Souhrn
Lidský cytomegalovirus (CMV) je příčinou závažných infekčních komplikací imunokompromitovaných pacientů. Pravidelné monitorování hladiny virové nálože se stalo nedílnou součástí péče o pacienty po transplantaci krvetvorných buněk. Pro detekci CMV byla vyvinuta řada diagnostických metod, z nichž největší přínos představují molekulárněbiologické metody, zejména kvantitativní real-time PCR. Tato metoda umožňuje stanovit velikost virové nálože, avšak dosud nebyla jasně stanovena hladina viru predikující rozvoj CMV onemocnění. V tomto přehledovém článku jsou shrnuty současné poznatky o diagnostice CMV infekce založené zejména na detekci viru molekulárněbiologickými metodami a jejich úloze v preemptivním přístupu k terapii. Dále se věnujeme problému vzniku rezistence CMV k podávaným antivirotikům a způsobu detekce mutací vedoucích ke vzniku rezistence.
Klíčová slova
cytomegalovirus * kvantitativní real-time PCR * periferní krev * likvid * bronchoalveolární laváž * CMV rezistence
Infekce způsobená lidským cytomegalovirem (CMV) je jednou z nejčastějších infekčních komplikací u pacientů s hematologickou malignitou a pacientů po transplantaci krvetvorných buněk (TKB). Její příčinou je nejčastěji reaktivace viru, který je v organismu přítomen v tzv. latentním stavu. Pokud dojde k oslabení imunitního systému (v důsledku transplantace nebo protinádorové terapie), ztrácí organismus kontrolu nad tímto stavem a dochází k aktivní replikaci viru, a následně k rozvoji klinických příznaků. Méně často je pak příčinou komplikací tzv. primoinfekce CMV, tj. stav, kdy se organismus s virem potkává poprvé. V tomto případě je u imunokompromitovaných pacientů průběh infekce obvykle velice vážný, s vysokým rizikem vzniku orgánového postižení (tzv. CMV onemocnění), které je spojeno s vysokou morbiditou.
V posledním desetiletí jsou ve většině transplantačních center používány pro prevenci vzniku CMV infekce a rozvoje CMV onemocnění dvě základní strategie – profylaxe (preventivní podávání virostatik všem pacientů v riziku) nebo preemptivní terapie (léčeni jsou pouze pacienti, u kterých byl virus detekován některou z laboratorních metod ještě před rozvojem klinických příznaků).
Metody detekce CMV v klinických vzorcích
Klasické metody založené na kultivaci se pro detekci CMV u hematologických nemocných v praxi nepoužívají, protože jsou časově velmi náročné (několik týdnů) a málo citlivé.
PP65 ANTIGENÉMIE
CMV antigenémie spočívá v přímém barvení leukocytů monoklonální protilátkou specifickou pro povrchový fosfoprotein 65 (pp65, gen UL83). Výsledky jsou pak udávány jako počet pozitivních buněk vztažený na počet buněk použitých k přípravě Její hlavní výhodou ve srovnání s kultivačními metodami je rychlost a relativní nenáročnost na laboratorní vybavení. Hlavními nevýhodami jsou pak nutnost okamžitého zpracování vzorku a to, že výsledek může být částečně ovlivněn subjektivním hodnocením a zkušenostmi pracovníka, stejně jako množstvím jaderných buněk přítomných v periferní krvi.
DETEKCE PROTILÁTEK
U pacientů po TKB jsou sérologické testy pro detekci protilátek IgG a IgM důležité hlavně pro stanovení rizika vzniku CMV infekce, ale ne pro stanovení její diagnózy nebo diagnózy CMV onemocnění.
DETEKCE CMV SPECIFICKÝCH T-LYMFOCYTŮ
Rekonstituce buněčné imunitní odpovědi po TKB je dlouhodobý proces. Detekce CMV-specifických CD4+ a CD8+ cytotoxických T-lymfocytů v periferní krvi je známkou obnovy přirozené obranyschopnosti organismu a může pomoci odlišit pacienty, kteří jsou sami schopni kontrolovat CMV reaktivaci, od pacientů, kteří budou profitovat z preemptivní terapie CMV.(1)
KVALITATIVNÍ PCR
V současné době jsou nejčastěji používány molekulárněbiologické metody, zejména polymerázová řetězová reakce (PCR – polymerase chain reaction). Protože od prvního záchytu přítomnosti viru u TKB pacienta do rozvoje prokazatelného CMV onemocnění může uplynout i méně než 7 dní,(2) je rychlá a citlivá diagnostika velmi důležitá. PCR umožňuje mnohonásobné zmnožení cílového templátu v klinickém vzorku pomocí páru oligonukleotidových primerů a termostabilní DNA polymerázy. Výsledkem kvalitativního testování je informace, že vzorek je CMV pozitivní nebo CMV negativní. Interpretace výsledku však není jednoduchá a často je samostatný průkaz viru nedostatečným kritériem pro zahájení terapie.
KVANTITATIVNÍ REAL-TIME PCR
Koncem minulého století začala být kvalitativní PCR nahrazována její modifikací, tzv. kvantitativní real-time PCR. Kromě detekce velmi malého množství templátu lze touto metodou také stanovit množství viru ve sledovaném materiálu, což umožňuje sledovat průběh infekce – nárůst počtu kopií viru (virových částic), popř. sledovat efekt léčby. Principem real-time PCR je sledování kumulace amplikonu v reálném čase pomocí interkalačních barviv nebo specifických DNA sond značených fluorescenčními barvivy (Obr. 1).
Diagnostika CMV infekce metodou PCR
Pro izolaci DNA z klinických vzorků jsou rutinně využívány komerční soupravy, založené většinou na separaci DNA na kolonkách. V současnosti jsou pro izolaci DNA s úspěchem používány také plně automatizované systémy (roboty pro izolaci DNA). Jejich výhodou je automatizace a standardizace celého procesu a úspora času laboratorního personálu.
Při výběru primerů vycházíme většinou z již publikovaných sekvencí. Studie prováděné jak na úrovni DNA, tak na úrovni proteinů prokázaly, že míra homologie mezi jednotlivými kmeny CMV dosahuje až 95 %. I když se jedná o velmi rozšířený a významný patogen, dosud se světová vědecká a diagnostická komunita jednoznačně neshodla na nejvhodnějším cílovém genu pro PCR diagnostiku CMV. Mezi nejčastěji používané geny patří: gen pro major immediate-early (MIE) protein, gen pro virovou DNA polymerázu, glykoprotein B nebo gen pro tegumentový fosfoprotein 65 (pp65). V některých studiích dokonce používají paralelně dva různé geny.(3) Optimální diagnostika CMV může být dosažena jen v případě použití primerů schopných detekovat všechny kmeny CMV, což může být komplikováno přítomností přirozené genetické variability mezi jednotlivými kmeny.(4, 5) Stejně jako v mnohých dalších oblastech molekulární mikrobiologie, tak i v oblasti detekce CMV chybí větší míra standardizace používaných metod. Jediným doporučením mezinárodních organizací (např. ECIL – European Conference on Infections in Leukemia) je použití kvantitativních metod pro monitorování pacientů v riziku. Pro detekci CMV jsou tedy běžně využívány jak metody vyvinuté v laboratoři (tzv. in-house metody), tak dostupné komerční soupravy (Tab. 1). K použití in-house metod se hlásí i celá řada velkých světových transplantačních center, protože výsledky jimi získané jsou velmi dobré, laboratoře s nimi mají dlouholeté zkušenosti a jejich použití významně snižuje náklady na jednotlivá vyšetření. Použitá in-house metoda by měla obsahovat systém kontrol, který odhalí selhání preanalytické fáze (např. neúspěšnou izolaci DNA) a případnou inhibici PCR reakce. Vlastní metodiku (in-house i komerční) je potom doporučeno testovat na panelu slepých vzorků, např. účastí v kontrolách externího hodnocení kvality (pro CMV dostupné QCMD – Quality Control For Molecular Diagnostics, Velká Británie, nebo Instandt, Německo). Nově lze také provést normalizaci vlastní metodiky testováním mezinárodního stanpreparátu. dardu pro kvantifikaci CMV (1st WHO International Standard for Human Cytomegalovirus for Nucleic Acid Amplication Techniques, NIBSC, Velká Británie). Po otestování tohoto standardu laboratoř získá konverzní faktor pro přepočet výsledků získaných danou metodikou (izolace DNA + real-time PCR), což umožní vyjádření detekované kvantity v mezinárodních jednotkách a lepší srovnání výsledků s ostatními laboratořemi a publikovanými pracemi.
METODY DETEKUJÍCÍ VIROVOU RNA
Byly publikovány studie využívající metody NASBA (nucleic acid sequence-based amplification) pro detekci virové mRNA (messenger RNA). Přestože bylo prokázáno, že tato metoda má srovnatelnou citlivost s detekcí virové DNA pomocí real-time PCR, není využívána rutinně.(6)
Hranice virové nálože v periferní krvi pro zahájení preemptivní terapie
V současnosti nejčastěji používaná preemptivní terapie je založena na monitorování virové nálože pomocí real-time PCR a zahájení léčby po překročení určitého cut-off. Doposud však nebyla stanovena ani doporučena žádná univerzální hodnota. Prvním z důvodů je výše zmiňovaná variabilita v metodice detekce CMV (klinický materiál, metoda izolace DNA, in-house x komerční metody atd.). Druhým pak skutečnost, že u různých skupin pacientů je riziko progrese CMV různě vysoké. Rychlost replikace CMV je asi 1–2 dny, ale u těžce imunokompromitovaných pacientů může být i kratší a virová nálož pak může narůstat velmi rychle. Některé studie navrhují odstupňování této hranice podle rizika rozvoje CMV onemocnění (Obr. 2). Např. 100 kopií/ml plazmy u vysoce rizikových pacientů po TKB, 500 kopií/ml u méně rizikových a 1000 kopií/ml u pacientů po dni 100 od TKB.(7) V rutinní praxi si každé pracoviště stanovuje tuto hodnotu retrospektivní analýzou výsledků a jejich korelací s klinickými daty. Dalším důležitým aspektem screeningu CMV je frekvence monitorování. Většina autorů doporučuje testování vzorků 1krát týdně a u pacientů v riziku s již detekovaným CMV (pod hranicí pro zahájení léčby) nebo pacientů léčených pro CMV infekci pak zvýšit frekvenci na 2krát týdně.(7)
Význam detekce CMV v různých klinických vzorcích DETEKCE CMV V PERIFERNÍ KRVI
Jako výchozí klinický materiál pro detekci CMV je používána periferní krev nebo její frakce. Detekce DNA v leukocytech periferní krve vyžaduje separaci leukocytů erytrolýzou, tedy náročnější zpracování, ale protože CMV je virus často infikující jaderné buňky periferní krve, je detekovaná virová nálož často vyšší ve srovnání s ostatními materiály, a představuje tedy nejcitlivější způsob detekce. Zvláštní pozornost je však třeba věnovat pacientům
krátce po TKB, u kterých mohou být výsledky zkresleny v důsledku leukopenie. Při detekci DNA v plazmě nebo séru je detekován pouze virus, který není asociován s buňkami, uvolnil se z nich v průběhu lytické fáze, a je tedy známkou replikace viru a aktivní infekce. Do budoucna se jeví jako nejnadějnější použití plné krve. Je výhodné nejen pro relativně snadné zpracování vzorku (lze snadno kombinovat s automatickými metodami izolace DNA), ale také tím, že umožňuje detekci CMV jak v buněčné, tak v nebuněčné frakci. Ruell a kol.(8) publikovali rozsáhlou analýzu 577 pacientů po transplantaci krvetvorných buněk. U 3 z 8 pacientů, u nichž bylo kultivačně nebo histologicky prokázáno CMV onemocnění, byla detekce CMV v periferní krvi negativní. Všichni tito pacienti však v minulosti reaktivovali CMV. Negativní nález v periferní krvi tedy někdy nemusí zcela jednoznačně vyloučit orgánové postižení.
DETEKCE CMV V TEKUTINĚ ZÍSKANÉ BRONCHOALVEOLÁRNÍ LAVÁŽÍ
CMV je jednou z příčin vzniku pulmonálních infekcí a intersticiální pneumonie. Diagnostika CMV pneumonie zahrnuje přítomnost klinických příznaků a zároveň detekci infekčního agens v biologickém materiálu z dolních cest dýchacích. Pro stanovení etiologie je nejvhodnějším materiálem bronchoalveolární laváž (BAL). Obsahuje buněčné i bezbuněčné složky dolního respiračního traktu, v nichž byla při detekci viru prokázána vysoká korelace.(9) Významným přínosem v diagnostice CMV infekce v BAL je detekce pomocí PCR. Vyšetření poskytuje vysokou negativní prediktivní hodnotu, ale pro predikci vzniku CMV pneumonie je třeba stanovení klinicky významné hladiny, která by rozlišila závažnou reaktivaci od asymptomatického šíření viru, případně jen od nálože viru přítomné v leukocytech atrahovaných do dýchacích cest z jiných důvodů. Přítomnost viru byla zjištěna i v BAL zdravých osob. Z dostupných publikací je zřejmé (Tab. 2), že virová nálož u pacientů s pneumonií je signifikantně vyšší než u asymptomatických pacientů nebo zdravých dobrovolníků. Pravděpodobnost CMV infekce je spojena s virovou náloží > 105 kopií/1 ml BAL. Nicméně samostatné kvantitativní stanovení metodou PCR v BAL není pro diagnostiku dostatečné a doporučuje se korelace s nálezem viru v periferní krvi a klinickými příznaky.
DETEKCE CMV V LIKVORU
Virová encefalitida je velice vzácnou infekční komplikací u pacientů po alogenní TKB. Její incidence je méně než 2 %, z toho se na ní CMV podílí 6 %.(10) Pro její diagnózu je klíčový průkaz CMV v likvoru metodou PCR. V práci Reddy a kol.(11) je shrnuto 11 případů CMV infekce CNS, ve všech případech byla spojena s předchozí detekcí CMV v krvi, opakovanou preemptivní terapií ganciklovirem nebo foscavirem a vznikem rezistence CMV. Pro detekci CMV v likvoru není možné jednoznačně určit kritickou virovou nálož, obecně se dá říci, že jakýkoliv záchyt CMV v likvoru je nutné považovat za závažný, zvlášť při nepřítomnosti buněk v likvoru a v případech popsaných výše.
DETEKCE CMV VE TKÁNI
V současné době není technicky žádný problém detekovat nukleové kyseliny v jakémkoli biologickém vzorku včetně tkání. Důležité je odebíraný vzorek nefixovat před odesláním do laboratoře ve fixačním roztoku a vzorek odeslat nativní (ať jen v suché zkumavce či malém množství fyziologického roztoku) nebo pouze zamražený. Problém s kvantitativní detekcí pak spočívá v interpretaci nálezu, protože ta může být ještě složitější než v případě BAL. I proto by součástí potvrzení CMV nemoci mělo být histologické vyšetření se zaměřením na CMV. Platí ale také, že při nasazení virostatické terapie může být výsledek histologického vyšetření modifikován a přítomnost infekce prokáže jen vysoká nálož v bioptickém vzorku. Při rozvinuté CMV nemoci a orgánovém postižení je pak tato nálož často významně pozitivnější (o několik řádů) než výsledky z periferní krve.
Rezistence CMV na léčbu virostatiky INCIDENCE CMV REZISTENCE
Vznik rezistence na virostatika je relativně vzácná, ale závažná komplikace léčby CMV, která byla popsána u pacientů infikovaných HIV po transplantaci solidních orgánů a TKB. Incidence výskytu rezistentních kmenů se u jednotlivých skupin pacientů liší. Nejčastěji je vznik rezistence dokumentován u HIV pacientů, u nichž je asi 8 % po terapii delší než tři měsíce.(12) U pacientů po TKB je incidence vzniku rezistence na ganciklovir (GCV) odhadována na 2–8 % léčených pacientů a obvykle se objevuje po 2–3 měsících terapie.(13) Velmi rychlý vznik od počátku terapie je popisován u pediatrických pacientů, u nichž může dojít k rozvoji již během několika týdnů trvající terapie a incidence výskytu je přibližně 5,1 %.(14) U pacientů po transplantaci solidních orgánů je udáván medián vzniku rezistence 10 měsíců a incidence 4–6 %.(15) Rizikovými faktory vzniku rezistence jsou dlouhotrvající expozice léku, T-buněčná deplece, vysoké dávky virostatik a suboptimální dávky virostatik z důvodu redukované absorbce nebo špatné spolupráce ze strany pacienta.
Podezření na vznik rezistence je spojeno se zhoršenou odpovědí na terapii a rozvoj rezistence by měl být očekáván a vzorky testovány na přítomnost rezistentních kmenů u pacientů léčených virostatiky, u nichž CMV DNA nálož v krvi neklesá po 14 dnech terapie, a to především u ne-leukopenických a předléčených
pacientů.(13)
VIROSTATIKA POUŽÍVANÁ K LÉČBĚ CMV
V současné době jsou k léčbě HCMV infekce licencovány tři léky. Lék první volby je ganciklovir (GCV), který je v buňce infikované CMV nejprve fosforylován virovou proteinkinázou pUL97, a následně buněčnými kinázami do formy GCV trifosfátu. Virostatický účinek GCV je výsledkem inhibice syntézy virové DNA. Orální forma GCV – valganciklovir (VGCV) – je nejprve hydrolyzována v gastrointestinálním traktu střevními a jaterními esterázami na GCV, tato forma léčiva umožňuje lepší vstřebávání a jeho biologická dostupnost je ve srovnání s orálním GCV 10krát vyšší. Dalším virostatikem s odlišným mechanismem účinku je foskavir (FOS). Mechanismus účinku spočívá ve vazbě FOS na virovou polymerázu. Dochází tak k její inhibici a inhibici virové proliferace. Nevyžaduje počáteční fosforylaci proteinkinázou pUL97. Dalším virostatikem je cidofovir (CID), který také nevyžaduje počáteční fosforylaci a působí jako nukleosidový analog, který inhibuje syntézu virové DNA. Schematické znázornění působení virostatik je znázorněno na Obr. 3. Se vznikem rezistence souvisí dva relevantní geny – gen UL97, který kóduje virovou proteinkinázu, a UL54, kódující virovou DNA polymerázu. Mutace genu UL97 jsou spojeny pouze s rezistencí na GCV a jsou detekovány až u 85–95 % pacientů s rozvojem rezistence na GCV, zatímco mutace v UL54 způsobují rezistencí i na ostatní virostatika – FOS a CID. Pokud jsou nalezeny mutace v UL54 u pacienta léčeného GCV, virus může být rezistentní také k CID, zatímco zkřížená rezistence k FOS je vzácná.(16) Mutace způsobující rezistenci na FOS se objevují obvykle pouze u pacientů léčených FOS.
MUTACE V GENECH UL97 A UL54 Analýzy in vivo ukazují, že nejčastějším typem mutací UL97 jsou jednonukleotidové bodové mutace v kodonech 460, 594 a 595. Mutace nalezené v klinických vzorcích jsou shromážděny v kodonech 460, 520 a 590–607 a ve více než 80 % izolátů pacientů s terapií GCV se nacházejí mutace M460V/I, H520Q, C592G, A594V, L595S a C603W.(17) V genu UL54 je ve srovnání s UL97 větší počet a diverzita mutací, které se nacházejí v oblasti dlouhé 2,5 kbp, kterou je nutné vyšetřit. V tomto genu se nachází velké množství mezikmenových polymorfismů, jež mohou komplikovat interpretaci výsledku. Mutace způsobující rezistenci na GCV jsou nejčastěji identifikovány mezi kodony 400–600 a 900–1000. V těchto lokusech mutace způsobují rezistenci na GCV a CID, ale na FOS obvykle ne. Mutace vedoucí k rezistenci na FOS se objevují mezi kodony 696–850 a mutace v těchto místech nezpůsobují obvykle zkříženou rezistenci na ostatní virostatika.(18)
METODY DETEKCE MUTACÍ VEDOUCÍCH K REZISTENCI CMV NA LÉČBU
Pro stanovení rezistence k virostatiku lze využít dva přístupy – fenotypickou a genotypickou analýzu. Fenotypické metody jsou založeny na stanovení koncentrace antivirotika potřebného pro redukci virového růstu v buněčné kultuře. Zlatým standardem je plaková redukční metoda. Klinický izolát je inokulován na monovrstvu buněčné kultury společně se snižující se koncentrací antivirotik a po několika dnech je zhodnocen počet plaků srovnáním s kontrolním vzorkem a stanovena 50% inhibiční koncentrace (IC50). Tyto klasické metody jsou časově velmi náročné, a proto nejsou vhodné pro rutinní diagnostickou praxi. Nespornou výhodou je ale jednoznačný popis fenotypu (míry rezistence) vyšetřovaného kmene a jsou proto nutnou součástí validací metod genotypických. Zásadní výhodou genotypických metod je jejich relativní časová nenáročnost (detekce je prováděna přímo v klinickém vzorku), vysoká citlivost a možnost stanovení mutantní subpopulace. Nevýhodou ovšem může být ne zcela jasně charakterizovaný fenotyp všech detekovaných mutací. Nejběžnějším způsobem detekce mutací je sekvenační analýza příslušné oblasti genu. Konvenční Sangerovo sekvenování umožňuje detekovat mutovanou populaci viru, pokud je její zastoupení vyšší než 10–20 %. Pro snadnější interpretaci výsledků detekce mutací v genech UL97 a UL54 lze použít dostupný server (http:www.informatik.uni-ulm.de/ni/mitarbeiter/HKestler/ hcmv/), který zadanou sekvenci srovná s dostupnými referenčními sekvencemi a vyhledá dostupné publikované zdroje týkající se konkrétní mutace.(19) V současné době se i objevují nové sekvenační technologie, tzv. sekvenování nové generace (NGS – next generation sequencing), které zvyšuje citlivost záchytu až na 1 %. Nevýhodou těchto nových přístupů jsou však vysoké provozní náklady.(17) Další možností detekce mutací je PCR spojená se štěpením PCR produktů restrikčními enzymy (RFLP – restriction fragment length polymorphism), analýza polymorfismu délky restrikčních fragmentů, která je založená na vzniku nebo zániku restrikčního místa v sekvenci vlivem mutace (Obr. 4). Tato metoda je vhodná pro screening nejčastějších mutací, stejně jako specifické PCR navržené přímo pro takovou detekci.(20)
Závěr
Molekulárněbiologické metody, především real-time PCR, umožňují detekci a kvantifikaci CMV v širokém spektru biologických materiálů. I přes velké pokroky v této oblast však stále chybí standardizace postupů a stanovení prediktivních hladin CMV v různých klinických vzorcích. Důvodem je velká variabilita v použitých metodách, výběru cílových genů a hodnocení nálezů v laboratořích. Avšak i přes to monitorování výskytu CMV u pacientů s hematologickými malignitami významně přispívá k úspěšné léčbě a snižuje riziko úmrtí z důvodu této závažné infekční komplikace.
Poděkování: tato práce podpořena projektem MZ-RVO (FNBr, 65269705) a projektem IGA MZ ČR NT13691-4/2012.
Prohlášení: autor v souvislosti s tématem práce nespolupracuje s žádnou farmaceutickou firmou..
Literatura
1. KRÓL, L., STUCHLÝ, J., HUBÁČEK, P., et al. Signature profiles of CMV-specific T-cells in patients with CMV reactivation after hematopoietic SCT. Bone Marrow Transplant, 2011, 46, p. 1089–1098.
2. EMERY, VC., COPE, AV., BOWEN, EF., et al. The dynamics of human cytomegalovirus replication in vivo. J Exp Med, 1999, 190, p. 177–182.
3. BOECKH, M., HUANG, M., FERRENBERG, J., et al. Optimization of quantitative detection of cytomegalovirus DNA in plasma by real-time PCR. J Clin Microbiol, 2004, p. 1142–1148.
4. LENGEROVA, M., RACIL, Z., VOLFOVA, P., et al. Real-time PCR diagnostics failure caused by nucleotide variability within exon 4 of the human cytomegalovirus major immediate-early gene. J Clin Microbiol, 2007, 45, p. 1042–1044.
5. WAGGONER, J., HO, DY., LIBIRAN, P., PINSKY, BA. Clinical significance of low cytomegalovirus DNA levels in human plasma. J Clin Microbiol, 2012, 50, p. 2378–2383. 6. HEBART, H., LENGERKE, C., LJUNGMAN, P., et al. Prospective comparison of PCR-based vs late mRNA-based preemptive antiviral therapy for HCMV infection in patients after allo-SCT. Bone Marrow Transplant, 2011, 46, p. 408–415.
7. BOECKH, M., LJUNGMANM P. How we treat cytomegalovirus in hematopoietic cell transplant recipients. Blood, 12009, 113, p. 5711–5719.
8. RUELL, J., BARNES, C., MUTTON, K., et al. Active CMV disease does not always correlate with viral load detection. Bone Marrow Transplant, 2007, 40, p. 55–61.
9. WESTALL, GP., MICHAELIDES, A., WILLIAMS, TJ. Human cytomegalovirus load in plasma and bronchoalveolar lavage fluid: a longitudinal study of lung transplant recipients. J Infect Dis, 190, p. 1076–1083.
10. SCHMIDT-HIEBER, M., SCHWENDER, J., HEINZ, WJ., et al. Viral encephalitis after allogeneic stem cell transplantation: a rare complication with distinct characteristics of different causative agents. Haematologica, 2011, 96, p. 142–149.
11. REDDY, SM., WINSTON, DJ., TERRITO, MC., SCHILLER, GJ. CMV central nervous system disease in stem-cell transplant recipients: an increasing complication of drug-resistant CMV infection and protracted immunodeficiency. Bone Marrow Transplant, 2010, 45, p. 979–984.
12. WOLF, DG., SMITH, IL., LEE, DJ., et al. Mutations in human cytomegalovirus UL97 gene confer clinical resistance to ganciclovir and can be detected directly in patient plasma. J Clin Invest, 1995, 95, p. 257–263.
13. EMERY, V., ZUCKERMAN, M., JACKSON, G., AITKEN, C., OSMAN, H., PAGLIUCA, A., POTTER, M., PEGGS, K., CLARK, A., British Committee for Standards in Haematology tBSoBaMTatUVN. Management of cytomegalovirus infection in haemopoietic stem cell transplantation. Br J Haematol, 2013, 162, p. 25–39.
14. KIM, YJ., BOECKH, M., COOK, L., et al. Cytomegalovirus infection and ganciclovir resistance caused by UL97 mutations in pediatric transplant recipients. Transpl Infect Dis, 2012, 14, p. 611–617.
15. HANTZ, S., GARNIER-GEOFFROY, F., MAZERON, MC., GARRIGUE, I., MERVILLE, P., MENGELLE, C., ROSTAING, L., SAINT MARCOUX, F., ESSIG, M., REROLLE, JP., COTIN, S., GERMI, R., PILLET, S., LEBRANCHU, Y., TURLURE, P., ALAIN, S., Group FCRSS. Drug-resistant cytomegalovirus in transplant recipients: a French cohort study. J Antimicrob Chemother, 2010, 65, p. 2628–2640.
16. ECKLE, T., PRIX, L., JAHN, G., et al. Drug-resistant human cytomegalovirus infection in children after allogeneic stem cell transplantation may have different clinical outcomes. Blood, 2000, 96, p. 3286–3289.
17. LURAIN, NS., CHOU, S. Antiviral drug resistance of human cytomegalovirus. Clin Microbiol Rev, 2010, 23, p. 689–712.
18. SMITH, IL., CHERRINGTON, JM., JILES, RE., et al. High-level resistance of cytomegalovirus to ganciclovir is associated with alterations in both the UL97 and DNA polymerase genes. J Infect Dis, 1997, 176, p. 69–77.
19. CHEVILLOTTE, M., von EINEM, J., MEIER, BM., et al. A new tool linking human cytomegalovirus drug resistance mutations to resistance phenotypes. Antiviral Res, 2009, 85, p. 318–327.
20. LOCHMANOVA, J., LENGEROVA, M., VOLFOVA, P., et al. Quantitative monitoring of wild-type and ganciclovir (GCV) resistant human cytomegalovirus strains in consecutive episodes of virus reactivation in immunocompromised patiens. Abstracts 49th ICAAC, San Francisco.
e-mail: mlengerova@fnbrno.cz
Tab. 1 Výhody a nevýhody použití in-house a komerčních laboratorních souprav
In house metody Komerční soupravy
+ nízké náklady na vyšetření - vysoké náklady na vyšetření
+ dlouholeté zkušenosti s používáním – lepší možnost - neposkytují informaci o interpretaci – tj. nutno stanovit si
interpretace výsledků vlastní cut-off
- vyžaduje personál s velkými zkušenostmi s metodami + rychlé zavádění nových metod do praxe
mol. biologie – příprava standardů atd.
- nutná důslednější kontrola celého procesu (nové šarže + vysoká standardizace vyšetření s malým úsilím
oligonukleotidů, master-mixu atd.)
- nutnost zapracování vlastních interních kontrol do analýzy + u některých kitů rozsáhlý systém kontrol celého procesu
(včetně izolace DNA)
Tab. 2 Kvantifikace CMV v BAL
Autor Typ transplantace Metoda Hodnocení
Westall a kol.(7) plíce COBAS Amplicor HCMV 46 000 kopií/ml BAL – histologicky potvrzená CMV pneumonie
Monitor test (Roche) > 64 000 kopií/ml BAL – specifické klinické příznaky
Riise a kol.(17) plíce, plíce a srdce in-house real-time PCR pacienti po transplantaci se signifikantně vyšší náloží než pacienti bez
transplantace (1120 vs. 180 kopií/ml BAL), avšak pacienti s pneumonií
a bez pneumonie nebyli dostatečně rozlišení
Chemaly a kol.(18) plíce CMV Hybrid Capture Assay, > 500 000 kopií/ml BAL – histologicky potvrzená CMV pneumonie
(Digene Corporation)
Gerna a kol.(19) plíce in-house real-time PCR 100 000 kopií/ml BAL – hraniční hodnota pro preemptivní terapii
Travi a kol.(20) TKB in-house real-time PCR rozdíl mezi pacienty s CMV pneumonií a asymptomatickými (medián
50 828 vs. 194 kopií/ml BAL),
6000 kopií/ml BAL (specificita 92 % a senzitivita 62 % pro diagnózu
CMV pneumonie)
BAL – tekutina získaná bronchoalveolární laváží, HCMV – lidský cytomegalovirus,
TKB – transplantace hematopoetických kmenových buněk, PCR – polymerázová řetězová reakce
Summary
Lengerova, M., Volfova, P., Racil, Z. Laboratory diagnostics of CMV infections in patients with haematological malignancies Human cytomegalovirus (CMV) infection is the cause of serious infections in immunocompromised patients. Regular monitoring of serum viral load has become an integral part of the care for patients after stem cell transplantation. A number of diagnostic methods was developed for detection of CMV, from which molecular-biological methods are the most significant ones, especially quantitative real-time PCR. This method allows us to determine the size of the viral load, but there has not yet been a clearly defined cut-off level of virus load predicting the development of CMV disease. This review article summarises the current knowledge about the diagnostics of CMV infection mainly based on the detection of the virus using molecular-biological methods and their role in pre-emptive approach to therapy. Furthermore, we discuss the problem of CMV resistance
to administered antivirals and detection of mutations leading to resistance.
Key words
cytomegalovirus * quantitative real-time PCR * peripheral blood * cerebrospinal fluid * bronchoalveolar lavage * CMV resistance
O autorovi| 1,2Mgr. Martina Lengerová, Ph. D., 1Mgr. Pavlína Volfová, Ph. D., 1,2doc. MUDr. Zdeněk Ráčil, Ph. D. 1Masarykova univerzita, Lékařská fakulta a Fakultní nemocnice Brno, Interní hematologická a onkologická klinika 2Masarykova univerzita, CEITEC – Středoevropský technologický institut, Brno
Obr. 1 Příklad výsledku detekce a kvantifikace CMV metodou real-time PCR. Červené křivky – amplifikace tzv. standardní DNA (DNA o známé koncentraci v různých ředěních, která slouží pro sestrojení kalibrační křivky), modré křivky – detekce CMV v klinických vzorcích.
Obr. 2 Vztah rychlosti replikace CMV a cut-off pro zahájení léčby u různých rizikových skupin Upraveno podle(7)
Obr. 3 Mechanismus účinku virostatik Upraveno podle(17) GCV – ganciklovir, CDV – cidofovir, FOS – foscavir
R