Klíčová slova
preimplantační genetická diagnostika * mužská infertilita * chromosomální poruchy
Indikace pro preimplantační genetickou diagnostiku u mužské infertility
Z hlediska mužské infertility je nejnaléhavější indikace k PGD u nositelů strukturálních chromosomálních aberací, zejména robertsonovských a reciprokých translokací, neboť tito muži produkují vysoké procento chromosomálně nebalancovaných spermií. Také u mužů s Klinefelterovým syndromem (47,XXY) v čisté formě nebo v mozaice může PGD přispět k výběru chromosomálně normálního embrya, neboť i u těchto mužů je zvýšené riziko vzniku chromosomálně nebalancovaných spermií. Jestliže je u muže s azoospermií nebo těžkou oligozoospermií detekována Yq delece, bude tato porucha přenesena na mužské potomstvo.
PGD umožňuje vyhnout se přenosu delece výběrem pouze samičích embryí pro transfer. O PGD je rovněž vhodné uvažovat v případě embryí, kde k oplození byly použity mužské pohlavní buňky získané testikulární extrakcí u mužů se závažným deřcitem spermiogeneze, která je často spojena s vyšší frekvencí chromosomálně abnormálních spermií. Z monogenně dědičných chorob se s mužskou infertilitou nejčastěji setkáváme u cystické fibrózy, což je onemocnění s autosomálně recesivní dědičností.
Příčinou je mutace v CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) genu. Heterozygotní muži pro CFTR mutaci mají často kongenitální bilaterální absenci vas deferens s obstrukční azoospermií. Pokud žena v páru není nositelkou mutace, je pravděpodobnost vzniku onemocnění u potomstva minimální. U párů, kde jsou oba partneři nositelé aspoň jedné CFTR mutace, PGD umožní vyhnout se narození dítěte s cystickou fibrózou.
Strukturální chromosomální přestavby a infertilita
Přítomnost balancované strukturální chromosomální aberace v karyotypu je relativně častou příčinou infertility, kde preimplantační genetická diagnostika (PGD) je nezřídka jedinou nadějí pro infertilní pár. Jedná se především o reciproké (Obr. 1) nebo robertsonovské translokace (Obr. 2), v některých případech i inverze. Jejich podstatou jsou strukturální přestavby chromosomů způsobené zlomem a nesprávným znovuspojením, přičemž je zachováno celkové množství genetického materiálu. Nositelem translokace u infertilního páru může být jak žena, tak muž. Translokace může být zděděna po některém z rodičů, nebo může vzniknout de novo.
Vzhledem k tomu, že více než 80 % de novo vzniklých strukturálních chromosomálních aberací je paternálního původu, můžeme za hlavní zdroj výskytu těchto aberací považovat spermiogenezi. U jejich nositelů většinou nedochází k žádným závažným fenotypovým projevům, významně však ovlivňují fertilitu jedince, zvyšují riziko abortu či narození postiženého potomka s nebalancovaným karyotypem. Obecně lze říci, že reciproké translokace přinášejí svým nositelům větš reprodukční problémy než translokace robertsonovské a nejhůře jsou na tom nositelé reciprokých translokací, do kterých jsou zahrnuty pohlavní chromosomy, protože přibližně polovina žen a prakticky všichni muži - nositelé tohoto typu translokací - jsou neplodní.(1)
Zatímco balancované translokace se vyskytují pouze asi u 0,2 % novorozenců, jejich frekvence u infertilních párů je 0,6 %, u infertilních mužů se závažnou poruchou spermiogeneze činí 2-3,2 % a u párů s opakovanými potraty dokonce 9,2 %.(2) Pokud jde o inverze chromosomů, jsou to intrachromosomální přestavby vznikající dvěma zlomy na témže chromosomu, otočením vnitřního segmentu o 180° a znovuspojením.
Pokud vyloučíme heterochromatinové formy a další prostudované malé inverze, u kterých nebyla zjištěna genetická rizika (neškodné varianty), vyskytují se inverze s vlivem na reprodukci ve velmi nízké frekvenci - řádově v desetinách promile. Chromosomální přestavby je možné poměrně snadno detekovat vyšetřením karyotypu periferních lymfocytů pomocí pruhovacích metod (především G-pruhování) a fluorescenční in situ hybridizace (FISH -fluorescence in situ hybridization), proto by cytogenetické vyšetření mělo být jedním ze základních kroků při zjišťování příčin infertility.
Příčiny infertility u mužů nositelů strukturálních chromosomálních přestaveb
Primární příčinou snížené fertility bývá v těchto případech většinou nesprávná meiotická segregace chromosomů zahrnutých v translokaci. V profázi prvního meiotického dělení dochází k párování a synapsi homologních chromosomů za vzniku bivalentů. Při procesu párování se velmi přesně spojují korespondující DNA segmenty po celé délce příslušných chromosomů. U nositelů robertsonovských translokací však místo bivalentů vznikají trivalenty tvořené fúzovaným chromosomem a oběma normálními homologními chromosomy.
Podobně u reciprokých translokací během prvního meiotického dělení vzniká kvadrivalent tvořený dvěma normálními a dvěma derivovanými chromosomy (Obr. 3). V další fázi prvního meiotického dělení se obě součásti každého bivalentu od sebe oddělí. Dochází k tzv. segregaci homologních chromosomů, jejich přechodu (disjunkci) k opačným pólům dělící se buňky a následně do buněk dceřiných. V důsledku nerovnoměrné segregace chromosomů trivalentu, resp. kvadrivalentu, pak u nositelů vrozených balancovaných robertsonovských a reciprokých translokací vznikají kromě chromosomálně normálních a balancovaných gamet i gamety nesoucí úplné či parciální disomie (celý chromosom nebo jeho část je navíc) a nulisomie (celý chromosom nebo jeho část chybí) chromosomů zúčastněných na translokaci.
Na rozdíl od oogeneze během spermatogeneze vznikají z každého primárního spermatocytu čtyři spermie, takže žádný produkt nesprávné segregace nemusí být ztracen. Na Obr. 4, 5 jsou schematicky znázorněny jednotlivé typy segregace, ať již jde o segregaci alternativní za vzniku normálních a balancovaných gamet, segregaci typu I, při které dochází ke správné segregaci homologních centromer, ale nesprávné kombinaci normálních a translokovaných chromosomů, segregaci typu II s nesprávnou segregací homologních centromer, segregaci typu 3 : 1 či vzácnou segregaci typu 4 : 0.
Frekvence jednotlivých typů segregace závisí na chromosomech zahrnutých v translokaci, na pozici zlomů a přítomnosti intersticiálních chiasmat. I u nositelů podobných či identických translokací se mohou frekvence jednotlivých typů segregace významně lišit, i když v řadě prací na toto téma byly zjištěny podobné segregační profily jen s drobnými odlišnostmi.(3, 4) Situaci může zhoršovat interchromosomální vliv balancovaných translokací, tedy možné narušení meiotického párování a segregace ostatních chromosomů nezúčastněných na translokaci s důsledkem nondisjunkce (nedojde k rozchodu chromosomů) a vzniku aneuploidních gamet, tj. gamet s numerickými odchylkami chromosomů.
Mezi možné příčiny patří synaptické anomálie, jako jsou existence nespárovaných oblastí chromosomů (asynapse) či párování nehomologních segmentů (heterosynapse), s tím spojená redukce rekombinace, a konečně asociace trivalentů a kvadrivalentů s pohlavními chromosomy a dalšími částečně nespárovanými bivalenty. Především jde o oblasti zlomů u reciprokých translokací a krátká ramena akrocentrických chromosomů. Tyto jevy byly pozorovány při studiu pachytene spermatocytů jak u reciprokých, tak u robertsonovských translokací a v řadě případů byly v korelaci s vážnými poruchami spermatogeneze až azoospermií.(5)
Snížení fertility a riziko vzniku plodu s nebalancovaným karyotypem pozorované u nositelů některých pericentrických inverzí bývá důsledkem meiotické rekombinace mezi invertovaným chromosomem a jeho normálním homologem, které podstupují synapsi formou inverzní smyčky v profázi prvního meiotického dělení. Po lichém počtu rekombinací v invertovaném segmentu pak vznikají gamety s parciální duplikací a delecí částí chromosomu ležících distálně od invertovaného úseku (Obr. 6). U nositelů paracentrických inverzí vznikají rekombinací dicentrické a acentrické chromosomy, jejichž přítomnost je pro gamety letální.
Rekombinace, při nichž by vznikly viabilní gamety, jsou velmi vzácné. Existence interchromosomálního efektu je možná i v případě inverzí. Předpokládá se, že je důsledkem interakce mezi nespárovanými oblastmi chromosomálního páru s inverzí a dalšími chromosomy. Poruchami párování se vysvětluje i primární infertilita spojená s poruchou spermatogeneze, protože asynapse rozeznaná kontrolními mechanismy v průběhu prvního meiotického dělení vede k zastavení meiózy a k apoptóze.
Vyšetření chromosomů spermií
Rozvoj metod molekulární cytogenetiky v posledních letech, zejména využití fluorescenční in situ hybridizace, přinesl řadu nových možností studia poruch chromosomů v pohlavních buňkách. Metoda FISH je velmi efektivní. Vyšetření chromosomů ve spermiích bylo již delší dobu prováděno pomocí metody „humansperm/hamster-oocyte fusion assay“, při které byly oocyty křečka, zbavené zona pellucida, oplodněny lidskými spermiemi a chromosomy byly vyšetřeny před tím, než došlo k fúzi samčí a samičí mitózy. Tato metoda je nesmírně pracná a metodicky náročná. Sedm laboratoří z pěti zemí vyšetřilo za 15 let pouze 20 000 lidských spermií.
Zavedení metody FISH dovoluje velmi rychle vyšetřovat chromosomální aberace ve velkých vzorcích spermií. Pro stanovení frekvence aneuploidií se běžně vyšetřuje 10 000 spermií od jednoho dárce.(6) Princip metody FISH je postaven na schopnosti jednořetězcové DNA sondy se vázat s komplementárními úseky vyšetřované, rovněž jednořetězcové DNA. Zahřátím dvoušroubovicové molekuly DNA na vyšší teplotu zanikají vodíkové vazby a vlákna DNA se od sebe oddělují -dochází k denaturaci.
Po ochlazení se komplementární vlákna DNA opět spojují - dochází k renaturaci. Je-li k denaturované cílové DNA (např. spermie nebo blastomery) přidána denaturovaná DNA sonda a snížena teplota, hybridizuje sonda s komplementární částí cílové DNA. Tím se zabuduje na specifické místo určitého chromosomu. DNA sonda je označena fluorochromem, který dává barevný signál a ten je možno detekovat ve fluorescenčním mikroskopu.
Pro vyšetření aneuploidií chromosomů ve spermiích lze použít centromerické nebo lokus specifické DNA sondy, které identifikují chromosom pomocí barevného signálu. Kombinovat lze různobarevné sondy pro několik chromosomů (Obr. 7). Spermie je haploidní buňka, proto by pro každý chromosom měl být zjištěn pouze jeden signál. Jsou-li ve spermii signály dva, jedná se o disomii, tedy přítomnost dvou chromosomů. Taková spermie by v kombinaci s normálním oocytem dala vzniknout jedinci s trisomií daného chromosomu (např. trisomie chromosomu 21, tzv. Downův syndrom).
Samozřejmě chromosom může také chybět, pak mluvíme o nulosomii, a vzniklý jedinec má monosomii, má tedy některý chromosom pouze od matky (např. monosomie chromosomu X, tzv. Turnerův syndrom). Při studiu spermií nositelů robertsonovských translokací se využívá kombinace dvou různě fluorescenčně značených DNA sond specifických pro chromosomy zúčastněné na fúzi (Obr. 4). U reciprokých translokací je nutno použít kombinaci tří různě značených sond - dvě pro centromery a jedna pro telomeru (terminální část chromosomu) nebo jedna pro centromeru a dvě pro telomery (Obr. 5, 8). Frekvence nebalancovaných spermií u nositelů balancovaných translokací zjištěné metodou FISH na našem pracovišti jsou prezentovány na Obr. 9.
Tyto výsledky odpovídají údajům uváděným v literatuře, kde se frekvence nebalancovaných spermií udává v rozmezí 2,7-36 % u nositelů robertsonovských translokací a 19,3-81,4 % u nositelů reciprokých translokací.(4, 7) FISH sice neumožňuje odlišit spermie s normálním karyotypem od spermií balancovaných, avšak při správně zvolené kombinaci DNA sond můžeme snadno a rychle stanovovat frekvence všech typů segregace, stejně jako aneuploidie. Frekvence nebalancovaných gamet u nositelů inverzí zjištěné pomocí FISH s telomerickými sondami se pohybuje v rozsahu 0-37,4 %.
Pravděpodobnost jejich vzniku je u nositelů pericentrických inverzí většinou úměrná rozsahu dané inverze (minimálně 100 Mbp) a její proporci k délce chromosomu.(8) Predikční hodnotu vyšetření segregace chromosomů metodou FISH u mužů nositelů balancovaných reciprokých translokací ve vztahu k frekvenci abnormálních embryí vznikajících u těchto párů hodnotil Escudero aj.(9) Za kritickou hranici pro úspěšnost IVF pokládají tito autoři frekvenci nebalancovaných spermií 65 %. Tuto hranici překročilo v našem souboru 29 % mužů s reciprokou translokací. Vyšetření frekvence nebalancovaných spermií nositelů translokací tedy umožňuje odhadnout, jakou má infertilní pár naději, že se kombinací IVF a PGD podaří získat embryo vhodné k transferu.
Významné je vyšetření spermií také u nositelů numerických chromosomálních aberací pohlavních chromosomů pro posouzení indikace PGD. To se u mužů týká zejména Klinefelterova syndromu (47,XXY). Prevalence tohoto syndromu je mezi infertilními muži vysoká, činí okolo 5 % u závažné oligozoospermie a až 10 % u azoospermiků. Vyšetření aneuploidií ve spermiích těchto mužů ukázalo, že mají signifikantně vyšší frekvenci aneuploidií pohlavních chromosomů, a to zejména spermií XY, ale i spermií XX zejména u pacientů bez mozaiky.(10) Je zde tedy zvýšené riziko narození dětí s karyotypem 47,XXY a 47,XXX. O PGD nebo prenatální diagnostice by mělo být v těchto případech vždy uvažováno.
V neposlední řadě je třeba říci, že více autorů popsalo zvýšenou frekvenci numerických chromosomálních aberací ve spermiích u infertilních mužů s normálním karyotypem, ale závažnou oligozoospermií, teratozoospermií, astenozoospermií a azoospermií.(11-13) Z toho vyplývá, že použití ICSI (IntraCytoplasmic Sperm Injection) u závažných poruch kvality spermatu je vždy spojeno se zvýšeným rizikem výskytu chromosomálních aberací u vzniklých embryí. To se samozřejmě týká i spermií získaných testikulární extrakcí u mužů se závažným deřcitem spermiogeneze. Zde byla popsána zejména zvýšená incidence embryí s mozaicismem chromosomů způsobená patrně nevyzrálými strukturami centrosomu u těchto spermií.(14)
Preimplantační genetická diagnostika chromosomálních poruch
Pro nositele chromosomálních aberací se závažnými problémy reprodukce může být řešením preimplantační genetická diagnostika.(15) Tato diagnostická metoda ve spojení s metodami in vitro fertilizace (IVF) umožňuje vyloučit z další kultivace a transferu embrya, která jsou z hlediska dané chromosomální přestavby nebalancovaná, a tím zvýšit pravděpodobnost dosažení těhotenství a narození zdravého potomka a na druhé straně snížit pravděpodobnost potracení plodu.(16) Pro rodiny, kde evidentně hrozí riziko početí životaschopného nebalancovaného plodu, může být PGD alternativou k prenatální diagnostice a následnému umělému přerušení těhotenství v případě pozitivního nálezu.
Metoda je založena na vyšetření chromosomů jedné až dvou blastomer, které jsou bioptovány z třídenního embrya. Méně používanou alternativou je biopsie trofoblastu pátý den kultivace. Tento odběr, pokud je odborně proveden, by neměl významně ovlivnit životaschopnost daného embrya. Odebrané blastomery se fixují na mikroskopické sklo a jádra buněk se vyšetřují pomocí fluorescenční in situ hybridizace se sondami navrženými tak, aby byly schopny odhalit všechny možné nebalancované formy, které mohly vzniknout při segregaci translokovaných chromosomů do gamet.
U robertsonovských translokací, podobně jako při vyšetření spermií, postačují dvě různě fluorescenčně značené DNA sondy specifické pro chromosomy zúčastněné na fúzi. U reciprokých translokací se většinou používají sondy distální a proximální k místům zlomů. V praxi to znamená hybridizaci v ideálním případě dvou centromerických a dvou telomerických sond specifických pro translokované chromosomy (Obr. 10). Vzhledem k tomu, že centromerické sondy pro některé chromosomy neexistují, je možno použít jen jednu centromerickou a dvě telomerické sondy s tím, že tyto tři sondy jsou stále dostatečné k tomu, abychom byli schopni rozpoznat všechny nebalancované formy embryí.(17, 18)
Nárůst aneuploidií jiných chromosomů v důsledku interchromosomálního efektu u nositelů translokací je - pokud vůbec existuje -z hlediska PGD zřejmě zanedbatelný.(19) Nicméně aneuploidie se obecně u preimplantačních embryí objevují ve vysoké míře, a proto je screening aneuploidií zároveň s vyšetřením chromosomů zahrnutých do translokace jistě žádoucí. Na rozdíl od robertsonovských translokací u reciprokých translokací je však tento přístup technicky hůře realizovatelný a běžně se neprovádí.
Důležité je si uvědomit, že vyšetření pomocí komerčně dostupných centromerických a telomerických sond na interfázních jádrech blastomer nám neumožňuje odlišit embrya, která nesou naprosto normální chromosomální výbavu, a embrya, která jsou sice balancovaná, ale přenášejí danou translokaci do další generace. Existují jisté možnosti, které nám tuto diferenciaci umožňují, nicméně se v klinické praxi z různých důvodů nepoužívají. Jde především o použití tzv. „spanning probes“, tj. sond, které jsou specifické pro oblasti zlomů u dané přestavby.(20)
V interfázním jádře lze tedy rozlišit, zda signál sondy zůstal kompaktní a patří normálnímu chromosomu, nebo zda je rozštěpen a spojen se signálem druhého chromosomu, což indikuje translokaci. Pro každou translokaci je však sondy třeba připravit individuálně, což je samozřejmě velice časově a rovněž finančně náročné. Z těchto důvodů se metoda běžně nepoužívá. Další možností je převedení interfázního jádra do metafáze, kdy jsou vidět jednotlivé chromosomy, a následné použití komerčně dostupných malovacích celochromosomových sond. Tyto metody však narážejí na etické problémy (v případě fúze blastomery se zvířecím oocytem) nebo dosud nejsou technicky propracovány tak, aby byly dostatečně spolehlivé.
U všech pacientů, kteří podstoupí PGD pro chromosomální přestavby, se následně doporučuje rovněž diagnostika prenatální. Pomocí FISH se stejnými sondami, jaké byly použity pro PGD, lze během pár dnů po amniocentéze vyloučit (případně potvrdit) nebalancovaný plod a po kultivaci amniocytů a získání metafázních chromosomů lze rovněž diagnostikovat, zda plod ponese normální chromosomální výbavu či zda bude přenášet stejnou translokaci jako jeho rodič.
Nositelé pericentrických inverzí chromosomů bývají klienty podstupujícími PGD podstatně méně často než pacienti s reciprokými translokacemi. Nicméně i u těchto nositelů je možno PGD provést, a to především v případech, kdy se v rodině vyskytlo dítě s nebalancovaným karyotypem v důsledku inverze nebo ze stejného důvodu došlo k potratu. Ještě mnohem příznivější situace je u nositelů paracentrických inverzí, kde genetické riziko pro potomky je extrémně malé.(21) Význam PGD pro nositele chromosomálních translokací pochopíme, když si uvědomíme, že 72 % embryí u nositelů robertsonovských a 82 % embryí u nositelů reciprokých translokací je chromosomálně abnormálních. Riziko spontánního potratu klesne z 81 % bez PGD na 13 % po PGD.(22) Stejně jako to bylo uvedeno u spermií, FISH umožňuje vyšetřovat aneuploidie různých chromosomů u embryí. To nám dovoluje využít PGD u příslušných indikací, jak byly uvedeny v příslušné kapitole.
1, 2Prof. MVDr. Jiří Rubeš, CSc., 1Mgr. Miluše Vozdová, Ph. D., 1, 2RNDr. Petra Musilová, Ph. D. 1Výzkumný ústav veterinárního lékařství, v. v. i., Brno 2Sanatorium REPROMEDA, Centrum reprodukční medicíny a preimplantační diagnostiky, Brnoe-mail: rubes@vri.cz
Literatura
1. GARDNER, RJ., SUTHERLAND, GR. Chromosome Abnormalities and Genetic Counseling. 3rd ed, Oxford : Oxford University Press, 2004, 604 p.
2. STERN, C., PERTILE, M., NORRIS, H., HALE, L., BAKER, HW. Chromosome translocations in couples with in-vitro fertilization implantation failure. Hum Reprod, 1999, 14, p. 2097-2101.
3. VOZDOVÁ, M., ORÁČOVÁ, E., HOŘÍNOVÁ, V., RUBEŠ, J. Sperm fluorescence in situ hybridization study of meiotic segregation and an interchromosomal effect in carriers of t(11;18). Hum Reprod, 2008, 23, p. 581-588.
4. BENET, J., OLIVER-BONET, M., CIFUENTES, P., TEMPLADO, C., NAVARRO, J. Segregation of chromosomes in sperm of reciprocal translocation carriers: a review. Cytogenet Genome Res, 2005, 111, p. 281-290.
5. SOLARI, AJ. Synaptonemal complex analysis in human male infertility. Eur J Histochem, 1999, 43, p. 265-276.
6. RUBEŠ, J., VOZDOVÁ, M., ORÁČOVÁ, E., PERREAULT, SD. Individual variation in the frequency of sperm aneuploidy in humans. Cytogenet Genome Res, 2005, 111, p. 229-236.
7. ROUX, C., TRIPOGNEY, C., MOREL, F., et al. Segregation of chromosomes in sperm of Robertsonian translocation carriers. Cytogenet Genome Res, 2005, 111, p. 291-296.
8. ANTON, E., BLANCO, J., EGOZCUE, J., VIDAL, F. Sperm studies in heterozygote inversion carriers: a review. Cytogenet Genome Res, 2005, 111, p. 297-304.
9. ESCUDERO, T., ABDELHADI, I., SANDALINAS, M., MUNNE, S. Predictive value of sperm fluorescence in situ hybridization analysis on the outcome of preimplantation genetic diagnosis for translocations. Fertil Steril, 2003, 79, Suppl. 3, p. 1528-1534.
10. FERLIN, A., GAROLLA, A., FORESTA, C. Chromosome abnormalities in sperm of individuals with constitutional sex chromosomal abnormalities. Cytogenet Genome Res, 2005, 111, p. 310-316.
11. MIHARU, N. Chromosome abnormalities in sperm from infertile men with normal somatic karyotypes: oligozoospermia. Cytogenet Genome Res, 2005, 111, p. 347351.
12. MACHEV, N., GOSSET, P., VIVILLE, S. Chromosome abnormalities in sperm from infertile men with normal somatic karyotypes: teratozoospermia. Cytogenet Genome Res, 2005, 111, p. 352-357.
13. RIVES, NM. Chromosome abnormalities in sperm from infertile men with normal somatic karyotypes: asthenozoospermia. Cytogenet Genome Res, 2005, 111, p. 358362.
14. SILBER, S., ESCUDERO, T., LENAHAN, K., et al. Chromosomal abnormalities in embryos derived from testicular sperm extraction. Fertil Steril, 2003, 79, p. 30-38.
15. FRAGOULI, E. Preimplantation genetic diagnosis: present and future. J Assist Reprod Genet, 2007, 24, p. 201-207.
16. OTANI, T., ROCHE, M., MIZUIKE, M., et al. Preimplantation genetic diagnosis signiřcantly improves the pregnancy outcome of translocation carriers with a history of recurrent miscarriage and unsuccessful pregnancies. Reprod Biomed Online, 2006, 13, p. 869-874.
17. SCRIVEN, PN., HANDYSIDE, AH., OGILVIE, CM. Chromosome translocations: segregation modes and strategies for preimplantation genetic diagnosis. Prenat Diagn, 1998, 18, p. 1437-1449.
18. MUNNÉ, S. Preimplantation genetic diagnosis of numerical and structural chromosome abnormalities. Reprod Biomed Online, 2002, 4, p. 183-196.
19. MUNNÉ, S., ESCUDERO, T., fiSCHER, J., et al. Negligible interchromosomal effect in embryos of Robertsonian translocation carriers. Reprod Biomed Online, 2005, 10, p. 363-369.
20. CASSEL, MJ., MUNNÉ, S., FUNG, J., WEIER, HU. Carrier-specific breakpoint-spanning DNA probes: an approach to preimplantation genetic diagnosis in interphase cells. Hum Reprod, 1997, 12, p. 2019-2027.
21. BALÍČEK, P. Paracentrické inverze lidskůch chromozomó a jejich rizika. Čas Lék čes, 2004, 143, s. 35-38.
22. MUNNÉ, S. Analysis of chromosome segregation during preimplantation genetic diagnosis in both male and female translocation heterozygotes. Cytogenet Genome Res, 2005, 111, p. 305-309. Fertil Steril, 2003, 79, p. 30-38.
Práce podpořena grantem MZe 0002716201.