Kryokonzervace spermií a embryí

Titulní obrázek

Cílem kryokonzervace (zmražení na teplotu kapalného dusíku (–196 °C) je uchování buněk (spermií nebo embryí, oocyty se kryokonzervovat daří jen s velmi malým výtěžkem) pro použití v budoucnu. Po rozmražení je většina buněk schopna dalšího vývoje (života). Doba možného setrvání ve zmraženém stavu je obtížně ohraničitelná, teoreticky nekonečná…

MUDr. Karel Řežábek

Centrum asistované reprodukce,

Gynekologicko-porodnická klinika 1. LF UK a VFN, Praha

Klíčová slova:

kryokenverzace spermií • kryokenverzace embrií • indikace

1. Cílem kryokonzervace (zmražení na teplotu kapalného dusíku (–196 °C) je uchování buněk (spermií nebo embryí, oocyty se kryokonzervovat daří jen s velmi malým výtěžkem) pro použití v budoucnu. Po rozmražení je většina buněk schopna dalšího vývoje (života). Doba možného setrvání ve zmraženém stavu je obtížně ohraničitelná, teoreticky nekonečná. Některé extrapolace, které berou v úvahu vliv kosmického záření, předpokládají určitý úbytek fertilizační schopnosti spermií po přibližně 300 letech.

2. Kritickými místy kryokonzervace je proces zmrazování a rozmrazování. Při ochlazování roztoku solí nejprve vymrzá čistá voda jako čistý led a až po dosažení eutektika (např. pro roztok NaCl a vody –21,7 °C) vymrzá tato směs jako celek. Dochází tedy ke zvyšování koncentrace solí (i ostatních rozpustných složek v buňce), ke změnám osmotického tlaku, může dojít k precipitaci proteinů. Buňka je ohrožena i mechanicky: led má větší objem než voda, proto ledové krystalky mohou trhat buněčné membrány.

3. K zamezení škodlivých účinků lze:

Provést ultrarychlé zmrazení, tzv. vitrifikaci, při níž voda nevymrzá ve formě krystalů, ale tuhne jako podchlazená kapalina ve sklovité formě. Proces vyžaduje rychlost zmrazování řádově 200 – 2000 °C/sec.


Přidat kryoprotektiva (např. dimetylsulfoxid (DMSO), glycerol, sacharózu, propandiol, proteiny), které při zmrazování zamezí tvorbě velkých krystalů.


Provádět zmrazování velmi pomalu (0,005 – 0,1 °C/sec), aby voda mohla vymrzat mimo buňky, pro zajištění reprodukovatelnosti provádíme ve speciálním přístroji.


Zkoumá se možnost použití anti-freeze proteinů, které některým rostlinám umožňují překonat zmrznutí bez poškození.

4. V praxi se používají vyzkoušené postupy kombinace kryoprotektiv a ochlazovacích protokolů. Jsou různé podle druhu zmrazovaných buněk (spermie: glycerol 8 % + proteiny, embrya stáří 1. – 3. den: propandiol + sacharóza, event. DMSO, blastocysty (5. den): glycerol, event. DMSO). Zmrazování provádíme v tenkých trubičkách – pejetách, průměr 1 – 2 mm, délky 100 až 120 mm. Jejich malý průměr umožňuje snadný přestup tepla při rozmrazování a zmrazování, jejich tvar je vhodný pro manipulaci, označení a skladování.

Pejety skladujeme v kryokontejnerech – velkých termoskách (většinou objemu 32 litrů) naplněných kapalným dusíkem. Uložení v kapalném dusíku zaručuje, že teplota pejet bude vždy –196 °C. Kapalný dusík musíme přibližně jednou za týden do kryokontejneru dolévat, neboť prostup tepla stěnami nádoby vede k jeho odpařování.

5.1 Indikace kryokonzervace spermií


Sperma dárců: zákonem je dáno, že sperma dárce (s testem HIV negativity) zmrazujeme a po 6 měsících dárce znovu testujeme na HIV protilátky. Teprve poté je sperma uvolněno k použití (po infekci virem HIV je člověk infekční, ale v testech stále ještě může být negativní – jeho pozitivita v sérologických testech nastupuje až po několika týdnech). Při použití kryokonzervovaného spermatu, které je kdykoli k dispozici, je též jednodušší organizace práce, vyloučíme setkání dárce s ženami přicházejícími k inseminaci. Jiné sperma než kryokonzervované (s opakovaným negativním testem HIV) nesmí být v České republice pro donogenní inseminaci použito.


Sperma mužů před (některou) cytostatickou léčbou pro onkologická onemocnění (některá cytostastika zcela zničí spermatogenezi).


Sperma manžela pacientky, například před jeho odjezdem na dlouhou dobu do zahraničí.


Spermie získané chirurgickým odběrem z varlete (např. pro obstrukční azoospermii, kdy ve spermatu nejsou žádné spermie přítomny), abychom náročný odběr nemuseli opakovat.

5.2 Výsledky zmrazování spermatu. Po zmrazení/rozmrazení spermatu očekáváme, že pohyblivost si zachová přibližně polovina z původně přítomných motilních spermií.

5.3 Aplikace kryospermií

Kryospermie můžeme aplikovat na hrdlo děložní, většinou však je po promytí od seminální plazmy (bylo–li sperma zmražováno) aplikujeme do dutiny děložní (intrauterinní inseminace). Tak zajistíme jejich maximální využití bez zbytečného kontaktu s hostilním vaginálním prostředím.

Při nízkém počtu (spermie z testikulární/epididymální biopsie) nebo kvalitě (často spermie onkologických pacientů) provádíme intracytoplazmatickou injekci spermie do oocytu (ICSI).

6.1 Indikace kryokonzervace embryí


Embrya z darovaných oocytů ze stejného důvodu, jako sperma dárců v bodě 5.1.


Embrya nadpočetná, tedy ta, která máme při IVF v inkubátoru navíc nad potřebný počet embryí (většinou 2 – 4) k transferu do dělohy. Transfer kryoembryí po rozmražení v následujících cyklech zvyšuje procento těhotných po IVF, aniž bychom museli opakovat stimulaci ovarií a jejich punkci pro odběr oocytů.


Někdy embrya při špatném zdravotním stavu ženy, který neumožňuje provést plánovaný embryotransfer žádného z embryí získaných při IVF (hyperstimulační syndrom, těžká choroba…)

6.2 Výsledky zmrazování embryí. Nejlepší výsledky jsou při zmrazování embryí ve fázi zygoty (vidíme prvojádra), tedy ve stadiu jedné buňky. Po rozmražení embrya většinou dále kultivujeme v inkubátoru a do dělohy je přenášíme až ve stáří 2 nebo 3 (ev. až 5) dní. Očekáváme, že v průměru asi 1/2 až 2/3 embryí po zmrazení/rozmražení budou schopny dalšího vývoje.

6.3 Aplikace kryoembryí. Přenos kryokonzervovaných embryí do dělohy se musí uskutečnit ve správné chvíli cyklu (tzn. implantační okno). Máme dvě možnosti:

a) Přenos v přirozeném cyklu. Pokud je cyklus pravidelný, můžeme sledovat (UZ) růst folikulu a ovulaci a synchronně s cyklem pak rozmrazit embrya a provést embryotransfer. Poté můžeme, ale nemusíme, podávat hormony usnadňující zahnízdění embrya.

b) Přenos v uměle řízeném cyklu. Není-li cyklus pravidelný, žádný (ovariální selhání jako důvod přijetí darovaných embryí) nebo nechceme-li se na tvorbu přirozených hormonů spolehnout, můžeme cyklus navodit uměle. Od začátku cyklu užívá žena estrogeny (Estrofem, Estraderm TTS…). Díky estrogenům sliznice děložní roste a zároveň tyto exogenní estrogeny zabrzdí tvorbu FSH. Žádný folikul s vajíčkem tedy nedozrává, nebude produkovat vlastní hormony, které by mohly přijít v neočekávanou chvíli. Když sliznice doroste správné výšky (min. 7 mm) – většinou 14. den cyklu, přidáme k estrogenům progesteron – (Agolutin, Utrogestan…). Po 2 – 5 dnech pak můžeme embrya transferovat. Vzhledem k tomu, že vaječník hormony netvoří, musíme v jejich podávání (estrogen i gestagen !!!) pokračovat a v případě těhotenství je podávat až do doby, kdy je bude v dostatečném množství vytvářet placenta (12. týden těhotenství). Než léky vysadíme, vždy se přesvědčíme o jejich hladinách v organizmu, abychom je nevysadili předčasně.

Po transferu rozmrazených kryoembryí vzhledem k plné estrogen-gestagenní substituci samozřejmě menstruace nepřijde. Většinou za 2 – 3 týdny po kryoembryotransferu si pacientka sama provede test na těhotenství z moči. Spolehlivost těchto testů je značná, ale pro závažné rozhodnutí, že těhotenství není přítomno a tedy že podání léků může ukončit, vyžadujeme ještě potvrzení testem hCG z krve. Teprve po dvojí negativitě v odstupu alespoň 3 dnů máme jistotu, že těhotenství není přítomno a že tedy smíme léky vysadit.

Důležité: Provádíme-li kryoembryotransfer v umělém – léky ovlivněném – cyklu, nesmíme léky předčasně vysadit – nastal by potrat!!!

7. Kryokonzervace spermií a embryí se provádí na pracovištích provádějících asistovanou reprodukci (IVF…).

Literatura u autora

e-mail:krezabek@vfn.cz

Ohodnoťte tento článek!