost, že nádorové buňky obsahují krom svého specifického antigenu (například virové onkoproteiny či proteiny kódované fúzním genem) také další antigeny buněčného původu, které jsou tvořeny v nadbytku, a které – přesto, že jde „selfantigeny“ – se stávají pravděpodobně u většiny nádorů imunogenními. Imunitní systém organismu je vakcinací povzbuzen k tomu, aby odpověděl na celý komplex antigenů charakteristických pro daný typ nádoru anebo alespoň pro nádor příslušného pacienta. Z tohoto důvodu by bylo optimální použít autologní vakcíny. Izolace buněčných linií z nádoru pacienta je procedura časově náročná a ne vždy úspěšná.

Proto se mnoho výzkumných skupin zaměřuje na vakcíny alogenní, založené na buněčných liniích odvozených od jiných pacientů trpících stejným typem nádoru, a následně geneticky upravených. Riziko, že očkovací látka nebude obsahovat nejdůležitější anebo hlavní důležité antigeny, se dá snížit, i když ne vyloučit použitím směsi několika alogenních vakcín. Podle některých existuje riziko, že nad odpovědí k převážně slabým nádorovým antigenům převládne reakce k silným cizím antigenům MHC. Jiní však soudí, že jejich přítomnost by naopak mohla mít adjuvantní účinek. Alogenní vakcíny by oproti autologním vakcínám měly několik výhod. Za prvé, odpadla by zdlouhavá, a tedy i nákladná příprava buněčných linií od každého pacienta. Za druhé, příprava vakcíny by se dala snadno kontrolovat a standardizovat, jednotlivé šarže by byly shodné kvalitou a složením. Za třetí, zdroje pro produkci vakcín by byly prakticky neomezené. Za čtvrté, vyhodnocování účinnosti vakcinace by bylo daleko snadnější než při užití N-vakcín pro N-pacientů.

Tento přehledový článek není zaměřen výlučně na protinádorové vakcíny. Bylo by proto asi nesprávné pokoušet se o rozsáhlejší diskusi problémů spojených s imunoterapií nádorů. Nicméně před uzavřením této části textu je nutno se zmínit se ještě o jedné oblasti nádorové imunologie, v níž GT může sehrát významnou roli. V posledních několika letech se stalo zřejmým, že ve svém střetu s imunitním systémem organismu nehraje nádor pasivní roli. Nejen samy nádorové buňky, ale i buňky stromatu a buňky imunitního systému infiltrující mikroprostředí nádorů tvoří imunosupresivní substance (anebo jejich produkci napomáhají), které významně interferují s imunitními protinádorovými reakcemi organismu. Je velmi pravděpodobné, že mnohé ze současných metod GT se uplatní při neutralizaci těchto procesů jako významný doplněk specifické protinádorové vakcinace. Mezi prostředky, jimiž by se dala zvýraznit účinnost protinádorových vakcín, nepochybně patří další výdobytek genových manipulací, tzv. bispecifické protilátky, které přivádějí do blízkého kontaktu antigeny na površích nádorových buněk a výkonných elementů imunitního systému.(48) V současné době se promýšlejí a již i prověřují strategie, jak doplnit vakcinaci dalšími intervencemi, které by co nejvíce zvýšily sílu protinádorových imunitních procesů, a tím pomohly otevřít imunoterapii nádorů dveře dokořán.

Etické problémy

Etické problémy spojené s GT jsou nemalé. Vedle technických problémů spojených s vektory představují největší brzdu jejího rozvoje. Jejich význam umocňují závažné události, k nimž došlo v posledních 10 letech při léčbě vrozených chorob transgeny nesenými virovými vektory. Když francouzská skupina referovala před pár roky o úspěšném vyléčení skupiny dětí trpících tzv. těžkou vrozenou imunodeficiencí, vzbudilo to vlnu nadšení. Bohužel, v následujících letech čtyři z dětí onemocněly T-leukémií(6) a jeden případ leukémie se objevil i u obdobně léčeného souboru britských dětí.(49) Jak ukázaly následné molekulové analýzy, nejméně ve 4 případech šlo o společný patogenetický mechanismus: transgen vnesený do organismu prostřednictvím retrovirového vektoru byl integrován na stejném místě hostitelského genomu v blízkosti protoonkogenu LMO2, který kóduje růstový faktor T-buněk. Jev označovaný jako inserční mutageneze (Tab. 3) za určitých podmínek aktivuje buněčné geny, jejichž produkty mohou vyvolat nekontrolovatelné množení buněk.(50–52)

Teoreticky vzato, podobné riziko je spojeno s adeno-asociovanými viry (AAV), jež se rovněž integrují do buněčného genomu, i když vzhledem k tomu, že se integrují preferenčně do určitého lokusu na chromosomu 19 a vzhledem k jejich biologii je u nich pravděpodobnost inzerční mutageneze daleko nižší. Nicméně při použití AAV k léčení revmatoidní artritidy došlo k úmrtí pacientky způsobené nejspíš doprovodnou imunosupresivní terapií, jež aktivovala oportunní infekci Histoplasma capsulatum. Konečně další komplikace, která vedla ke smrti pacienta léčeného na deficienci enzymu ornitin-transkarbamylázy, byla vyvolána použitím nepřiměřeně velkého množství adenovirového vektoru, které vyvolalo u pacienta toxický šok.(53) Na začátku této statě se konstatovalo, že při léčbě nádorů jsou vzhledem k povaze nemoci rizika GT považována za málo závažná. Nicméně, opatrnosti je třeba a každá jednotlivá studie musí být předem bedlivě posouzena jak z hlediska možné účinnosti, tak z hlediska bezpečnosti, a to nejen pro daného pacienta, ale i pro jeho okolí. Tak například určité, velmi malé riziko je spojeno s genově modifikovanými viry použitými k onkolýze či jako vakcíny. S jistotou nelze totiž vyloučit, že by za jistých okolností mohlo dojít k rekombinaci s divokým virem. Vlastnosti takové rekombinanty, jako například její schopnost infikovat kontaktní osoby, není možné předem odhadnout. Zatím však k takové události nedošlo, takže můžeme hovořit pouze o teoretickém riziku.
Podle současných vědomostí by se měly všechny klinické zkoušky v oblasti GT řídit zásadami vytyčenými v Tab. 7.

Tab. 7 – Zásady pro klinické zkoušky v oblasti genové terapie

Existující problémy nikterak neznamenají, že by mělo úsilí spojené se zaváděním GT polevit. Dosavadní zkušenosti však vybízejí k tomu, aby cesta „od laboratorního stolu k lůžku pacienta“ nebyla jednosměrnou. V příštích 10 letech se budeme velmi často vracet od klinických studií do laboratoře, abychom vyřešili nečekané problémy. Jen tak budeme schopni zaplnit bílá místa v našich vědomostech a vydláždit cestu k rozsáhlému využití GT v medicíně.

Výzkumná práce autora je podporována grantem IGA Ministerstva České republiky č NS 10 634-3/2009.


O autorovi: Prof. MUDr. Vladimír Vonka, DrSc.
Ústav hematologie a krevní transfúze, Praha

e-mail: vonka@uhkt.cz

Genová terapie nádorů
Ohodnoťte tento článek!