Každý z 25 tisíc genů je různě aktivní v průběhu života lidského jedince, v jednotlivých orgánech a v různých fyziologických a patologických stavech. Sledování genových aktivit a možnosti jejich porovnávání v různých stavech mohou přinést zásadní informace o skutečné funkci jednotlivých genů, o vývoji člověka a o molekulárních příčinách řady chorob. „Jednou z moderních biotechnologií, které to umožňují, jsou DNA čipy,“ říká molekulární biolog ing. Stanislav Kmoch, CSc., vedoucí výzkumné skupiny v Centru integrované genomiky a Ústavu dědičných metabolických poruch 1. lékařské fakulty UK v Praze.
hn: Jak genový čip vypadá a jak se s ním pracuje?
Princip techniky je relativně jednoduchý. Používáme vhodný pevný povrch, například podložní mikroskopické sklo, na které v podobě bodů o průměru 150 mikrometrů v přesných souřadnicích cíleně umístíme a chemicky uchytíme molekuly DNA reprezentující části jednotlivých lidských genů. Když na takto připravený povrch naneseme vhodně připravený vzorek obsahující směs fluorescenčně označených lidských genových produktů, dojde ke specifické interakci mezi uchycenými geny a jejich příslušnými cDNA přítomnými ve vzorku. Aktivitu genu ve vzorku potom můžeme stanovit na základě analýzy fluorescenčního signálu v příslušném bodě.
Pokud cDNA ze vzorku zdravé tkáně obarvíme například zeleným a cDNA ze vzorku nádorové tkáně červeným fluorescenčním barvivem a analyzujeme oba vzorky na povrchu čipu současně, vidíme například, že v bodě v souřadnici A1 odpovídající genu 1 je přítomen pouze zelený signál. To znamená, že gen 1 je aktivní pouze v normální zdravé tkáni. V bodě v souřadnici A2 je pouze červený signál, který znamená, že gen 2 je aktivní pouze v nádorové tkáni. Je-li v dalším bodě stejná intenzita zeleného i červeného signálu, je tento gen stejně aktivní ve zdravé i nádorové tkáni. Takto analýza pokračuje bod po bodu, gen po genu, po celé ploše čipu.
hn: Co z takto analyzovaných biočipů lze odvodit?
Tento typ analýzy umožňuje sledovat aktivity desetitisíců genů, porovnávat je v různých stavech a poskytovat tak postupně informace o jejich funkcích a vzájemné regulaci. U nás například pracujeme na vývoji čipu, který by měl obsahovat patnáct tisíc myších genů. Tento projekt vyžaduje izolovat a jednotlivě ve zkumavkách připravit patnáct tisíc různých vzorků DNA, které potom pomocí speciálního robotického zařízení natiskneme na podložní mikroskopické sklo. Až budeme mít tento čip k dispozici, můžeme sledovat, jak jsou jednotlivé geny aktivní například u myši vystavené nějakému stresu nebo u myši, která má cílenou genetickou manipulací vyřazen některý gen. Můžeme sledovat změny u myši s hypertenzí, u myší obézních, po podání nějaké látky a podobně.
hn: Vy víte, za co odpovídá každý z těch patnácti tisíc myších genů?
Zatím nevíme. V současné době se předpokládá, že existuje asi 25 tisíc genů jak u člověka, tak u myši, ale funkce jednotlivých genů jsou známé jen u několika tisíc. Zjistit jejich funkci je úkolem nového oboru - funkční genomiky. Ta využívá řadu postupů, kdy jsou jednotlivé geny cíleně vyřazovány nebo mutovány, a sleduje se, jaký má tento zásah do genomu dopad na biologické funkce zvířete jaké jsou biochemické projevy organismu. Sledování změn genové exprese je jedním ze základních nástrojů analýzy těchto experimentů.
hn: U lidí tyto experimenty ale možné nejsou.
U člověka využíváme toho, co nám poskytuje příroda. Studují se například různá geneticky podmíněná onemocnění a vzorky tkání pacientů, které jsou k dispozici. Existují například techniky, pomocí kterých je možno izolovat populaci několika set nádorových buněk, získat informace o jejich genové expresi a porovnat tyto výsledky z různých fází a forem nádoru. Takové studie mohou poskytnout informace o tom, které z genů a v jakých stadiích nádoru jsou více či méně aktivní. Změněná aktivita daného genu nebo její funkční dopad mohou později sloužit jako prostředek včasné diagnózy případně prognózy onemocnění. Detailní molekulární charakterizace nádoru může být též vodítkem pro specifickou „na míru připravenou“ léčbu.
hn: Na DNA čipu vidíte tisíce barevných bodů. Jak se v nich vyznáte?
Známe prostorovou organizaci čipu, která je daná parametry jeho robotické přípravy. Víme, že bod v souřadnici A1 odpovídá genu 1, bod A2 genu 2 atd. Přítomnost a intenzita fluorescence v jednotlivých bodech pak vypovídá o míře aktivit příslušných genů v analyzovaném vzorku. Na DNA čipu můžeme sledovat aktivitu genů v jakémkoliv vztahu, pokud máme k dispozici tkáň, kde očekáváme odchylku, a máme možnost srovnat výsledky s kontrolními vzorky. To znamená, že pokud bychom chtěli například sledovat aktivitu mozkové tkáně pacienta se schizofrenií, museli bychom analyzovat tkáň pacientů společně s tkání zdravých jedinců, což je v tomto případě obtížně proveditelné. Proto je výhodné pracovat s myšími modely a tkáněmi. Myš má totiž řadu stejných onemocnění jako člověk, včetně schizofrenie.
hn: Dají se v biočipu číst genové odlišnosti jednotlivých lidí?
Ano. Lidský genom si lze představit jako tři miliardy písmen dlouhé slovo složené ze čtyř písmen - A, C, G a T. Délku slova a pořadí písmen mají lidé identickou z 99,99 procenta. Lišíme se od sebe v určitých místech vzájemnými záměnami jednotlivých písmen nebo změnami v jejich pořadí. Těmto změnám říkáme polymorfismy. V lidském genomu jich je kolem tří set miliónů. Řada polymorfismů může mít přímý nebo nepřímý vztah k rozvoji civilizačních chorob. Existují proto snahy umět rychle pomocí čipů analyzovat profil a frekvence maximálního počtu polymorfismů v souborech pacientů, například právě u nemocných schizofrenií, a porovnáním zjistit, je-li nějaký polymorfismus u schizofreniků přítomen ve statisticky významně vyšší nebo nižší frekvenci než v kontrolním souboru zdravých osob.
hn: Budou jednou genoví inženýři umět odstranit genovou mutaci zodpovědnou za nějakou devastující chorobu?
U onemocnění podmíněných mutací jednoho genu asi ano. U chorob, na kterých se spolupodílí řada genů spolu s vlivem vnějšího prostředí, by to bylo velmi komplikované. U těchto onemocnění není proto řešením oprava genetických dispozic, které máme všichni, ale pochopení jejich molekulární podstaty. Pouze na tomto základě lze vyvíjet nové diagnostické metody a uvažovat o metodách cílené terapie. Právě v této oblasti mohou biočipy sehrát významnou úlohu.
hn: To všechno vypadá velmi nadějně. Jaká je však dnešní realita ve využívání DNA čipů?
Z celosvětového hlediska je technologie stále v počátečním stadiu vývoje a je s ní spojeno až přehnaně velké očekávání investorů a vědců. Její rozvoj se neobejde bez spolupráce různých oborů: organické chemie, chemie povrchů, molekulární biologie, přesné mechaniky, robotiky, optiky, fyzikální chemie, statistiky a bioinformatiky. Jsme proto nuceni vyhledávat spolupráci se soukromým sektorem, spolupracujeme s firmami, které se zabývají výrobou přesných robotických systémů nebo novými povrchovými úpravami materiálů, a snažíme se držet krok s tím, co se ve světě děje. V konkurenci zahraničních pracovišť, která touží po podobně kvalifikovaných lidech jaké máme u nás, se nám zatím daří udržet vzniklý tým mladých lidí a snažíme se o napojení do evropských programů například v připravovaném 6. rámcovém programu Evropské unie.
Věra Nosková, Hospodářské noviny, 15.8.2002