Mgr. Ilona Hromadníková
Univerzita Karlova v Praze, 2. LF a FN Motol, 2. dětská klinika
Klíčová slova
histokompatibilní antigeny • polymorfismus cytokinových genů • směsná lymfocytární kultura • model kožního explantátu
Akutní forma reakce štěpu
proti hostiteli (aGvHD)
Akutní GvHD se rozvíjí v období prvních 3 mě síců po transplantaci u pacientů transplantovaných alogenním štěpem hematopoetických kmenových či progenitorových buněk. Nejčastěji postiženými orgány jsou kůže, játra, gastrointestinální trakt a imunitní systém. Postižení kůže se projevuje jako kožní rash (makulopapulózní exantém) a může přejít až do rozsáhlé bulózní epidermolýzy s deskvamací velkých ploch. Postižení střev se projevuje anorexií, nauzeou, profúzními průjmy, bolestmi břicha a v těžkých případech může vyústit až v paralytický ileózní stav. Postižení jater vyvolává hyperbilirubinémii, vzestup transamináz a alkalické fosfatázy. Rovněž se rozvíjí těžká, dlouhodobá imunodeficience, která nepříznivě ovlivňuje rekonstituci imunitního systému dárcovského štěpu.
Klasifikace akutní GvHD vychází ze stupně postižení kůže, trávicího traktu a jater (Tab. 1, 2) a umožňuje odhadnout prognózu pacienta. Lehká forma GvHD je spojena jen s mírnou morbiditou a v případě maligních onemocnění bývá žádoucí vzhledem ke graft-versus-leukemia efektu (GvL efekt). Těžší stupně GvHD se terapeuticky velmi obtížně zvládají a nepříznivě ovlivňují potransplantační mortalitu(4, 5, 6, 13).
Patofyziologie
akutní GvHD
V současné době akceptovaný model patofyziologie akutní GvHD(4, 5) podtrhuje klíčovou roli buňkami zprostředkované imunity (T lymfocyty dárce) a prozánětlivých cytokinů produkovaných makrofágy a NK buňkami dárce a makrofágy příjemce pod vlivem aGvHD, střevních patogenů a přípravného režimu (Obr. 1, 2).
Akutní GvHD je iniciována aktivací dárcovských T lymfocytů aloantigeny hostitele. Efektorové subpopulace T lymfocytů namířené proti aloantigenům hostitele proliferují a sekretují cytokiny Th1 subtypu (IL-2, IFN- -g), které následně aktivují NK buňky a makrofágy. Aktivované makrofágy produkují prozánětlivé cytokiny (IL-1, IL-6, IL-12), které zpětně potencují aktivaci T lymfocytů a NK buněk. Především IL-12 pozitivně stimuluje produkci TH1 cytokinů. Aktivované NK buňky a cytotoxické CD8 a CD4 T lymfocyty přímo atakují cílové buňky příjemce. Zároveň svou zvýšenou sekrecí IFN-g zpětně aktivují makrofágy ke zvýšené produkci prozánětlivých cytokinů.
Důsledkem toxicity přípravného režimu je poškozování buněk pacienta a produkce prozánětlivých cytokinů (IL-1, TNF-a), které zvyšují imunogenicitu antigen prezentujících buněk příjemce. V případě aGvHD je tato cytokinová produkce mnohonásobně amplifikována prostřednictvím makrofágů aktivovaných IFN-g a lokálními toxiny (bakteriální GIT toxiny nebo latentní infekce).
Aktivace makrofágů a NK buněk může být rovněž navozena bakteriální nebo parazitární infekcí, kdy tyto buňky produkují vysoké hladiny IL-1, TNF-a a NO. Výsledkem je cytokinová bouře, jež je příčinou lokálního nekrotického poškození tkání příjemce (kůže, játra, GIT), systémové toxicity, ztráty tělesné hmotnosti a mortality.
Akutní GvHD může navodit i těžkou dlouhotrvající imunodeficiencivedoucí k opožděné rekonstituci imunity transplantovaného štěpu. U této imunodeficience se uplatňují následující imunopatologické faktory: deplece a anergie zralých lymfocytů dárce rozpoznávajících aloantigeny hostitele, nespecifická suprese funkce normálních T a B lymfocytů dárce a deficitní nebo opožděná lymfopoéza nových populací T a B lymfocytů. Pro aGvHD je typická iniciální expanze dárcovských CD4 a CD8 T lymfocytů rozpoznávajících aloantigeny příjemce. Poté se jejich počet významně snižuje v důsledku klonální delece programovanou buněčnou smrtí a navozením anergie.
Aktivované T lymfocyty dárce namířené proti aloantigenům příjemce aktivují makrofágy a NS buňky (přirozené su presorové buňky), které potlačují proliferaci normálních T a B lymfocytů dárce prostřednictvím produkce supresorových faktorů (TNF-a, IL-1, NO, IFN-g, TGF-b).
Akutní GvHD vede k opožděné rekonstituci lymfocytů (T, B, NK) a ke snížení počtu lymfoidních progenitorových buněk (důsledek IL-1 produkovaného aktivovanými makrofágy). NK buňky jsou první lymfoidní buněčnou linií rekonstituující se mezi 10. a 20. dnem po TKD bez manifestace aGvHD. V případě a GvHD se vyskytují ve snížené kvantitě. Rekonstituce B lymfocytů se objevuje zhruba 1 měsíc po TKD a normalizuje se během 4. až 8. měsíce. V případě manifestace GvHD je vývoj B lymfocytů abnormální (snížený počet periferních CD5+ B lymfocytů). Opožděná rekonstituce T lymfocytů je dána poškozením thymu, ke kterému dochází v časné fázi aGvHD.
Chronická forma
reakce štěpu proti
hostiteli (cGvHD)
Chronická GvHD je definovaná jako GvHD manifestující se po 100. dni po transplantaci (4, 13). Vzniká buď přímo z akutní GvHD, nebo po určité klidové fázi. Ojediněle se může vyskytnout bez předchozí akutní formy. Epidermální forma cGvHD připomíná svou histopatologií lichen planus. Histologicky je patrná difúzní lymfocytární infiltrace epidermis, infiltrace a destrukce epidermálních buněk bazální vrstvy epidermis, epidermální hyperplazie a zvýšené množství povrchového keratinu. Dermální typ cGvHD často následuje chronické epidermální poškození a připomíná v pozdějším stadiu klinické symptomy systémových autoimunitních onemocnění, zejména pak progresívní systémovou sklerózu. Jeho hlavním patologickým rysem je zvýšená depozice kolagenu a produkce autoprotilátek (Obr. 3).
Klinicko-patologicky se rozlišuje extenzívní a limitovaná forma cGvHD (Tab. 3)(13). Limitovaná cGvHD je charakterizována jako lokalizované postižení kůže a/nebo s cGvHD asociovaná jaterní dysfunkce. Pro extenzívní cGvHD je příznačné buď generalizované postižení kůže, nebo lokalizované postižení kůže a další postižení: oční sicca syndrom, postižení ústní sliznice či dalších orgánů (plíce, GIT, játra). Časté jsou poruchy pigmentace, vitiligo, porucha růstu vlasů a nehtů.
Patofyziologie
chronické GvHD
U akutní i chronické GvHD jsou postiženy stejné orgány, ale patofyziologic - ký mechanismus je značně odlišný(4). U aGvHD dominuje nekróza tkání, u cGvHD fibróza.
Pro kožní léze aGvHD je charakteristická nekróza epidermálních buněk bazální vrstvy a minimální lymfoidní infiltrát v dermis. Pro cGvHD je typická extenzívní dermální fibróza a hojný lymfocytární a plazmocytární infiltrát.
Zatímco v průběhu aGvHD dochází ke klonální expanzi TH1 lymfocytů a později k jejich apoptotické klonální deleci či navození tolerance vůči hostitelským aloantigenům, u cGvHD dominuje TH2 subpopulace (Obr. 4). TH2 lymfocyty dárce jsou nadále schopny rozpoznávat alo antigeny příjemce, neboť u této subpopulace nedošlo k navození tolerance. V průběhu rekonstituce imunity jsou vychovávány T lymfocyty v tymu. Thymus však může být důsledkem aGvHD vážně poškozen, a tudíž autoreaktivní (anti-host) T lymfocyty nemohou být zlikvidovány mechanismem negativní selekce. Nově vzniklé periferní autoreaktivní (anti-host) TH1 lymfocyty jsou z periferie deletovány, zatímco autoreaktivní (anti- -host) TH2 subpopulace nikoli. Symptomy cGvHD jsou zapříčiněny dominantními aloreaktivními TH2 lymfocyty dárce, které produkují ve zvýšených koncentracích IL-4, IL-5 a IL-10. Zvýšené hladiny IL-5 jsou asociovány se zvýšenou eozinofilií typickou pro cGvHD a parazitární infekce. IL-4 stimuluje B lymfocyty k tvorbě autoprotilátek. Zvýšené sérové hladiny IgM a IgG fragmentů (monoklonální gamapatie) indikují rovněž klonální dysregulaci imunitního systému. Žírné buňky stimulované IL-4 hrají hlavní roli v rozvoji kožních změn v cGvHD podobných sklerodermii.
GvHD a rizikové faktory
Výskyt GvHD závisí na shodě v antigenech hlavního histokompatibilního systému (HLA), počtu T lymfocytů ve štěpu, alosenzibilizaci dárce, věku pacienta, pohlaví dárce/příjemce, metodách prevence vzniku GvHD a na statutu pro tivirové imunity. Hlavním rozhodujícím faktorem při výběru dárce je shoda v anti genech hlavního histokompatibilního systému(12). Incidence GvHD se zvyšuje s narůstajícím počtem HLA neshodných alel.
Starší pacienti mají vyšší incidenci aGvHD a zvýšené riziko mortality v důsledku GvHD. Tato skutečnost je vysvětlována involucí thymu, jejímž důsledkem je snížená schopnost edukace T lymfocytů derivovaných ze štěpu dárce. Starší pacienti jsou rovněž více kolonizováni baktériemi a viry, což přispívá k amplifikaci GvHD. Poškozené tkáně se u starších pacientů hojí pomaleji než u mladších jedinců, a jsou tak velmi citlivé na každé další poškození.
Zvýšené riziko manifestace GvHD bylo pozorováno i u transplantací s rozdílným pohlavím dárce a příjemce. Je-li dárkyní transplantovaného štěpu žena a příjemcem muž, je vyšší riziko manifestace GvHD v důsledku rozpoznání pohlavně specifického minoritního histokompatibilního antigenu H-Y(7, 8).
Riziko GvHD významně stoupá i v případě, je-li dárkyní žena aloimunizovaná v důsledku předchozích gravidit. Z dárcovství se doporučuje vyloučit jedince aloimunizované v důsledku transfúzí. V případě inkompatibility mezi dárcem a příjemcem ve skupinách AB0 a Rh je třeba odstranit erytrocyty a plazmu z převáděného štěpu a při změně krevní skupiny po transplantaci zároveň měnit i způsob podpůrné léčby krevními deriváty.
Počet T lymfocytů přítomných v transplantovaném štěpu koreluje s GvHD. Lymfocyty dárce přítomné ve štěpu urych lují jeho přihojení (engraftment) a navozují rovněž GvL efekt. Deplece T lymfocytů snižuje riziko GvHD, ale zvyšuje riziko selhání štěpu (graft failure).
Herpetické viry hrají důležitou roli v rozvoji akutní i chronické GvHD. Je-li dárce CMV pozitivní a příjemce CMV negativní, je nebezpečí přenosu infekce. Je-li pacient pozitivní a dárce negativní, nebo jsou-li oba CMV pozitivní, hrozí nebezpečí reaktivace latentní herpetické infekce u těžce imunokompromitovaného pacienta. V těchto případech se podává profylaxe ganciklovirem. Pozitivita vůči CMV a HSV nepříznivě ovlivňuje vznik a průběh GvHD dokonce i tehdy, jestliže nevznikne klinický obraz infekce.GvHD a hlavní
histokompatibilní systém
Hlavním rozhodujícím faktorem při výběru dárce je shoda v antigenech hlavního histokompatibilního systému (HLA). Z HLA I. a II. třídy antigenů jsou zvláště významné antigeny HLA-A, HLA-B a HLA-DR lokusů; mé -ně významné jsou pak antigeny HLA-Cw, HLA-DQ a HLA-DP lokusů(12).
Jako základní screeningový test histokompatibility se používá standardní mikrocytotoxický test. Typizované buňky jsou inkubovány společně se souborem typizačních antisér o známých specifitách proti jednotlivým antigenům HLA-A, HLA-B a HLA-DR lokusů. Komplexy antigen-protilátka vytvořené na povrchu cílových buněk fixují komplement, jehož aktivace vede k poškození plazmatické membrány a následné buněčné smrti.
Pro výběr HLA identického souroze - nec kého dárce je sérologická typizace doplňována a zpřesňována molekulárně genetickou analýzou HLA-DRB, HLA-DQB a HLA-Cw lokusů metodikou polymerázové řetězové reakce (PCR) za použití sekvenčně specifických primerů (PCR-SSP) nebo sekvenčně specifických oligonukleotidových sond (PCR-SSO). Vzhledem k dědičnosti mateřských a otcovských alel je pro HLA identické sourozenecké transplantace postačující DNA analýza s nízkou rozlišovací schopností bez přesné subtypizace jednotlivých alel. Naopak velmi přesná DNA analýza (DNA analýza s vysokou rozlišovací schopností) s přesnou subtypizací jednotlivých alel je nezbytná při výběru nepříbuzenských dárců. V případě nutnosti se provádí i DNA analýza HLA-A, HLA-B a HLA-DPB lokusů.
U HLA genotypicky identických sourozenců je popisována akutní GvHD u 30 až 60 % příjemců v závislosti na GvHD profylaxi a dalších rizikových faktorech. Akutní GvHD je zde pravděpodobně iniciována rozpoznáním minoritních histokompatibilních antigenů prezentovaných na pozadí MHC molekul.Pacienti transplantovaní štěpy HLA shodných nepříbuzných dárců jsou ve větším riziku manifestace GvHD než pacienti transplantovaní od svých HLA identických sourozenců. Vyšší incidence GvHD u nepříbuzenských transplantací je přičítána nedetekovaným HLA determinantám a neshodě v non-HLA histokompatibilních genech.
GvHD a minoritní
histokompatibilní antigeny
Akutní GvHD může postihnout 30 až 60 % příjemců histokompatibilních sourozeneckých hematopoetických buněk. Manifestace akutní GvHD je v těchto případech rovněž přičítána neshodě v non-HLA antigenech mezi dárcem a příjemcem(7, 8). Doposud bylo identifikováno osm lidských minoritních histokompatibilních antigenů (miHag); jeden pohlavně specifický (H-Y) a ostatních sedm, které nejsou vázány na pohlaví (HA-1, HA-2, HA-3, HA-4, HA-5, HA-6, HA-7).
Minoritní histokompatibilní antigeny jsou peptidy odvozené od značně konzervativních endogenních proteinů exprimované na pozadí MHC I. a MHC II. třídy molekul. V případě transplantací mohou být imunogenní a vyvolávat imunitní odpověď, jejímž důsledkem je nejen GvHD, ale i GvL efekt či selhání štěpu. Rozpoznání minoritních histokompatibilních antigenů HA-1, HA-2, HA-4 a HA-5 je realizováno v asociaci s HLA-A2 molekulou. HA-3 antigen je rozpoznáván na pozadí HLA-A1 molekuly, H-Y antigen v kontextu s HLA-A2 a HLA-B7 molekulami. Rozpoznávání HA-6 a HA-7 antigenů je restringováno na HLA-B7 molekulu. Rozpoznání miHag je omezeno pouze na T lymfocyty.
Neshoda v jednom nebo více HA-1, HA-2, HA-4 a HA-5 antigenech je u dospělých pacientů s transplantovanou kostní dření svých HLA identických sourozenců významně asociována s rozvojem GvHD. Tato asociace nebyla prokázána u dětí. Rozvoj GvHD ł II. stupně byl pozorován i při jediné neshodě v HA-1 antigenu. V tomto případě se GvHD rozvíjí, je-li HA-1 molekula exprimována pouze na buňkách příjemce, a nikoliv na buňkách dárce. HA-1 molekula je exprimována u 69 % lidí s expresí HLA-A2 molekuly (HLA-A*0201 alela) a je v současné době považována za nejdůležitější miHag. HA-1 a HA-2 molekuly jsou exprimovány pouze na hematopoetických buňkách (včetně buněk leukemických) a jejich prekursorech. Jejich exprese nebyla prokázána na ostatních tkáních (fibroblasty, keratinocyty, hepatocyty). Naproti tomu HA-3, HA-4, HA-6, HA-7 a H-Y antigeny jsou exprimovány na buňkách všech tkání.
Prospektivní typizace minoritních histokompatibilních antigenů je dalším nástrojem zdokonalení výběru dárců a určením individuálního rizika incidence a závažnosti GvHD. Studium miHag je možno experimentálně využít i k imunomodulaci GvHD prostřednictvím antagonistů příslušných T buněčných receptorů a navození GvL efektu s použitím specifických CTL namířeným proti miHag exprimovaným pouze na leukemických buňkách, a nikoli na tkáních příjemce (HA-1, HA-2 antigeny). Tento experimentální přístup adoptivní imunoterapie by umožnil minimalizovat GvHD a zabránil by relapsu hematologických malignit.
Minoritní histokompatibilní antigeny mohou být typizovány na úrovni molekulárně genetické pomocí PCR nebo na úrovni buněčné s použitím specifických cytotoxických T lymfocytů (CTL). Cytotoxické T lymfocyty byly izolovány a purifikovány z periferní krve pacientů s GvHD transplantovaných štěpy genotypicky HLA shodných sourozenců. Jejich specifičnost je dána schopností lýzy buněk exprimujících jednotlivé miHag.
GvHD a polymorfismus
cytokinových genů
V průběhu přípravného režimu dochází vlivem celotělového ozařování a intenzívní ablativní chemoterapie k přechodné produkci prozánětlivých cytokinů typu IL-1 a TNF-a. Zvýšené hladiny TNF-a v iniciální fázi transplantace souvisí se zvýšenou morbiditou a mortalitou, neboť predisponují pacienta k těžkému průběhu GvHD a některým dalším potransplantačním komplikacím (venookluzivní nemoc, septický šok) (1, 10).
V případě GvHD dochází po následné aktivaci zralých T lymfocytů dárce aloantigeny příjemce k mnohonásobné amplifikaci cytokinové produkce, jejíž výsledkem je lokální postižení tkání a systémová toxicita. Pokud byla v rámci přípravného režimu použita anti-TNF-a monoklonální protilátka, oddálil se nástup a zmírnila se tíže akutní GvHD.
Tyto poznatky vedly k vyřčení hypotézy, že pacient může být geneticky predisponován ke zvýšené produkci TNF-a a tím ke komplikovanému průběhu TKD. Tato hypotéza byla potvrzena studiem polymorfismu cytokinových genů.
Polymorfismus TNF
a asociace s potransplantačními
komplikacemi
TNF lokus je lokalizován v oblasti hlavního histokompatibilního komplexu (MHC) na 6. chromosomu a skládá se ze 2 genů kódujících pleiotropní cytokiny: TNF-a a TNF-b (Obr. 5). Ve srovnání s vysoce polymorfními lokusy kódujícími geny MHC I. třídy a MHC II. třídy má TNF lokus malý polymorfismus (6 polymorfních markerů).
–308(G/A) polymorfismus promotorové oblasti TNF-a genu (TNF2 alela) je silně asociován s haplotypem HLA-A1, HLA- -B8, HLA-DR3 a s vysokou in vitro a in vivo TNF-a produkcí. Tento haplotyp je často pozorován u pacientů s autoimunitními onemocněními. Asociace mezi těžkou akutní GvHD a přítomností TNF-2 alely se však prokázat nepodařilo. V TNF lokusu se rovněž vyskytuje několik polymorfních mikrosatelitních sekvencí. Lokusy TNF-a, TNF-b a TNF-c jsou lokalizovány v TNF-b genu a lokusy TNF-e a TNF-d v oblasti TNF-a genu. Polymorfismus těchto lokusů je dán počtem opakování jednotlivých dinukleotidových mikrosatelitních sekvencí.
TNF-d lokus je lokalizován v intronu v blízkosti Lst-1 genu a jeho polymorfismus je dán existencí 7 alel (TNFd1 – d7). TNF-d3 alela se vyskytuje v kavkazské populaci nejčastěji a je rovněž asociována se zvýšenou produkcí TNF-a. Byla popsána asociace těžké akutní GvHD (GvHD ł III. stupně) u TNF-d3/d3 homozygotních příjemců kostní dřeně od svých HLA identických sourozenců na GvHD profylaktické monoterapii cyklosporinem. U TNF-d3/d3 homozygotů byla pozorována i vyšší mortalita v raném potransplantačním období. 24 % pacientů zemřelo v období prvních 30 dnů. Časná mortalita u pacientů s genotypem bez přítomnosti TNF-d3 alely dosahovala pouze 6,8 %. U TNF-d3/d3 homozygotů byl rovněž zaznamenán zvýšený počet rejekcí u transplantací srdce.
Polymorfismus IL-10
a asociace
s potransplantačními
komplikacemi
IL-10 představuje klíčový cytokin imunitní regulace kontrolující rovnováhu mezi zánětem a humorální odpovědí. IL-10 je protizánětlivý cytokin. V průběhu před tran splan tační přípravy zabraňuje produkci TNF-a (antagonista TNF-a), a tím snižuje riziko akutní GvHD a dalších potransplantačních komplikací. U pacientů s akutní i chronickou GvHD byla pozorována snížená in vitro produkce IL-10. Genetická predispozice k nižší produkci IL-10 předurčuje pacienty ke komplikovanému průběhu TKD.
Gen kódující IL-10 se nachází na 1. chromozomu. Polymorfismus IL-10 genu je lokalizován v promotorové oblasti, kde se vyskytují dva mikrosatelitní lokusy s rozdílným počtem opakujících se dinukleotidových sekvencí (IL-10G a IL-10R) a tři oblasti s bodovými mutacemi (–1082, –854, –627). Byla prokázána asociace IL-10 –1064 polymorfismu (IL-10G lokus) s těžkou GvHD. IL-10G mikrosatelitní lokus obsahuje celkem 16 alel (IL-10G1 – 16). V po pula ci se nejčastěji vyskytuje alela IL- -10G9. Dominují homozygoti IL-10G9/9. U heterozygotů je pozorován nejčastěji genotyp IL-10G9/13 a IL-10G9/10. Větší počet CA repetic IL-10 –1064 mikrosatelitního lokusu (alely IL-10G12 – 15) byl pozorován u pacientů s těžkou akutní GvHD (GvHD ł III. stupně). Všichni pacienti byli transplantováni kostní dření svých HLA identických sourozenců a dostávali rovněž GvHD profylaxi ve formě cyklosporinu.
IL-10 je rovněž znám jako proliferační faktor B lymfocytů. V případě dysregulace imunitního systému se významně podílí na patogenezi některých auto imunitních onemocnění (SLE, RA, SS).
Polymorfismus TNF-a
a IL-10 a asociace s potransplantačními komplikacemi
Genotyp TNF-d3/d3 a IL-10G 12 – 15 je po kládán za jeden z rizikových faktorů potransplantačních komplikací u pacientů léčených transplantací hematopoetických kmenových buněk. Je asociován s těžkou akutní GvHD u HLA identických sourozeneckých transplantací na duální GvHD profylaxi cyklosporinem a metotrexátem. Zároveň je asociován i s časnou potransplantační mortalitou. Z těchto publikovaných studií vyplývá, že pacienta mohou k závažným potransplantačním komplikacím predisponovat i jiné genetické faktory než polymorfismus HLA molekul.
GvHD a její predikce
buněčnými metodami
Kromě sérologických a molekulárně genetických metod HLA typizace se používají buněčné metody k potvrzení kompatibility mezi potenciálním dárcem a příjemcem a ke zjištění vzájemné aloreaktivity.
Směsná lymfocytární kultura (MLC) po tvrzuje shodu v antigenech HLA-D ob lasti (lokusy HLA-DR, HLA-DQ a HLA-DP) a používá se jak u transplantací ledvin, tak u transplantací hematopoetických buněk k výběru nejvhodnějšího (nejméně stimulujícího) dárce. MLC je indikována jak u sourozeneckých transplantací krvetvorných buněk, tak u transplantací od alternativních dárců, kde je mimořádně důležitá pro odhalení skrytých inkompatibilit v antigenech HLA II. třídy. Reaktivita v MLC pravděpodobně odráží první krok imunitního rozpoznávání při rejekci štěpu in vivo. Imunogenní epitopy tvořené kombinací antigenů kódovaných jednotlivými lokusy v oblasti D jsou rozpoznávány T lymfocyty dárce (graft versus host, GvH) či příjemce (host versus graft, HvG). Sleduje se schopnost stimulovaných buněk syntetizovat de novo DNA inkorporací 3H-thymidinu do jádra v jednosměrné alogenní či autologní kultuře. MLC se provádí v uspořádání graft versus host (GvH), kdy pacientovy ozářené buňky stimulují buňky dárce a v recipročním provedení ve směru host versus graft (HvG). Stimulační index (SI Ł 2) a relativní odpověď (RR 1:100 000 a negativní v případě f (2).Předpokládá se, žereaktivita dárcovských HTLp je namířena proti inkompatibilním HLA molekulám II. třídy příjemce u dárců nepříbuzenských a proti antigenům minoritního histokompatibilního systému příjemce u HLA identických sourozenců. Některé studie poukazují na korelaci frekvence výskytu HTLp s incidencí a tíží akutní GvHD u HLA identických sourozeneckých transplantací a na možnost použití této metodiky při výběru optimálního sourozeneckého dárce. Studie prováděné u nepříbuzenských dárců doporučují kombinovat metodu HTLp a CTLp pro zpřesnění výběru dárce a k predikci závažné akutní GvHD. HTLp metoda je založena na podobném principu jako metoda CTLp. Po třídenní společné kokultuře dárcovských a příjemcovských buněk jsou sbírány supernatanty a v případě, že obsahují IL-2, proliferuje pod jejich účinkem IL-2 dependentní buněčná linie (CTLL-2). Proliferace těchto buněk se měří radioaktivně-scintilační spektrofotometrií a je dána schopností inkorporace 3H-thymidinu do de novo syntetizované DNA.
Metoda modelu kožního explantátu (3, 11) je v současné době používána jako in vitro GvHD předtransplantační prediktivní test. Metoda využívá respondérských lymfocytů dárce senzibilizovaných mononukleárními buňkami pacienta in vitro v alogenní směsné lymfocytární kultuře (MLC), které jsou následně inkubovány s kožním explantátem pacienta. Histopatologické změny v kožním explantátu jsou vyhodnocovány podle standardní Lernerovy klasifikace pro akutní GvHD (Obr. 6 až 10). Původní práce byly zaměřeny na predikci GvHD v souboru HLA identických sourozeneckých transplantací u dospělých jedinců. Na našem pracovišti se zaměřujeme na využití metody modelu kožního explantátu za účelem predikce výskytu a tíže akutní GvHD v souboru dětských a dospělých pacientů transplantovaných štěpy svých HLA identických sourozenců, haplo identických příbuzných a nepříbuzných dárců vyhledaných prostřednictvím národních i mezinárodních registrů. Výsledky GvHD predikce korelujeme s klinickou manifestací akutní GvHD a hodnotíme vliv GvHD profylaxe na prevenci GvHD.
Výsledky GvHD predikce metodou modelu kožního explantátu mohou přispět k výběru optimálního dárce, je-li jich k dispozici několik.
Metoda modelu kožního explantátu je používána jako in vitro GvHD předtransplantační prediktivní test v několika evropských transplantačních centrech (Royal Victoria Infirmary, Newcastle upon Tyne; 2. dětská klinika 2. LF UK, FN Motol; Klinik der Universität, Regensburg; Klinik Grosshadern der Ludwig Maximillian Universität, München). Metodu originálně vyvinul dr. Vogelsang v John Hopkins University School of Medicine, Baltimore.
1. CAVET, JC., MIDDLETON, PG., SEGALL, M., et al. Recipient Tumor Necrosis Factor-a Gene Polymorphisms Associate With Early Mortality and Acute Graft-Versus-Host Disease severity in HLA-Matched Sibling Bone Marrow Transplants. Blood, 1999,11, p. 3941–3946.
2. DEACOCK, S., SCHWARER, AP., BATCHELOR, JR., et al.. A rapid limiting dilution assay for measuring frequencies of alloreactive interleukin-2 producing T cells in humans. J Immunol Methods, 1992,147, p. 83–92.
3. DICKINSON, AM., HROMADNÍKOVÁ I., SVILAND L., et al. Use of a skin explant model for predicting GvHD in HLA-matched bone marrow transplants – effect of GVHD prophylaxis. Bone Marrow Transplant, 1999, 24, p. 857–863.
4. FERRARA, JLM., DEEG, HJ, BURAKOFF, SJ. Graft-versus-Host Disease. 2nd ed., New York : Marcel Dekker, Inc.
5. FERRARA JLM., LEVY, R., CHAO, NJ. Pathophysiologic mechanisms of acute graft-versus-host disease. Biol Blood Marrow Transplant, 1999, 5, p. 347–56.
6. FLOWERS, MED., KANSU, E., SULLIVAN, KM. Pathophysiology and Treatment of Graft-Versus-Host Disease. Hematol Oncol Clin North Am, 1999, 13, p. 1091-1112.
7. GOULMY, E. Minor Histocompatibility Antigens: From T Cell Recognition to Peptide Identification. Hum Immunol, 1997, 54, p. 8–14.
8. GOULMY, E. Human Minor Histocompatibility Antigens: New Concepts for marrow transplantation and adoptive immunotherapy. Immunol Rev, 1997, 157, p. 125–140.
9. KAMINSKI, E., HOWS, JM., MAN, S., et al. Prediction of graft versus host disease by frequency analysis of cytotoxic T cells after unrelated bone marrow transplantation. Transplantation, 1989, 48, p. 608–613.
10. MIDDLETON, PG., TAYLOR, PRA., JACKSON, G., et al. Cytokine Gene Polymorphisms Associating With Severe Acute Graft-Versus-Host Disease in HLA Identical Sibling Transplants. Blood, 1998, 10, p. 3943–3948.
11. VOGELSANG, GB., HESS, AD., BERKMAN, AW., et al. An in vitro predictive test for graft versus host disease in patients with genotypic HLA identical bone marrow transplants. New Engl J Med, 1985, 313, p. 645–650.
12. THOMAS, ED. Bone Marrow Transplantation: A Review. Seminars in Hematology, 1999, 36, p. 95–103.
13. VAŇÁSEK, J., STARÝ, J., KAVAN, P., VAŇÁSEK, J. jr. Transplantace kostní dřeně. Praha : Galén, 1996.e-mail: ilona.hromadnikova@lfmotol.cuni.cz
Dodatek:
Problematika predikce reakce štěpu proti hostiteli je řešena na 2. dětské klinice 2. LF UK, FN Motol, v rámci grantových projektů IGA MZ ČR 3555-3, EC Demonstration Project PL NE1 4LP a NATO Collaborative Research project: Predicting graft versus host disease in bone marrow transplantation using in vitro techniques. Více informací je možné nalézt na následující adrese: http://www.ncl.ac.uk
Literatura