Z nich mezi vazokonstrikční patří vazopresin, endotelin, prostaglandin F2, neuropeptid Y a tromboxan A2, mezi vazodilatační prostaglandiny E2 a I2, dopamin, natriuretické peptidy, endoteldependentní relaxační faktor, adrenomedulin, kalikrein-kininový systém, adenozin a vazoaktivní intestinální peptid. V souhrnu svých účinků mívají vazokonstrikční působky převahu. Hlavními představiteli cytokinů jsou tumor necrosis faktor (TNF) alfa a interleukiny.
Látky jsou produkovány endokrinně, autokrinně a parakrinně, působí prostřednictvím specifických receptorů. Většina působků zasahuje kromě svých vazoaktivních účinků i do procesu remodelace, do funkce endotelu, krevních elementů, kardiomyocytů i buněk hladkého svalstva, do imunitních i zánětlivých dějů. Rychlý rozvoj poznatků o humorálních působcích v posledních letech již umožnil jejich využití v diagnostice, léčbě i pro prognostické účely. V brzké budoucnosti lze jistě očekávat, že jejich význam pro klinickou praxi dále poroste.
Klíčová slova
srdeční selhání • humorální aktivace • cytokiny
Pojem chronické srdeční selhání (CHSS) je označením pro syndrom vzniklý následkem onemocnění srdečního svalu nebo vlivem extrakardiálních příčin, které způsobí narušení práce srdce jako pumpy. Srdeční selhání definujeme jako poruchu srdeční funkce, kdy přes dostatečné plnění komor klesá minutový výdej a srdce není schopno krýt metabolické potřeby tkání, dochází k aktivaci neurohumorálních působků, apoptózy a adaptačním změnám myokardu na molekulární úrovni.
Neurohumorální systémy pomáhají udržet oběhovou homeostázu tím, že zvyšují inotropii a chronotropii selhávajícího myokardu, a tím, že modulují cévní reakci. Cévní tonus je tak řízen přes mediátory, které buď dilatují, nebo kontrahují cévy v různých oblastech organismu tak, aby byl zajištěn průtok krve činnými orgány (metabolická vazodilatace) a aby se přitom vazokonstrikcí udržel přiměřený perfúzní tlak.(1)
Humorální působky můžeme dělit podle jejich výsledného působení naa) vazokonstrikční,b) vazodilatační,c) cytokiny.
Vazokonstrikční hormony jsou také antinatriuretické a antidiuretické, povšechně mají růstově proliferační vlastnosti. Na druhé straně dilatační působky jsou natriuretické a diuretické a mají antimitogenní efekty. Navzdory aktivaci i dilatačních mechanismů převládají u srdečního selhání systémy vedoucí k vazokonstrikci a retenci tekutin a solí.(2) (Tab. 1).
Vazokonstrikční mechanismy
Sympatoadrenální systém (SAS)
Snížení aktivity mechanoreceptorů v karotickém sinu a v aortálním oblouku, způsobené při srdečním selhání poklesem krevního tlaku, vede k vyplavení katecholaminů do krevního oběhu: z nervových zakončení se uvolňuje noradrenalin a z nadledvin adrenalin. Katecholaminy svým pozitivně chronotropním účinkem zvyšují srdeční frekvenci a pozitivně inotropním vlivem sílu a rychlost myokardiální kontrakce. Vazokonstrikce rezistenčních cév, renálních cév, žil splanchniku a kůže způsobená noradrenalinem zvyšuje dotížení i předtížení.
Systém renin-angiotenzin-aldosteron (RAAS)
Renin je aktivován snížením perfúzního tlaku a průtoku v ledvinách, snížením koncentrace sodíku v macula densa, intenzívní léčbou diuretiky a některými vazodilatancii (hydralazin, prazosin, antagonisté vápníku), prostaglandiny, zvýšením tonu sympatiku a vazopresinu. Těmito vlivy se zvýší sekrece proteolytického enzymu reninu z juxta-glomerulárních buněk. Renin štěpí alfa-globulin angiotenzinogen na dekapeptid angiotenzin I. Z něj po odštěpení dvou aminokyselin angiotenzin konvertujícím enzymem (ACE) vzniká oktapeptid angiotenzin II (A II).(3) Angiotenzin II způsobuje přímou periferní vazokonstrikci a další stimulaci sympatického systému. Rovněž stimuluje kůru nadledvin k sekreci aldosteronu, stimuluje produkci arginin vazopresinu, způsobuje hypertrofii myokardu a cévní stěny (remodelling) a zvyšuje obsah kolagenu v myokardu a cévní stěně.
Systém reninangiotenzin se jako celek účastní akutní regulace krevního oběhu, zatímco tkáňový RAAS dlouhodobě ovlivňuje kardiovaskulární funkci a strukturu. Angiotenzin II uvolňovaný lokálně působí nezávisle na hladině plazmatické reninové aktivity.(4) Angiotenzin II působí zejména přes receptor 1, který zprostředkuje účinky, jako jsou vazokonstrikce, hypertrofie myocytů a cévní svaloviny, fibróza myokardu a cévní stěny, zvýšená sekrece endotelinu, zvýšené uvolňování vazopresinu, stimulace sympatické aktivity a kyslíkových radikálů a zvýšená hladina inhibitoru aktivátoru plazminogenu. Naopak receptor 2 zprostředkuje účinky antiproliferativní a reguluje diferenciaci buněk a reparaci tkání. Jeho stimulace může ovlivnit nepříznivý efekt na remodelaci zprostředkovaný receptorem 1.(1)
Arginin vazopresin (AVP)
Sekrece je stimulována vyšší osmolaritou krve. U srdečního selhání je však vazopresin zvýšeně uvolňován podrážděním baroreceptorů v srdečních komorách přes vagová aferentní vlákna a mozkový kmen. Vazopresin kromě vazokonstrikce zvyšuje účinek noradrenalinu a angiotenzinu II; jeho hlavní úlohou je zvýšené zadržování vody na úrovni distálního tubulu a sběrných kanálků. AVP působí přes dva typy receptorů. Vazokonstrikce je vyvolána přes vaskulární V1 receptor, zatímco účinky na resorpci vody jsou způsobeny přes renální tubulární (V2) receptor.(4)
Endotelin
je arteriální a venózní konstriktor, který se hojně vyskytuje v lidských tkáních a jehož vazebná místa byla prokázána v cévách, srdci a ledvině. Hlavním kardiovaskulárním endotelinem je ET1, ET2 je tvořen převážně v ledvinách a ve střevu, méně v myokardu, placentě a uteru, ET3 byl nalezen ve větší koncentraci v mozku.
Biologické účinky endotelinu jsou:a) kardiovaskulární: vazokonstrikce, pozitivně inotropní efekt, reflexní bradykardie,b) renální: zvýšení renální arteriální rezistence, snížení glomerulární filtrace, mezangiální hypertrofie,c) plicní: bronchokonstrikce,d) neuroendokrinní: zvýšení ANP, prostaglandinů, reninu, aldosteronu, arginin-vazopresinu,e) růstové: silný mitogen pro hladké svalové buňky, kardiocyty a fibroblasty.
Endotelin je také významným prognostickým ukazatelem chronického srdečního selhání a bylo prokázáno, že jeho hladina koreluje s tíží srdečního selhání a také se stupněm plicní hypertenze.(5) Big endotelin, který je prekuzorem endotelinu, může nadprodukci tohoto působku odrazit lépe než samotný cirkulující endotelin, který je rychle štěpen a nemusí dosáhnout plicní cirkulace. V některých studiích koreloval big endotelin lépe s hemodynamickými parametry a echo parametry než endotelin(5-7) a rovněž koreloval lépe s funkční třídou NYHA a dlouhodobou prognózou pacientů.(5, 6)
Neuropeptid Y (NPY)
Původně byl izolován z mozku prasete. Neuropeptid Y je lokalizován spolu s norepinefrinem v sympatických gangliích a vláknech, která inervují arterioly, vény a srdce. Je mohutný vazokonstriktor, má také vagolytickou aktivitu a snižuje srdeční stažlivost.
Tromboxan A2 (TXA2)
Je tvořen v ledvinných glomerulech a způsobuje agregaci trombocytů, vazokonstrikci včetně ledvinných cév; tím snižuje ledvinný průtok a glomerulární filtraci. Bylo popsáno jeho zvýšení u pacientů s těžkým srdečním selháním NYHA IV oproti pacientům ve skupině NYHA I. Tromboxan A2 je vylučován do moče jako tromboxan B2 (TXB2), proto se jeho produkce měří pomocí renální exkrece TXB2.(8)
Vazodilatační mechanismy
Jsou u srdečního selhání rovněž aktivovány, avšak jejich celkové působení je oslabeno vazokonstrikcí a také nižší reaktivitou cévní stěny, která má sníženou poddajnost kvůli jejich zvýšenému obsahu sodíku a vody.
Prostaglandiny (E2, I2)
Jsou tvořeny v renálních arteriolách, glomerulech a některých částech ledvinných kanálků. Zvýšeně se uvolňují při hypoperfúzi ledvin spolu s A II, jejich hlavní úlohou je dilatace vas afferens, čímž zvyšují průtok glomerulárním cévním řečištěm a podporují exkreci sodíku.(4) Rovněž přímo inhibují transport sodíku v kortikálních tubulech a v dřeňových sběrných kanálcích. Jejich vylučování je podporováno angiotenzinem II, noradrenalinem a arginin-vazopresinem. Naopak prostaglandiny podporují uvolňování ANP. U chronického srdečního selhání je na nich závislá ledvinná homeostáza.
Dopamin
Stimuluje receptory D1 a D2 (dopaminergní), lokalizované postsynapticky v cévách renálních, mezenterických, koronárních a mozkových. Aktivace D1 receptorů zvyšuje prokrvení ledvin, aktivace D2 receptorů brání dalšímu vyplavování katecholaminů do synaptické štěrbiny.
Natriuretické peptidy
Atriální natriuretický peptid (ANP) Při zvýšení tlaku v pravé síni při hypervolémii je secernován ze srdečních síní natriuretický peptid. ANP je C-reziduální peptid, který je odvozený ze 126. aminokyselinového prekurzoru pro-ANP, který je skladován v sekrečních granulích. Účinky ANP spočívají v uvolnění vazokonstrikce cév, snížení plnicího tlaku, ve zvýšeném vylučování sodíku ledvinami, v inhibici sekrece reninu a aldosteronu a ve snížení produkce vazopresinu.
Mozkový natriuretický peptid (BNP)Byl objeven v mozku prasete - odtud jeho jméno -, ale u člověka je téměř výhradně vylučován ze srdce, především z komor.(9) Má podobné účinky jako ANP, proto tyto dva peptidy fungují jako duální kardiální natriuretický peptidový systém. Zvýšená hladina BNP je používána jako screening pro detekci srdečního selhání(10) a koreluje dobře s tíží postižení funkce levé komory.(11)
Central nervous system natriuretický peptid (CNP)Současná doba je ve znamení objevování dalších natriuretických peptidů, které jsou označovány CNP, DNP atd., a je zkoumán nejen jejich prediktivní význam, ale i možné terapeutické využití. CNP je primárně více přítomen v CNS než v srdci. Jeho účinek je především v mozku, kde působí vazodilatačně. U srdečního selhání nejsou jeho hladiny zvýšené.(12)
Natriuretické peptidy jako srdeční biomarkery
V klinické praxi se pro diagnostiku ukázalo nejvýhodnější určovat BNP a NT-proBNP, které odhadují tíži onemocnění a prognózu nemocných lépe než ANP. Stanovení NT-proBNP je diagnosticky výhodnější pro delší biologický poločas než samotný BNP.(10) U akutního i chronického srdečního selhání dochází ke zvýšené sekreci BNP. V plazmě lze stanovit hladinu BNP a NT-proBNP. BNP má oproti NT-proBNP kratší poločas, není závislý na věku a je vylučován pomocí specifických receptorů. NT-proBNP má delší poločas, je závislý na věku a je vylučován ledvinami.(13, 14) Stanovení BNP se na základě prokázaných dat stalo součástí algoritmu používaného pro diagnostiku srdečního selhání a bylo zařazeno do guidelines Evropské kardiologické společnosti.(15, 16)
Srdeční selhání
Diagnostika porušené funkce levé komory, hlavně v časných stadiích a u málo symptomatických nemocných, je svízelná. Senzitivita BNP je 90 % a specificita 76 %. Ve studii BNP (Breathing Not Properly) bylo na urgentním příjmu vyšetřeno 1586 nemocných pro dušnost. Nejvyšší plazmatické koncetrace BNP byly u nemocných s dušností na podkladě srdečního selhání, středně zvýšené u dušnosti nekardiálního původu u nemocných s anamnézou dysfunkce levé komory a nejnižší u pacientů bez známek srdečního selhání či poruchy funkce levé komory. Obdobně v této studii bylo zvýšení koncentrací BNP u funkčních tříd NYHA III a IV ve srovnání s NYHA I a II.
Hodnota BNP nižší než 100 pg/ml vylučovala srdeční selhání, hodnoty 100500 pg/ml srdeční selhání nevylučovaly a hodnota více než 500 pg/ml potvrzovala srdeční selhání s pravděpodobností 95 %.(17) Hodnoty navržené pro NT-proBNP vycházejí ze studie PRIDE. Hodnoty pod 300 pg/ml vylučují akutní srdeční selhání, 3001800 pg/ml hodnotí stav jako možné akutní srdeční selhání a hodnoty nad 1800 pg/ml potvrzují akutní srdeční selhání. Hraniční hodnota NT-proBNP pro akutní srdeční selhání, bez ohledu na věk, byla 300 pg/ml s 98% negativní prediktivní hodnotou.
S ohledem na věk byly vypočítány následující hodnoty, které identifikovaly akutní srdeční selhání: u pacientů pod 50 let 450 pg/ml, u 50-75letých 900 pg/ml a nad 75 let 1800 pg/ml se senzitivitou 92 % a specificitou 84 %. Rozdělení podle pohlaví nezlepšilo ani senzitivitu, ani specificitu.(18) Při podezření na chronické srdeční selhání je brána jako hraniční hodnota NT-proBNP 125 pg/ml, u nemocných nad 75 let je tato hodnota více než 450 pg/ml.(23, 30) Měření hladin NT-proBNP by také mohlo pomoci při rozhodování, kdy pacienta propustit, a také při rozhodnutí o zintenzívnění terapie srdečního selhání.(16)
Asymptomatická porucha systolické funkce levé komory
Určení plazmatických koncentraci je zde méně přesné, protože se hladiny u nemocných NYHA I a II překrývají.(10, 11)
Diastolická dysfunkce
U nemocných s diastolickým selháním nebo srdečním selháním se zachovalou systolickou funkcí, u starších nemocných, hypertoniků, aortální stenózy, hypertrofické nebo restriktivní kardiomyopatie stoupá plazmatická koncentrace BNP. Koncentrace BNP jsou však vyšší u pacientů se systolickou dysfunkcí než u izolované diastolické dysfunkce a nejvyšší jsou u kombinované systolické i diastolické dysfunkce. U pacientů se zachovalou systolickou funkcí koreluje hladina BNP s tíží diastolické dysfunkce. Postupně narůstá u porušené relaxace a nejvyšší je u pacientů s restrikčním plněním LK.(11, 20)
Pravostranné srdeční selhání
Vzestup BNP u onemocnění pravé komory či stavů, které vedou k postižení pravé komory, není tak jednoznačný jako u levostranného selhávání, ale mohou být zvýšeny například u plicní embolie. U pacientů, kteří mají současnou dysfunkci levé i pravé komory srdeční, byly nalezeny vyšší hladiny BNP než u pacientů s pouhou levokomorovou dysfunkcí.(20)
BNP jako prognostický ukazatel
Pacienti se srdečním selháním a vysokými plazmatickými koncentracemi BNP mají vysokou kardiovaskulární i celkovou mortalitu bez závislosti na věku, funkční klasifikaci NYHA, předchozích infarktech myokardu, ejekční frakci, maximální spotřebě kyslíku při zátěži. Též zvýšení BNP je prediktivním faktorem náhlé smrti či nutnosti srdeční transplantace.(5) U pacientů s akutním srdečním selháním je BNP nezávislým prediktorem kardiovaskulární mortality a je také předpovědním ukazatelem dalšího klinického vývoje u pacientů hospitalizovaných s dekompenzovaným srdečním selháním.
Pomocí měření hladiny BNP před propuštěním může pomoci identifikovat pacienty, kteří mají nízké riziko rehospitalizace v průběhu následujícího měsíce.(14, 19) Určení BNP/NT-proBNP patří mezi jedny z velmi užitečných ukazatelů, které při dynamickém sledování mohou předpovědět nepříznivý průběh onemocnění a určit efekt léčby srdečního selhání. Můžeme konstatovat, že normální hodnota plazmatické koncetrace BNP vylučuje srdeční selhání a naopak vysoké hodnoty diagnózu srdečního selhání potvrzují.(13, 14, 16) Mezi další vazodilatační působky patří ještě: endotel-dependentní relaxační faktor, adrenomedulin, kalikrein-kininový systém, adenozin, vazoaktivní intestinální peptid či kalcitonin generelated peptid.
Cytokiny
Jedná se o vysoce účinné endogenní peptidy relativně malé molekulové hmotnosti, které mají mnohostranné biologické účinky -od ovlivnění růstu, funkce leukocytů, tkáňových, epiteliálních, endoteliálních a jiných buněk, které jsou zapojeny do tkáňové reparace a udržení homeostázy, až po specifické účinky, kterými ovlivňují patofyziologii chronického srdečního selhání.(21) Mechanismus jejich účinku je buď realizován přes vazbu na specifické receptory, někdy mají přímý membránový efekt. Jedná se zejména o tumor necrosis faktor alfa (TNF), interleukin (IL) 6 a 1.(22) Cytokiny jsou produkovány buňkami imunitního systému, jejichž tvorba by mohla být indukována neurohumorální aktivací.
TNF-alfa způsobuje svalový úbytek, redukuje svalovou kontraktilitu a indukuje myokardiální hypertrofii. Účinky TNF tak způsobují endoteliální dysfunkci a současně poškození syntézy a zrychlení katabolismu proteinů kosterního svalu. Zvýšení TNF, které je pozorováno zejména u pacientů NYHA IV, tak může vést k těžkému omezení tolerance zátěže a koreluje s kardiální kachexií a špatnou prognózou.
Interleukin (IL) 1 a 6
Interleukin 1 má negativně inotropní efekt snížením srdeční kontraktility a stimulací syntázy NO.(23) Může rovněž spouštět proces apoptózy. Interleukin 6 je spojen s horší NYHA třídou, prodlouženou hospitalizací a horší funkcí levé komory. Jeho úloha jako prognostického markeru zatím není objasněna. Mechanismus, kterým uplatňuje svůj škodlivý účinek, není zcela jasný. Jsou však poznatky o tom, že by mohl být zapojený do rozvoje komorové hypertrofie přes stimulaci glykoproteinového receptoru 130 přítomného na srdečních myocytech.(22) ¨
Závěr
Humorální působky jsou jedněmi z úhelných kamenů vzniku a vývoje srdečního selhání. Podle jejich základních vlastností je lze rozdělit na vazokonstrikční, vazodilatační a cytokiny, přičemž mezi prvními dvěma mají obvykle převahu látky vazokonstrikční. Kromě svých vazoaktivních účinků některé z nich významně zasahují do procesu remodelace a endoteliální dysfunkce. Pro klinickou praxi je již dnes jasný jejich význam jak pro základní diagnostiku CHSS, tak pro posouzení jeho progrese a prognózy. Hlavní systémy jsou úspěšně blokovány v léčbě. Při rychlém rozvoji poznatků v této oblasti v poslední době lze brzy očekávat další zpřesňování jejich místa v patofyziologii a diagnostice CHSS a snad i v dalším léčebném využití inhibice nebo blokády jejich nepříznivých vlastností.
Prof. MUDr. Lenka Špinarová, Ph. D., FESCe-mail: lenka.spinarova@fnusa.czprof. MUDr. Jiří Vítovec, CSc., FESCMasarykova univerzita v Brně, LF MU a FN u sv. Anny, I. interní kardioangiologická klinika
*
Literatura
1. ŠTEJFA, M., a kol. Kardiologie. 3. vydání. Praha : Grada Publishing, 2007, s. 722.
2. WIDIMSKÝ, J. Srdeční selhání. 2. vydání. Praha : Triton, 2003, s. 556.
3. ŠPINAR, J., VÍTOVEC, J. Chronické srdeční selhání. Brno : Medica, 2000, s. 65.
4. ŠPINAROVÁ, L., TOMAN, J. Humorální změny u chronického srdečního selhání. Cor Vasa, 2001, 43, s. 513-519.
5. ŠPINAR, J., VÍTOVEC, J., ŠPINAROVÁ, L., et al. The value of big endothelin level and hemodynamic variables in heart transplant candidates. Cor Vasa, 2000, 42, p. 495-500.
6. PACHER, R., STANEK, B., HUELSMAN, M., et al. Prognostic impact of big endothelin 1 plasma concentrations compared with invasive hemodynamic evaluation in severe heart failure. J Am Coll Cardiol, 1996, 27, p. 633-641.
7. ŠPINAROVÁ, L., TOMAN, J., POSPÍŠILOVÁ, J., et al. Humoral response in patients with chronic heart failure. Int J Cardiol, 1998, 65, p. 227-232.
8. CASTELLANI, S., PALADINI, B., PANICCIA, R., et al. Increased renal formation of thromboxane A2 and prostaglandin F2 alpha in heart failure. Am Heart J, 1997, 133, p. 94-100.
9. SUDOH, T., KANGAWA, K., MINAMINO, N., et al. A natriuretic peptide in porcine brain. Nature, 1988, 332, p. 78-81.
10. COWIE, MR., STRUTHERS, AD., WOOD, DA., et al. Value of natriuretic peptides in assessment of patients with possible new heart failure in primary care. Lancet, 1997, 350, p. 1349-1353.
11. VÍTOVEC, J., ŠPINAROVÁ, L. Natriuretické peptidy - diagnostika a léčba. Remedia, 2004, 14, č. 2, s. 177-181.
12. KALRA, PR., ANKER, SD., STRUTHERS, AD., et al. The role of C-type natriuretic peptide in cardiovascular medicine. Eur Heart J, 2001, 22, p. 997-1007.
13. ŠPINAR, J., VÍTOVEC J. Normy pro BNP a NT-proBNP stanoveny. Cor et Vasa, 2005,47, s. 395-398.
14. HRADEC, J. Mohou se stát natriuretické peptidy křišťálovou koulí kardiologa? JACC-CZ, 2003, 5, s. 255-257.
15. NIEMINEN, MS., BOEHM, M., COWIE, MR., et al. Executive summary of the guidelines on the diagnosis and treatment of acute heart failure. Eur Heart J, 2005, 26, p. 383-416.
16. SWEDBERG, K., CLELAND, J., DARGIE, H., et al. Guidelines for the diagnosis and treatment of chronic heart failure. Eur Heart J, 2005, 26, p. 1115-1140.
17. MAISEL, A., McCORD, J., NOWAK, RM., et al. Results from Breathing Not Properly Study (BNP). J Am Coll Cardiol, 2003, 41, p. 2010-2017.
18. JANUZZI, LJ., CAMARGO, CA., ANWARUDIN, S., et al. The N-terminal pro-BNP investigation of dyspnea in the emergency department (PRIDE) study. J Am Coll Cardiol, 2005, 95, p. 948-954.
19. STANĚK, V. Kardiologie a biochemie. Znamenají natriuretické peptidy novou éru v diagnostice a kontrole léčby srdečního selhání? Cor Vasa, 2002, 44, s. 504-505.
20. ŠPINAROVÁ, L., TOMAN, J., MELUZÍN, J., et al. Natriuretic peptides and myocardial function in chronic heart failure. Eur J Echocard, 2003, 4, Suppl. 1, S 34.
21. PĚNIČKA, M., GREGOR, P. Hypotéza kardiovaskulárních onemocnění. Postgraduální medicína, 1999, 1, č. 1, s. 34-43.
22. NIEBAUER, J. Inflammatory mediators in heart failure. Int J Cardiol, 2000, 72, p. 209-213.
23. FRANCIS, SE., HOLDEN, H., HOLT, CM., et al. Interleukin 1 in myocardium and coronary arteries of patients with dilated cardiomyopathy. J Mol Cell Cardiol, 1998, 30, p. 215-230.
Seznam zkratekACE - angiotenzin konvertující enzymANP - atriální natriuretický peptidAVP - arginin vazopresinBNP - mozkový natriuretický peptidCNP - central nervous system natriuretický peptidCHSS - chronické srdeční selháníIL - interleukinNPY - neuropeptid YRAAS - systém renin-angiotenzin-aldosteronSAS - sympatoadrenální systémTNF - tumor necrosis faktorTXA2 - tromboxan A2TXB2 - tromboxan B2
Práce byla vypracována v rámci Výzkumného záměru MŠMT -MSM0021622402.
**