Zdravotnictví a medicína dávají prostor mladým lékařům, kteří dosáhli objektivních úspěchů. Tento projekt přináší podrobnosti z významných vědeckých prací či klinických studií mladých autorů. Následující materiál napsal proZdraví.Euro.cz MUDr. Radek Špíšek, PhD (*1975).
V uplynulých deseti letech strávil většinu času v laboratořích prestižních zahraničních univerzit studiem praktického využití dendritických buněk při terapii nádorových onemocnění. Je spoluautorem studií, které v USA vzbudily velký ohlas. Odkazy na vybrané práce autora najdete na konci článku. Rozhovor s autorem čtěte ZDE.
Tento článek shrnuje nová fakta o biologii nejúčinnějších buněk prezentujících antigen, dendritických buněk. V druhé části jsou diskutovány nové trendy v imunoterapii nádorových onemocnění pomocí protinádorových vakcín založených na dendritických buňkách.
Role imunitního systému a aktivace imunitní reakce
Infekce byly až do objevu účinných antimikrobiálních léků nejčastější příčinou smrti a průměrná délka života se ještě na počátku 20. století pohybovala, kvůli vysoké úmrtnosti dětí do 10 let, mezi třiceti pěti a čtyřiceti lety. Imunitní systém je tedy evolučně nastaven tak, aby chránil integritu organismu do okamžiku dosažení reprodukční zralosti a jeho hlavním úkolem je obrana proti infekcím.
Prudký nárůst průměrné délky života po zavedení preventivních očkovacích programů a antiinfekční terapie je spojen s nárůstem incidence nádorových onemocnění. Řada výzkumných týmů se intenzivně zabývá otázkou, zda imunitní systém hraje roli i v obraně proti nádorově transformovaným buňkám, zda lze proti nádorovým tkáním vyvolat imunitní odpověď a zda indukce protinádorové imunitní reakce může vést ke zlepšení prognózy nádorových onemocnění.
Protinádorová terapie se v posledních letech dostává do centra zájmu díky několika zásadním objevům v porozumění mechanismům, které kontrolují aktivaci imunitního systému, a také díky pokroku v laboratorních technologiích, který umožňuje manipulaci s buňkami imunitního systému in vitro.
Obratlovci mají pro účinnou obranu proti infekcím k dispozici dvě hlavní složky imunitního systému - systém nespecifické (přirozené) imunity a systém imunity specifické (adaptivní). Složky nespecifické imunity, ať již buněčné (makrofágy, NK buňky, granulocyty) nebo humorální (komplement, antimikrobiální peptidy, cytokiny), jsou schopny rychlé detekce přítomnosti patogenu v organismu. Obranná reakce je v případě nespecifické imunity velmi rychlá, uniformní a často vede k úplné eliminaci patogenního agens bez nutnosti zapojení specifické imunity. Nespecifická imunita nemá mechanismy, které by zabezpečily vznik imunologické paměti.
| DÁLE ČTĚTE: Uspět v zahraničí a vrátit se domů |
Klíčovým mechanismem pro funkci specifické imunity je vznik antigen specifických receptorů na B a T lymfocytech. Výsledkem náhodného přeskupování genových segmentů u genů pro T a B buněčné receptory je existence obrovského množství receptorů s přesně definovanou specifitou. Daní za tuto velkou zásobárnu antigen specifických lymfocytů je, že lymfocytů pro jeden určitý antigen je velmi malé množství. Frekvence lymfocytů pro určitý antigen se nejčastěji pohybuje kolem 1-2x 10-5.
Tak malý počet buněk specifických pro antigen je pro časnou obranu proti infekcím nepoužitelný. Po aktivaci specifického lymfocytu musí nejprve dojít ke klonální expanzi a teprve po vytvoření dostatečné populace efektorových buněk dojde k rozvoji primární specifické imunitní reakce. Tento proces většinou trvá 4-7 dní, a po tuto dobu je tedy potřeba, aby obranu zajistila nespecifická imunita. Při opakovaném setkání se stejným patogenem je již situace odlišná. V organismu jsou již vytvořeny paměťové T a B lymfocyty a sekundární imunitní odpověď je mnohem rychlejší.
Kromě toho, že rozvoj primární specifické imunitní odpovědi trvá dlouho, je ještě důležité zdůraznit, že samotná aktivace antigen specifických T lymfocytů je poměrně složitý proces, který je pod velmi přísnou kontrolou. Je to nezbytné proto, že aktivace nesprávných lymfocytů může mít fatální následky, např. v podobě autoimunitních onemocnění. Pro účinnou aktivaci musí být antigen předkládán v lymfatických uzlinách antigen prezentujícími buňkami. Nejúčinnějším představitelem antigen prezentujících buněk jsou dendritické buňky, které jediné dokážou aktivovat naivní T lymfocyty. Plní tedy roli prostředníka mezi systémy nespecifické a specifické imunity, bez kterého nedojde k rozvoji plnohodnotné imunitní reakce.
Životní cyklus dendritických buněk
Dendritické buňky byly popsány Ralphem Steinmanem v roce 1973 a pojmenovány podle charakteristické morfologie s množstvím výběžků, dendritů. Zásadní zlom ve studiu dendritických buněk nastal v polovině 90. let, kdy byly publikovány protokoly popisující kultivaci dendritických buněk z monocytů nebo kmenových hematopoetických buněk zdravých dárců za přítomnosti GM-CSF (Granulocyte-Monocyte-Colony stimulating factor) a IL-4.
| ÚSPĚŠNÍ MLADÍ LÉKAŘI: Zdravotnictví a medicína dávají prostormladým lékařům, kteří dosáhli objektivníchúspěchů.Tipy na osobnosti můžete zasílat na adresu: bezdekova@mf.cz |
Dendritické buňky se diferencují z kmenových hematopoetických buněk v kostní dřeni. Z krevního oběhu vstupují do tkání, kde se vyskytují především v takzvaném nezralém stavu. Nezralé dendritické buňky exprimují na svém povrchu velké množství molekul umožňujících pohlcování nejrůznějších antigenních částic (viry, bakterie, infikované, nádorové či odumřelé buňky). V tomto nezralém stavu mají na svém povrchu pouze malé množství MHC a kostimulačních molekul, které nedostačuje k zahájení imunitní odpovědi.
Navíc antigen specifické lymfocyty jsou lokalizovány v sekundárních lymfatických orgánech, a pro jejich aktivaci je tedy nutné, aby se dendritické buňky prezentující antigen přesunuly z periferie do lymfatických uzlin. Proces, během kterého se z nezralé dendritické buňky stane profesionální antigen prezentující buňka, je nazýván maturace (zrání). Tento proces je zahájen poté, co dendritická buňka pomocí specifických receptorů (například Toll-like receptorů) rozpozná hrozící nebezpečí, nejčastěji průnik infekčního agens do organismu.
Proces maturace je charakterizován vymizením schopnosti fagocytovat antigeny. Dochází k výraznému zvýšení exprese MHC molekul I. a II. třídy, kostimulačních a adhezivních molekul. Na povrchu dendritických buněk se objevuje molekula CCR7, která je receptorem pro chemokin MIP-3, který je produkován v lymfatických uzlinách. Zrající aktivovaná dendritická buňka migruje do lymfatických uzlin, kde účinně předkládá antigeny na svém povrchu T lymfocytům, aktivuje je a zahajuje imunitní reakci. Ta v optimálním případě vede k eliminaci patogenu, který vyvolal aktivaci dendritických buněk (obr. 1).
Imunoterapie nádorových onemocnění
Poznání klíčové role dendritických buněk v procesu zahájení imunitní reakce a možnost jejich přípravy ve velkém množství in vitro vedly k úvahám o jejich využití v imunoterapii nádorových onemocnění. Aktivace imunitní reakce proti nádorovým buňkám by byla významným přínosem pro terapii nádorů. Může však být protinádorová imunoterapie úspěšná? Hlavní podmínkou úspěšné protinádorové terapie je předpoklad, že imunitní systém umí rozpoznat a zničit nádorové buňky.
Rozhodující důkaz o roli imunitního systému v obraně proti nádorům poskytly studie na myších bez funkčních genů pro rekombinaci T a B buněčných receptorů RAG1 a RAG2 (RAG -/-). Tyto myši nemají T a B lymfocyty, protože nemohou přestavit antigenně specifické receptory. RAG -/-myši nejenže vyvinou chemicky indukované nádory rychleji a s větší frekvencí než imunokompetentní kontroly, ale také tvoří mnohem více spontánních tumorů, když pokus probíhá po dostatečně dlouhou dobu.
Nádorové buňky exprimují některé antigeny, které se na jiných buněčných typech nevyskytují. Těchto tzv. nádorově specifických, resp. asociovaných antigenů je již popsáno velké množství. Problémem je, že nádorové buňky samy nemohou fungovat jako antigen prezentující buňky, protože neexprimují kostimulační molekuly. Nádorové buňky navíc mají řadu strategií, pomocí nichž jsou schopné uniknout kontrole imunitního systému. Nádorové buňky například často produkují transformující růstový faktor (TGF) a interleukin 10, tedy cytokiny, které inhibují imunitní reakci.
Dalším únikovým mechanismem jsou časté mutace v genech, které kódují bílkoviny důležité pro prezentaci antigenů v antigen prezentujících buňkách, které vedou k nižší expresi MHC I. třídy. Pro aktivaci protinádorové imunitní odpovědi je nutné, aby byla nádorová buňka pohlcena dendritickou buňkou a aby byly fragmenty nádorových antigenů následně prezentovány v lymfatických uzlinách zralými dendritickými buňkami. Jak bylo ovšem zmíněno výše, nejúčinnějšími aktivátory jsou struktury pocházející z infekčních agens.
Jako endogenní s i g n á l y , k t e r é mohou způsobit aktivaci dendritických buněk při interakci s nádorovou buňkou, byly identifikovány kyselina močová a proteiny teplotního šoku. Jejich aktivační potenciál je ovšem mnohem nižší než aktivační potenciál struktur pocházejících z patogenů. Aktivace imunitní reakce proti nádorům je tedy podstatně složitější než zahájení imunitní reakce proti infekcím.
Imunoterapie nádorových onemocnění dendritickými buňkami
Principem imunoterapie nádorových onemocnění dendritickými buňkami je podávání in vitro připravených zralých dendritických buněk, které prezentují nádorové antigeny jako vakcíny, která by vedla k indukci specifické protinádorové imunitní odpovědi. Současné terapeutické protokoly používané v onkologii (chirurgie, chemoterapie, radioterapie) jsou relativně velmi účinné ve své schopnosti zredukovat množství nádorových buněk.
U mnoha typů malignit ovšem zůstává problémem perzistence malého množství buněk rezistentních na použité léky. Tento stav se nazývá minimální reziduální nemoc (MRN) a existuje závislost mezi hladinou MRN a prognózou pacienta. Přežívající buňky dají v dalším průběhu choroby vznik nové, terapeuticky již těžko ovlivnitelné nádorové populaci. Pacienti ve stadiu MRN by tedy mohli být vhodnými kandidáty pro protinádorovou imunoterapii, protože aktivace specifické protinádorové imunitní reakce by v této fázi mohla vést ke zlepšení prognózy onemocnění.
Obecné schéma imunoterapie dendritickými buňkami je znázorněno na obrázku 2. Po výběru pacientů, kteří jsou zařazeni do studie, je připraveno velké množství nezralých dendritických buněk z monocytů v periferní krvi. Po pěti dnech dojde k diferenciaci monocytů v nezralé dendritické buňky. Další postup závisí na typu nádorového antigenu, který je pro imunoterapii plánován. Při použití mrtvých nádorových buněk jako zdroje celého spektra nádorových antigenů je prvním krokem inkubace dendritických buněk s nádorovými buňkami. Po pohlcení nádorových buněk jsou následně dendritické buňky aktivovány účinným stimulem a zralé dendritické buňky, které prezentují nádorové antigeny, jsou poté jako protinádorová vakcína podány zpět pacientovi.
Při použití přesně definovaných epitopů nádorových antigenů ve formě krátkých peptidů jsou dendritické buňky nejprve maturovány a teprve zralé dendritické buňky, které exprimují velké množství HLA molekul, jsou inkubovány s nádorovým antigenem. Předmětem intenzivního výzkumu je řada parametrů. Jde především o množství podávaných dendritických buněk a frekvenci a celkovou dobu podávání protinádorové vakcíny.
Roli v efektivitě podávané vakcíny zřejmě hraje také způsob podání vakcíny. Jako nejlepší se zatím jeví subkutánní nebo intradermální injekce, ale stále je zapotřebí hledat strategie, které zaručí, že se většina injikovaných buněk dostane do lymfatických uzlin. Neméně důležitým problémem je také typ testů, které budou používány pro monitoraci efektu terapie.
Po řadě laboratorních studií, ve kterých jsme prokázali, že zralé dendritické buňky dokážou indukovat specifickou protinádorovou imunitní odpověď, plánujeme nyní na 2. LF UK a FN Motol zahájení klinické studie u pacientek s karcinomem ovaria. Díky finanční podpoře FN Motol a dalších přispěvatelů byla vybudována Jednotka buněčné terapie. Jde o první pracoviště v ČR, kde lze připravovat produkty pro protinádorovou imunoterapii, a její uvedení do provozu je důležitým krokem k provedení prvních klinických studií.
| MUDr. Radek Špíšek, PhD (*1975). Během studia medicíny strávil několik měsíců na lékařské fakultě University of Massachussets. Po ukončení 1. lékařské fakulty, UK v roce 1999 nastoupil na Ústav imunologie, UK 2.LF, FN Motol. V letech 2000-2002 absolvoval část PhD studia na Univerzitě v Nantes ve Francii. Po návratu na Ústav imunologie dokončil studium PhD a zároveň začal pracovat na 2. dětské klinice a následně Pediatrické klinice, UK 2.LF, FN Motol. Po složení atestace I. stupně z pediatrie pracoval v letech 2005-2007 v Laboratoři nádorové imunologie na Rockefeller University v New Yorku v laboratoři profesora Ralpha Steinmana, který objevil dendritické buňky. (Steinmanova laboratoř patří ke špičce v jejich výzkumu a v letošním roce mu za jejich objev byla udělelena americká obdoba Nobelovy ceny, Lasker Award). |
Odkazy na vybrané práce autora
1. Spisek R, Dhodapkar MV. Towards a better way to die with chemotherapy: role of heat shock protein exposure on dying tumor cells. Cell Cycle 2007 Jun;6(16):1962-5. www.landesbioscience.com/journals/cc/ abstract.php?id=4601
2. Spisek R, et al. Frequent and specific immunity to the tumor progenitor associated antigen SOX2 in patients with monoclonal gammopathy. Journal of Experimental Medicine 2007 Apr 16;204(4):831-40. www.jem.org/cgi/content/full/204/4/ 831
3. Spisek R, et al. Bortezomib enhances dendritic cell (DC) mediated induction of immunity to human myeloma via exposure of cell surface heat shock protein 90 on dying tumor cells: therapeutic implications. Blood 2007 Jun 1;109(11):4839-45. http://bloodjournal.hematologylibrary.org/cgi/ content/full/109/11/4839
4. Spisek R, Dhodapkar MV. Immunoprevention of cancer. Hematol Oncol Clin North Am 2006: 20(3):735-50.
MUDr. Radek Špíšek, Ph. D. Ústav imunologie 2. LF UK a FN Motol, Praha, Lékařské listy