Summary
Mencl, K. Practical experience from the mycological laboratory (illustrative appendix) This article provides a general overview of mycological laboratory diagnostics current options in the field of invasive fungal infections, which are constantly increasing over time, particularly in immunocompromised individuals. The article is based on both author's own experience with the operation of a medical mycology laboratory and the experience of other collaborating laboratories and internet resources. Individual diagnostic procedures are mentioned, their significance is commented and some alternative or enhanced diagnostic schemes are offered. Emphasis is placed on interdisciplinary cooperation.
Laboratorní diagnostika mykotických infekcí, zvláště pak těch invazívních, se neobejde bez těsné a účinné mezioborové spolupráce kliniků s prakticky celým komplementem. Pouze provázanost jednotlivých diagnostických a léčebných postupů včetně zpětné vazby na získané výsledky vede u těžce imunosuprimovaných pacientů ke snížení morbidity a mortality na mykotické infekce.
Částečně se tento stav snaží řešit systém akreditací medicínských provozů a jejich standardní operační postupy (SOP) a správná laboratorní práce (SLP), které všechny vycházejí – či lépe, měly by vycházet – z toho nejnovějšího v medicínském poznání. Paradoxně však na druhou stranu svazují ruce v oblasti jejich inovací, kdy nelze k diagnostice použít neschválené postupy a vše v dobré víře použité navíc ztrácí také finanční oporu ve vyúčtovatelných výkonech. Jak je uvedeno výše, je laboratorní diagnostika invazívních mykotických infekcí i přes současné značné znalosti a technické možnosti záležitostí nesnadnou. Limitující jsou zvláště časové dimenze pro jednotlivá vyšetření, která pak jednotlivě představují kamínky do mozaiky pro finální interpretaci. A ta bude vždy pokulhávat, pokud všichni zúčastnění nebudou mít o každém řešeném případu dostatek informací. Pomocný může být dobře fungující nemocniční informační systém s centrálním úložištěm dat, ale i v takovém případě je pro zahájení kvalitního cíleného laboratorního vyšetření vždy potřeba udat zásadní první impulz. Ve chvíli, kdy jsou pracovníci laboratoře postaveni před jasný cíl, může se rozvinout boj o čas a kvalitu vyšetření. Výběr laboratorních postupů také velmi závisí na technickém a personálním vybavení každé laboratoře. A každá laboratoř by měla znát své možnosti a schopnosti, tedy znát, zda může dodržet nepodkročitelné minimum laboratorní diagnostiky invazívních mykóz. Není-li v jejích silách toto zajistit, je nutné, aby část a/nebo celé vyšetření předala pracovišti s většími možnostmi.
Možnosti mykologické diagnostiky, které jsou rozebírány v dalším textu tohoto příspěvku, by měly vždy zohledňovat jeden základní fakt. Klinik v prvotní fázi diagnostiky nepotřebuje znát přesnou identifikaci zachycené houby, ale potřebuje znát, zda se jedná skutečně o invazívní mykózu, zda je působena kvasinkou nebo vláknitou mikromycetou a zda je nutné zahájit terapii, případně jakou.
V praktickém pohledu má laboratoř pro diagnostiku mykóz k dispozici mikroskopické, kultivační a sérologické/imunologické techniky nebo techniky PCR. Pro hrubou orientaci v možnostech laboratorní diagnostiky jsou v dalším textu uvedeny kromě jednotlivých technik také názvy diagnostických souprav a možnosti získání bližších údajů o jejich distribuci a použití. V předloženém příspěvku jsou také jako alternativa pro laboratorní diagnostiku invazívních mykotických infekcí nabídnuty dva postupy (vyšetření sputa a vyšetření nesrážlivé krve) a interpretace získaných výsledků na základě vlastních zkušeností.
Mikroskopické vyšetření
Tento typ vyšetření je možné považovat za nejrychlejší možnou mykologickou techniku. Zvláště mikroskopie tekutých materiálů by však měla být provedena neprodleně po obdržení materiálu. Vzhledem k životaschopnosti a pokračujícímu růstu mikromycet ve vyšetřovaném materiálu (zvláště kvasinek) může při odloženém zpracování dojít až k mikroskopickému „znehodnocení“ vzorku a snížení jeho vypovídací hodnoty. Zcela běžně jsou v laboratořích dostupná barvení podle Grama a barvení Giemsa-Romanowski, která v podstatě nepotřebují žádný komentář. Velmi snadno proveditelnou technikou využitelnou pro mikroskopickou diagnostiku Cryptococcus neoformans, průkaz jeho polysacharidových pouzder, je použití tušového preparátu podle Burriho, jak přímo v hodnocení biologického materiálu (např. likvor), tak při identifikaci kultury. Burriho technika je velmi jednoduchá, rychlá a vzhledem k diagnostikovanému agens též velmi přesná.
Má-li laboratoř k dispozici fluorescenční mikroskop, může ho využít pro rychlou diagnostiku přítomnosti vláknitých mikromycet pomocí některého z fluorochromů, např. Rylux BSU (Obr. 1). Touto technikou lze pomocí roztoku KOH detekovat mikromycety velmi rychle také v bioptických vzorcích. Mohu potvrdit, že v pozitivním případě lze nález houby předpokládat již za 20–30 minut od obdržení bioptátu. Z vlastní zkušenosti mohu také doporučit techniku barvení podle Gram-Weigerta, původně určenou k diagnostice cyst Pneumocystis jiroveci, grampozitivních mikroorganismů a fibrinu. Touto barvicí technikou se však velmi dobře zobrazí i vlákna mikroskopických vláknitých hub, která jde od ostatních struktur obsažených v biologickém materiálu (fibrin) bezpečně odlišit (Obr. 2). Na podložní sklíčko by však mělo být naneseno a následně rozprostřeno více materiálu, než je obvyklé u klasických preparátů.
Základní kultivační vyšetření
Tento typ mykologického vyšetření je až na některé speciality poměrně jednoduchou záležitostí, protože mikroskopické houby jsou velmi málo náročné organismy a jsou schopny růstu prakticky na všech běžných kultivačních médiích. První známky růstu můžeme zaznamenat většinou již po 24hodinové inkubaci při teplotě 37 °C (Obr. 3), po 48 hodinách by již nemělo být pochyb, zvláště u kvasinek. V případě vláknitých hub typu Aspergillus lze po 24hodinové inkubaci při rutinní mikrobiologické diagnostice snadno přehlédnout jejich nenápadný počáteční růst na půdách pro bakteriologickou diagnostiku, což by však nemělo být problémem na mykologické půdě, zvláště po dvou dnech (Obr. 4). Při suspektní anamnéze však doporučuji pečlivě sledovat i základní bakteriologické půdy a případně u nich následně prodloužit inkubaci. Také jsme již mnohokrát pozorovali, že při nízké náloži např. aspergilových zárodků překryjí jejich iniciální růst kvasinky a pouze prodloužená kultivace dovolí, aby se Aspergillus doslova „vyškrábal“ na povrch nebo dosáhl okraje kvasinkové masy (Obr. 5). Pro inspiraci může posloužit ukázka možného alternativního zpracování materiálu v mykologické laboratoři, jak je zobrazeno na Obr. 6.
Specifickým laboratorním vyšetřením jsou při invazívních mykózách hemokultivace. V současné době jsou u nás za zlatý standard považovány automatické detekční systémy BacT/Alert (bioMérieux, Francie) a Bactec (Becton Dickinson, USA). Pozitivní hemokultura z těchto automatů ve spojení s mikroskopickým vyšetřením dává rychlý obraz o etiologickém agens. Přestože je tento automatický systém pro hemokultivace naprosto dostačující laboratorní metodou, dovoluji si v příloze nabídnout schéma zpracování nesrážlivé krve za použití dalších dostupných technik (Obr. 7). Postup je sice pracnější, ale při jasném podezření na invazívní mykózu se může využít pro zrychlení a rozšíření diagnostiky, nejlépe paralelně s dalšími technikami. Celé schéma postupu vzniklo kombinací některých imunologických, sérologických a kultivačních postupů.
Kultivační vyšetření a dostupnost základních i speciálních médií bude vbrzku narážet na problematiku akreditací pracovišť zmiňovanou již v prologu tohoto sdělení. Málokteré pracoviště si bude schopno udržet funkční akreditovanou varnu půd. Naštěstí je již na trhu vedle dodavatelů široké škály základů pro výrobu kultivačních médií (Tab. 1) také velmi dobrá nabídka již hotových půd od dalších renomovaných dodavatelů (Tab. 2). A díky internetovým zdrojům dnes není problém nalézt všechny dostupné a potřebné informace a současně porovnat jejich vhodnost a výhodnost. Je třeba jen doufat, že výrobci a dodavatelé hotových médií budou slyšet i na naše prosby pro zhotovení speciálních či vysoce speciálních kultivačních půd, byť by to bylo jen v malých objemech nebo jako speciální zakázka.
Identifikace mikroskopických hub
Díky řadě komerčně dodávaných identifikačních souprav není identifikace kultivovaných mikroskopických hub dnes takovým problémem, jako tomu bylo ještě před několika málo lety.
Kvasinky patří mezi nejčastěji identifikované mikromycety a dnes je již obsoletní, aby laboratoř vydala výsledek s označením „non-albicans“. Jednu z možností základní identifikace kvasinek nabízí Obr. 8; je však skutečně pouze orientační a pro řešení invazívních mykóz se samostatné použití zcela nehodí. Osobně doporučuji učinit tento postup pouze souběžně se všemi ostatními moderními postupy. Těmi mohou být jak některá chromogenní média (Tab. 3, Obr. 9), tak další identifikační soupravy (Tab. 4). Tato kombinace se vyplácí zvláště v případě nechtěné kontaminace identifikované kultury.
Vláknité houby nejsou tak frekventované jako kvasinky, zato jejich identifikace je mnohem složitější, než je tomu u kvasinek. Každá mykologická laboratoř by však měla být na základě makro- a mikromorfologických znaků kultivované houby schopna tuto identifikovat alespoň rodově (Aspergillus, Fusarium, Paecilomyces, Penicillium…) nebo skupinově (zygomycety).
Vzhledem k tomu, že nejčastějším identifikovaným agens je Aspergillus fumigatus ( > 90 %), který je na běžných médiích poměrně charakteristický svou texturou povrchu kolonie a charakteristickým mikroskopickým obrazem (Obr. 10), nečiní jeho identifikace problém. Stejně v případě A. fumigatus, tak i u ostatních vláknitých hub je však v první řadě nutné rozhodnout, zda se může jednat o etiologické agens nebo jde o kontaminaci vzorku. Z vlastní zkušenosti doporučuji hypoteticky předpokládat etiologický původ i u ojedinělých nálezů a podnikat veškeré následné diagnostické kroky (opakovaná kultivace, kultivace nového materiálu, sérologie apod.) až do potvrzení nebo vyloučení této hypotézy. Samozřejmostí by mělo být okamžité kontaktování příslušného klinického pracoviště, jeho seznámení s nastalou situací a společná koordinace postupu dalších vyšetření a případné terapie.
Testy citlivosti
Zhodnocení rezistence/citlivosti mykotických agens na antimykotika bývá u invazívních mykóz považováno za běžný standard. Protože se však jedná o tematiku, která zasluhuje daleko širší prostor, než je vymezen tomuto příspěvku, přikládám pouze tabulku s přehledem nabídek pro tuto oblast (Tab. 5).
Sérologické metody
V současné době mají tyto metody velmi výrazný podíl jak na identifikaci mikromycet, tak na diferenciální diagnostice invazívních mykóz. Jejich využití menšími laboratořemi je však problematické z důvodu vyšší finanční zátěže při nízkém objemu vyšetřovaného materiálu. Těmto laboratořím lze pro zajištění mykologických sérologických vyšetření doporučit vazbu na specializované pracoviště v jejich dosahu. Podle typu jednotlivých pracovišť tak lze učinit smluvně nebo pouze ústní dohodou.
Stejně jako v jiných případech, tak i v případě sérologie/imunologie odzvonilo „home-made“ technikám a ve snaze o standardizaci se veškerá vyšetření provádějí na komerčně dodávaných setech, jejichž přehled uvádím v Tab. 6. Každá laboratoř si podle svých možností a schopností může vybrat z jednoduchých i složitějších metod. Doporučuji však nezapomínat na fakt, že až na výjimky je každý výsledek pouhým kamínkem do diagnostické mozaiky a každá ze jmenovaných technik je zatížena různou citlivostí a specificitou.
Genetické a molekulárněbiologické metody
Tato část diagnostiky je stále ještě vázána hlavně na specializovaná pracoviště, většinou v součinnosti s mikrobiologickými ústavy fakult nebo vědeckovýzkumnými centry. Na své širší uplatnění v rutinní diagnostice si bude muset asi ještě nějakou tu chvíli počkat. Použití molekulárněgenetických metod je možné jak pro přímou detekci houbového genomu v biologickém majako teriálu, tak pro identifikaci, případně typizaci kultur. U přímé detekce se však potýká s falešnou pozitivitou i negativitou. Použití pro rutinní identifikaci mikroskopických hub se pak, bohužel, za současného stavu financování zdravotnictví jeví jako ekonomický hazard.
Závěr
Z uvedeného výčtu možností diagnostiky invazívních mykotických infekcí a identifikací kultivovaných agens je zřejmé, že se spektrum možností za posledních 20 let výrazně rozšířilo. Přesto, že základem diagnostiky stále zůstávají mikroskopické a kultivační metody, je dostupná řada komerčně vyráběných kultivačních, identifikačních a sérologických/imunologických setů, které výrazně rozšiřují, zrychlují, zpřesňují a v neposlední řadě také zpříjemňují mykologickou diagnostiku. Ani přes výrazný technický a technologický pokrok však nesmíme zapomínat, že mykologická diagnostika je mezioborovou záležitostí a závisí na komunikaci mezi všemi zúčastněnými aktéry.
O autorovi:MUDr. Karel Mencl, CSc.
Pardubická krajská nemocnice, a. s., Oddělení klinické mikrobiologie