Využití metod asistované reprodukce

Asistovaná reprodukce slouží k objasnění příčin a k léčbě dysfertility. K základním postupům asistované reprodukce patří zmrazování a uchovávání embryí, gamet a zárodečných tkání. V důsledku zvyšování incidence nádorových onemocnění a zkvalitnění jejich léčby se kryoprezervace úspěšně využívá k zachování reprodukční schopnosti u onkologických pacientů. U mužů se zmrazují spermie nebo testikulární tkáň, u žen embrya, oocyty nebo ovariální tkáň.

Summary

Zámečníková, M., Vilímová, Š., Panošová, M. Use of assisted reproduction methods

Assisted reproduction is used to clarify the causes of dysfertility and for its treatment. Basic methods of assisted reproduction include freezing and storage of embryos, gametes and embryonic tissues. Due to increasing incidence of cancer diseases and improvement of their treatment cryopreservation is successfully used to preserve fertility in cancer patients. In men sperm or testicular tissue, in women embryos, oocytes or ovarian tissue are been frozen.

Asistovaná reprodukce (AR) představuje soubor diagnostických a terapeutických postupů k objasnění příčin a k léčbě poruch reprodukce. Nechtěně bezdětných párů stále přibývá, v současnosti trpí dysfertilitou 15–20 % párů. Příčina může být na straně partnerky, partnera, nebo současně u obou partnerů. Přibližně 10 % poruch reprodukce je idiopatických. V rámci péče o infertilní páry je nepostradatelná mezioborová spolupráce gynekologů, andrologů, urologů, embryologů, genetiků a případně dalších specialistů. Mezi léčebné metody používané v reprodukční embryologii patří intrauterinní inseminace (IUI), konvenční in vitro fertilizace (IVF), intracytoplazmatická injekce spermie do vajíčka (ICSI), prodloužená kultivace (PK), asistovaný hatching (AH), kryokonzervace embryí (KKE), kryoprezervace gamet (spermií – KKS, oocytů – KKO) a tkání (testikulární nebo ovariální). V ČR jsou ženám ve věku 21–40 let hrazeny z veřejného zdravotního pojištění 3 úplné standardní IVF cykly.

Lidské pohlavní buňky (spermie a oocyty) se tvoří v gonádách. Gamety se vyvíjejí z primordiálních germinálních buněk, které se již od 3. týdne embryonálního vývoje vyskytují ve stěně žloutkového váčku. V dalších týdnech putují do základů gonády, kde vznikají v závislosti na genetickém pohlaví embrya (XY nebo XX) buď spermatogonie, nebo oogonie. Jsou diploidní, nejdřív se dělí mitoticky – namnoží se. Část z nich pak vstupuje do meiózy, kde dochází k redukci počtu chromosomů na polovinu, vznikají haploidní spermie nebo oocyty. Ve vývoji mužských a ženských gamet existují rozdíly: Spermatogonie – mitóza – primární spermatocyt – meióza I – sekundární spermatocyty – meióza II – spermatidy – spermie. Z jedné diploidní buňky vzniknou za přibližně 64 dní 4 haploidní spermie; vývoj probíhá od puberty nepřetržitě.

Oogonie – mitóza – primární oocyt – meióza I – sekundární oocyt + PB1 (první polární tělísko) – meióza II – MII oocyt + PB2 (druhé polární tělísko). Po narození se zrání oocytů zastaví v profázi meiózy I (všechny ovariální folikuly proto obsahují oocyty v profázi I). K dokončení meiózy I dochází během ovulace. Meióza II začíná po ovulaci a dokončí se po oplození.

Historie kryoprezervace

První pokusy s ochlazováním spermií ve sněhu a jejich následným úspěšným ohřátím provedl již před více než 200 lety Spallanzani. Začátkem 50. let byly objeveny kryoprotektivní účinky glycerolu,(1) který byl úspěšně použit jako kryoprotektivum ke zmrazení dobytčích spermií. V roce 1953 byla úspěšně provedena kryoprezervace lidských ejakulovaných spermií a zmrazené/rozmrazené dárcovské sperma bylo použito k IVF s následnou graviditou.(2) Savčí embrya jsou úspěšně zmrazována a uchovávána od roku 1972.(3) Od narození prvního dítěte po IVF v roce 1978 došlo v oblasti asistované reprodukce k mnohým pokrokům (účinnější hormonální stimulace, moderní kultivační systémy, atraumatická technika embryotransferu). Stále častější byla situace, kdy měli pacienti podstupující IVF k dispozici více kvalitních embryí, než bylo možné použít pro embryotransfer. To si vyžádalo vypracování a zavedení metody kryoprezervace humánních embryí.

První lidská embrya byla zmražena koncem 70. let,(4) prvního těhotenství po přenosu kryokonzervovaných lidských embryí bylo dosaženo v roce 1983 v Austrálii.(5) Úspěšné zmrazení zralých myších oocytů provedl v roce 1977 Whittingham.(6) Avšak zmrazení zralých lidských oocytů a dosažení těhotenství s použitím kryoprezervovaného oocytu se povedlo až o deset let později.(7) V roce 1998 bylo publikováno narození zdravého děvčátka po kryoprezervaci oocytů v profázi I a následné in vitro maturaci.(8)

Metody kryoprezervace

Základním principem klasického zmrazování embryí je rychlé ochlazení (rychlostí -2 °C/min) na teplotu -6 °C, dále cílené zahájení tvorby extracelulárních mikrokrystalků – seeding, následné pomalé ochlazení (rychlostí 0,3 °C/min) na teplotu -40 °C, a nakonec uložení do tekutého dusíku s teplotou -196 °C. Cílem je maximální omezení vzniku intracelulárních krystalků ledu, které jsou příčinou poškození buněk. Proto se používají kryoprotektanty (CPA – cryoprotective agents), chemikálie, které interferují s přechodem vody do pevného skupenství a omezují tvorbu intracelulárních krystalků ledu. Intracelulární CPA jsou oligohydroxy sloučeniny s nízkou toxicitou, které prostupují buněčnou membránou (propandiol, DMSO – dimetylsulfoxid, etylenglykol, glycerol).

Extracelulární CPA jsou polyhydroxylované látky a nejsou schopny prostupu přes buněčnou membránu (sacharóza a další oligosacharidy).(9) Pro kryokonzervaci zygot a rýhujících se embryí se používá propandiol a sacharóza,(10) pro kryokonzervaci blastocyst glycerol a sacharóza.(11,12,13, 14) Úspěšnost kryokonzervace embryí se hodnotí podle morfologie embrya při rozmrazení a podle jeho schopnosti dalšího vývoje (dalšího dělení buněk) in vitro. Rýhující embrya jsou považována za přeživší, když zůstane po procesu zmrazení/rozmrazení alespoň polovina jejich původních blastomer intaktních, což ve většině případů představuje alespoň 65 % ze všech kryokonzervovaných embryí. Oplozená vajíčka ve stadiu prvojader jsou považována za přeživší, když jsou po rozmrazení neporušena a jsou schopna rýhování in vitro v průběhu následujících 24 hodin.

Hodnocení úspěšnosti kryokonzervace blastocyst je obtížnější. Doporučuje se ponechat embrya 3–4 hodiny po rozmrazení v kultivačním médiu, aby došlo k jejich re-expanzi, a transferovat jenom morfologicky normální embrya. Kryokonzervace embryí a oplozených oocytů výrazně ovlivnila výsledky IVF v klinické praxi – přispěla ke snížení incidence mnohočetných těhotenství, zvýšení úspěšnosti IVF a snížení nutnosti opakovaných cyklů ovariální stimulace.

Kryoprezervace neoplozených oocytů má v zásadě stejný význam, ale další výhodou je, že obchází některé etické a legální problémy spojené s uchováváním embryí. Na zmrazování oocytů je vzhledem k prvotním neúspěchům zatím nahlíženo skepticky. Některé zmrazovací protokoly mohou ovlivňovat průběh prvních buněčných dělení po oplození, což může mít negativní vliv na další vývoj embrya a schopnosti jeho implantace po přenosu do dělohy. Zralé oocyty jsou v porovnání s preimplantačními embryi méně odolné vůči teplotním výkyvům. Oocyty jsou jedinečné svojí velikostí, tvarem, minimálním počtem buněk, permeabilitou buněčné membrány a fragilitou, což vysvětluje potíže při jejich kryoprezervaci. Předpokládá se, že nezralé oocyty jsou méně náchylné k poškození během zmrazování, ale jejich odběr a následná in vitro maturace (IVM) jsou problematické.

Nadějnou se zdá být metoda ultrarychlého zmrazení, kdy nedochází k tvorbě intracelulární krystalků, tzv. vitrifikace.(15) Zmrazování oocytů, zralých či nezralých, není zatím dostatečně efektivní a literární data a zmrazovací postupy jsou značně rozdílné.(16) Uchovávání ovariální tkáně je založeno na principu rezistence primordiálních folikulů ke kryotoxicitě.(17) Primordiální folikuly, na rozdíl od větších rostoucích folikulů, mají relativně inaktivní metabolismus, nemají zona pellucida a dělící vřeténko, jsou méně vnímavé k výkyvům okolní teploty.(18) Pro zachování jejich viability je také nutné použití kryoprotektantů. Průnik CPA do buněk primordiálních folikulů a následná ekvilibrace v buňkách je, vzhledem k jejich menším rozměrům, rychlejší než u větších rostoucích folikulů.(19) Odběr ovariální tkáně je nejvhodnější provést ve včasné folikulární fázi.

Odebraná ovariální tkáň by měla být rozdělena na tenké proužky (1–2 mm) o rozměrech přibližně 0,5x 1 cm. Jako kryoprotektant lze použít propandiol, etylenglykol nebo DMSO. Důležitá je inkubace tkáně v kryoprotektantu při teplotě 4 °C po dobu 30 minut za kontinuálního promíchávání, pak následuje pomalé zmrazení a uchovávání v tekutém dusíku.(20, 21) Po rozmrazení se tkáň z praktických důvodů reimplantuje do podkoží na volární stranu předloktí. Funkčnost transplantátu lze ověřit měřením hormonálních hladin (gonadotropiny) a ultrazvukovým vyšetřením štěpu (vyzrávání folikulů). Studie prokázaly, že více než 60 % primordiálních folikulů je ztraceno během iniciální ischémie před revaskularizací po transplantaci a proces zmrazování/rozmrazování odpovídá pouze za ztrátu dalších 7 % folikulů. Ztráty jsou lépe tolerovány mladšími pacientkami s větší folikulární rezervou. Hustota folikulů v zmrazené/rozmrazené ovariální tkáni je u žen starších 40 let velice nízká, proto se kryoprezervace ovariální tkáně u těchto pacientek nedoporučuje.

Při zmrazování spermií se ke zvýšení procenta viabilních spermií používají kromě kryoprotektantů i extendery. Extendery jsou komplexnější roztoky obsahující většinou extracelulární látky jako glycin, citrát, vaječný žloutek. Nyní se již používají komerční kity. Přečištěné spermie se smíchají se zmrazovacím médiem a objem se rozdělí do zmrazovacích nádobek (ampule nebo pejety), které se vloží do par tekutého dusíku a pak se uloží do skladovacích nádob s tekutým dusíkem, kde se skladují při teplotě -196 °C. Zmrazování způsobuje dehydrataci, zvýšení koncentrace iontů a ztrátu integrity plazmatické membrány spermií. Výsledkem je asi 50% úmrtnost spermií v průběhu jednoho cyklu zmrazení/rozmrazení. Podobně je tomu i u zmrazování testikulárních spermií. V průběhu kryoprezervace spermií dochází k výraznému poklesu motility a viability ve zmrazovaném materiálu.(22, 23, 24) U některých mužů dojde v důsledku primárního onemocnění ke snížení parametrů ejakulátu a bude pro dosažení optimálního výsledku IVF potřeba použít některou z metod asistované reprodukce (ICSI),(25) proto je vhodné před zmrazením vzorek adekvátně zpracovat, aby došlo ke koncentraci živých pohyblivých spermií do malého objemu.(26) Muži s genetickou poruchou (mikrodelece chromosomu Y, Klinefelterův syndrom), u kterých dochází k poklesu počtu spermií v ejakulátu v důsledku progresivního útlumu spermatogeneze, tvoří skupinu pacientů, kde se dá s výhodou využít zmrazení testikulární tkáně získané při biopsii varlete (TESE).(27)

Využití kryoprezervace

Původní indikací ke kryoprezervaci spermií bylo zmrazování dárcovských spermií nebo spermií partnera pro potřeby asistované reprodukce. Dále se provádí kryoprezervace spermií/testikulární tkáně před chirurgickými zákroky (TESE, varikokéla, orchidektomie, vasektomie). Díky pokrokům v onkologické léčbě je kryoprezervace a uchovávání spermií nepostradatelnou součástí péče o onkologické pacienty.(28, 29) Slouží k zachování reprodukčního potenciálu onkologických pacientů, kteří jsou ohroženi rozvojem sterility v důsledku protinádorové léčby. Kryoprezervace spermií před chemoterapií, radioterapií a chirurgickým výkonem u mužů s nádory varlat nebo Hodgkinovým lymfomem je nyní považována za normu a je pro pacienty s tímto onemocněním i výraznou psychologickou podporou.

Podle epidemiologických odhadů začátkem 21. století přežije v dětství nádorové onemocnění 1 ze 750 obyvatel ekonomicky vyspělých zemí.(30) Vzhledem k tomu, že se spermatogeneze rozbíhá až s nástupem puberty, kryoprezervace spermií u prepubertálních chlapců není možná. Avšak u všech adolescentů je vhodné nabídnout před zahájením gonadotoxické léčby možnost zmrazení a uchování spermií. V případě nezletilých o provedení kryoprezervace žádá písemně zákonný zástupce. Ejakulát se získává masturbací v odběrové místnosti, hodnotí se spermiogram, proběhne zpracování ejakulátu a zmrazení spermií. Celý vzorek je rozdělen do kryoampulí o objemu 1 ml. Je vhododběr zopakovat, aby bylo množství zmrazeného materiálu dostatečné. Zpravidla je potřeba použít 1 ampuli k 1 pokusu IVF. Vzhledem k tomu, že není možné úplně vyloučit riziko kontaminace tekutého dusíku materiálem z uskladněných ampulí, je nutno u všech pacientů před provedením každé kryoprezervace vyšetřit sérologicky HIV1,2; HBsAg; anti-HCV; CMV; BWR.(31) Výsledky kryoprezervace spermií a testikulární tkáně u dětských pacientů na našem pracovišti jsou uvedeny v Tab. 1.

Tab. 1 – Zmrazování spermií a testikulární tkáně u dětských pacientů v roce 2009

Zmrazování oocytů umožnilo v rámci asistované reprodukce výrazný rozvoj programu s dárcovskými oocyty. Nejčastějším důvodem pro kryokonzervaci oocytů je však zachování reprodukční schopnosti u mladých onkologických pacientek před ozařováním pánevních orgánů, před chemoterapií nebo před chirurgickým výkonem s odstraněním vaječníků. K získání oocytů je nutná hormonální stimulace pacientky, která trvá obvykle 7–10 dní a provedení ovariální punkce v celkové anestézii. Tento zákrok není vhodné provádět u prepubertálních pacientek, u pacientek, kde není možný odklad onkologické léčby potřebný pro stimulaci, a u pacientek, kde hrozí progrese nádorového onemocnění vlivem gonadotropinů. U mladých pacientek před zahájením protinádorové léčby, kde není možné provést stimulaci a odběr zralých oocytů, se jeví výhodnou kryokonzervace nezralých oocytů.

Zachování fertility využitím kryoprezervace ovariální tkáně bylo zpočátku nabízeno hlavně onkologickým pacientkám léčeným chemoterapií.(32) Nejčastěji se jedná o gynekologické nádory s nízkou pravděpodobností ovariálních metastáz. V současnosti se okruh indikací rozšířil i na jiné diagnózy, kde je nutná gametotoxická chemoterapie. Dále je tato metoda vhodná pro pacientky podstupující adnexektomii pro benigní afekce ovaria nebo z profylaktických důvodů.

Zmrazování ovariální tkáně je nejvhodnější metodou zachování reprodukční schopnosti u onkologicky nemocných děvčat a adolescentek. Nejčastějšími nádorovými onemocněními dětského věku jsou leukémie, neuroblastom, Hodgkinův lymfom, osteosarkom, nefroblastom, NHL. S pokroky v léčbě přežívá již 70 % nemocných a ročně je vystaveno sterilizující chemoterapii nebo radioterapii více než 4000 dívek.(33) Kryoprezervaci ovariální tkáně je vhodné provést u pacientek před plánovanou transplantací kostní dřeně, protože vysoké dávky chemoterapie a radioterapie nutné k ablaci vlastní kostní dřeně před transplantací způsobují ovariální selhání téměř u všech pacientek.(34, 35) Z nenádorových onemocnění je třeba o kryoprezervaci ovariální tkáně nebo oocytů uvažovat u některých autoimunit, kde se používají vysoce gonadotoxické látky jako cyklofosfamid nebo mitoxantron.(36) Od roku 2007 nabízíme možnost kryokonzervace ovariální tkáně i na našem pracovišti (Tab. 2).

Tab. 2 – Zmrazování ovariální tkáně v Centru reprodukční genetiky FN v Motole

U žen se při výběru optimální strategie pro zachování fertility rozhodujeme podle věku, typu onemocnění a času, který máme k dispozici, a na základě těchto informací vybíráme některou z následujících možností: kryokonzervace embryí, kryoprezervace oocytů, kryoprezervace ovariální tkáně.


O autorovi: MUDr. Marína Zámečníková, MUDr. Šárka Vilímová, RNDr. Ing. Michaela Panošová
Univerzita Karlova v Praze, 2. lékařská fakulta a Fakultní nemocnice v Motole, Ústav lékařské biologie a lékařské genetiky, Centrum reprodukční genetiky

e-mail: Marina. Zamecnikova@seznam.cz

Ohodnoťte tento článek!