Prof. Ing. Kyra Michalová, DrSc.
Univerzita Karlova v Praze, 1. LF a VFN, Ústav klinické biochemie, Centrum nádorové cytogenetiky
Klíčová slova
chromosomové změny • maligní nádory • leukémie • molekulární cytogenetika • FISH
Klasická onkocytogenetika
Nádorová cytogenetika se zabývá studiem získaných chromosomových změn v buňkách benigních a maligních tumorů. Mitotické odchylky u nádorových buněk popsal Arnold v r. 1879 a první chromosomovou teorii vzniku nádorů vyslovil Boveri v roce 1914. Boveri předpokládal, že nádorové buňky pocházejí z původně normálních buněk tkáně a jejich abnormální chování je zakotveno uvnitř buňky a ne v jejím okolí. Podle této hypotézy jsou nádorové buňky defektní, protože ztratily vlastnosti normálních buněk, mají abnormální obsah chromatinu a každý nádor je založen jen jedinou buňkou. Nálezy získaných chromosomových odchylek u zhoubných nádorů v plném rozsahu Boveriho teorii potvrdily.
Vzhledem k tomu, že až do roku 1970, bylo používáno jen klasické, homogenní barvení chromosomů, byly u nádorů popisovány jen početní odchylky nebo velké přestavby chromosomů. Nejvýznam nější objev šedesátých let byl nález tzv. filadelfského chromosomu (Ph chromosom) Nowellem a Hungerfordem (1962) u nemocných s chronickou myeloidní leukémií (CML). Ph chromosom je stabilní marker, typický pro CML, a jeho objev stimuloval rozsáhlý cytogenetický výzkum nádorových buněk. Podpořil rovněž představu té doby, že každý typ nádoru bude mít svůj typický marker chromosom. Cytogenetické nálezy však tuto představu nepotvrdily, právě naopak, Ph chromosom zůstal déle než 15 let jediným příkladem specifické změny u nádorů. Teprve Rowleyová (1972) G-pruhovací technikou barvení zjistila, že Ph chromosom vzniká reciprokou translokaci mezi chromosomy 9 a 22(1). V dalších letech byly nalezeny další, specifické cytogenetické odchylky, které se staly důležitým diagnostickým kritériem při vyšetřování určitých typů leukémií, lymfomů a solidních nádorů. Hematoonkologická onemocnění byla mnohem častěji vyšetřovaná, a to vzhledem ke snadnějšímu odběru i zpracování buněk kostní dřeně a/nebo periferní krve pro cytogenetické analýzy.
Kromě pruhovacích barvících metod přispělo k dalšímu rychlému rozvoji nádorové cytogenetiky zavedení nových systémů kultivace a synchronizace buněčného dělení nádorových buněk in vitro. Výrazně se zlepšila kvalita chromosomových preparátů, a tím se i zvýšila citlivost cytogenetických metod. Důsledkem jsou nálezy dalších, dříve neidentifikovaných přestaveb, jako jsou translokace malých částí chromosomů, inverze, duplikace, delece a inzerce, z nichž mnohé se ukázaly být zcela specifickým markerem určitého typu nádoru.
===== Molekulární cytogenetika =====
S rozvojem metod molekulární biologie pak přichází aplikace nejnovějších technik rekombinantní DNA analýzy. V molekulární cytogenetice je to hybridizace in situ (HIS) nejdříve radioaktivně a posléze fluorochromy značených sond DNA, tzv. fluorescenční in situ hybridizace (FISH), která umožnila i studium buněk v interfázi. Analýza nádorových buněk a získaných změn chromosomů nejrůznějšími modifikacemi základní metody přináší stále nové informace o biologickém významu chromosomových změn v maligním procesu(2). Výzkum odchylek, zjištěných na úrovni rezoluce světelného mikroskopu, se tak dostává na úroveň molekulární a umožňuje další studium genových funkcí molekulárně biologickými metodami. Porucha nebo změna funkce genu bývá často spojena s patogenezí maligní buněčné transformace.
Hybridizace in situ
Metody hybridizace in situ (HIS) jsou postaveny na schopnosti vazby jednořetězcové DNA s komplementárními úseky cílové, opět jednořetězcové DNA.
Metoda FISH je v onkocytogenetice úspěšně využívána při:
studiu karyotypu buněk v metafázi nebo interfázi,
určování početních a strukturních chromosomových odchylek,
detekci minimální reziduální choroby nebo časného relapsu u leukémií,
detekci typu buněk, které jsou zahrnuty v neoplastickém procesu,
určení, zda se jedná o maligní proces, klonální evoluci nebo benigní proliferaci,
určení chromosomového vybavení jader v interfázi.
Princip metody: Zahříváním dvoušroubovicové molekuly DNA na vyšší teplotu (kolem 100°C) zanikají vodíkové vazby a vlákna DNA se od sebe oddělují (denaturace). Za mírnějších teplot nebo v přítomnosti labilizujících činidel (alkálie, formamid) může dojít k jen částečné denaturaci. Pokud se jednotlivá vlákna setkají se svými komplementárními partnery, mohou za příznivých podmínek (teplota, vlhkost, molarita) vytvořit zpětně dvojitou šroubovici DNA. Abychom zjistili místo na chromosomu, kam se sonda navázala, musíme provést detekci příslušnými metodami. Schéma metody FISH je na Obr. 1. Metody HIS a FISH byly úspěšně aplikovány na nejrůznější biologický materiál, tj. histologické řezy, tkáňové preparáty připravené z rozdílně zpracovaných kultivovaných i nekultivovaných buněk, izolovaná buněčná jádra a především na chromosomové preparáty.
Používané DNA sondy můžeme rozdělit do tří hlavních skupin a jsou schematicky znázorněny na Obr. 2A, B, C.
Sondy, které hybridizují se specifickými chromosomovými strukturami, což jsou obvykle centromerické oblasti obsahující alfa satelitní sekvence DNA.
Sondy, které hybridizují s jedinečnými sekvencemi DNA. Jsou to obvykle genomické klony, které se liší velikostí v závislosti na klonovacím vektoru. Podobné jsou i sondy telomerické, které označí telomerické oblasti všech lidských chromosomů. Rovněž existují i telomerické sondy pro jednotlivé autosomy. Používají se hlavně ve výzkumu strukturních přestaveb.
Sondy, které hybridizují s mnohočetnými chromosomovými sekvencemi. Tyto sondy jsou obvykle připraveny ze specifických knihoven DNA, lze jimi označit celý chromosom (tzv. whole chromosome painting probes WCP, neboli celochromosomové malovací sondy), nebo jsou získány mikrodisekcí určité části chromosomu, cíleně odebranou pod mikroskopem pomocí mikroma ni pulátoru z fixovaných preparátů a získaná DNA je pak dále amplifikovaná.
Signál navázané DNA sondy lze detekovat několika způsoby, které závisí na zvoleném způsobu značení. U radioaktivně značených sond používáme autoradiografii. U neradioaktivně značených sond, což je v současné době nejčastěji používaná modifikace in situ hybridizace, je využívána nepřímá imunofluorescence. U přímo značených sond je jejich detekce možná ve fluorescenčním mikroskopu použitím filtru odpovídající vlnové délky excitace. Pro obarvení chromosomů na preparátu (angl. counterstaining) používáme nejčastěji propidium jodid (červené chromosomy ve fluorescenčním mikroskopu) nebo 4,6-diamidino 2-phenylindol (tzv. DAPI), kterým se chromosomy barví modře s naznačenými světle a tmavě modrými podélnými pruhy.
Další možnost identifikace signálu přináší počítačová analýza obrazu mikroskopu vybaveného velmi výkonnou CCD (charge coupled device) kamerou, napojenou na počítač se speciálním programem pro FISH. Citlivost metody se zvyšuje o několik řádů. Obraz získaný na monitoru je kvalitnější než ten, který vidíme v mikroskopu, protože CCD kamera je pro zachycení signálu citlivější než lidské oko a počítačový program dovoluje úpravu obrazu ve smyslu zesílení signálu a potlačení nespecifického pozadí. Počítačová analýza obrazu umožňuje kvantitativní zpracování získaných dat, měření vzdáleností jednotlivých signálů a vytváření jednoho obrazu z více záznamů.
===== Mnohobarevná FISH (mFISH) a mnohobarevné pruhování (mBAND) =====
Kombinované značení několika různých sond různými hapteny zvyšuje počet cílových sekvencí, které mohou být současně detekovány a sledovány FISH technikou. Při sledování více než dvou různých signálů lze použitím epifluorescence, digitální kamery a počítačového programu pro pseudobarvení a slučování obrazů rozlišit detailně až sedm různých sond pomocí jen tří fluorochromů. Od r. 1996 je možné rozlišit barevně každý jednotlivý pár autosomů a pohlavní chromosomy. Metody spektrálního karyotypování jsou založeny na dvou zcela různých přístupech. Schrocková a kol. v roce 1996(3) vyvinuli speciální postup, při kterém používají interferometr a zvláště konstruovaný trojitý filtr, samozřejmě CCD kameru a příslušný počítačový program. Na preparát v jednom pokusu současně hybridizují směs malovacích celochromosomových sond pro všechny autosomy i heterochromosomy, které jsou označené pěti různými fluorochromy a jejich kombinacemi. Pro každý pixel se vytvoří interferogram, který je analyzován pomocí tzv. Fourierovy transformace, a tento výpočet umožňuje definovat příslušné světelné spektrum. Změřená spektra pak mohou být změněná ve zvolené barvy. Druhý přístup je založen na postupném použití 5 různých filtrů, kterými se postupně nahrávají přes CCD kameru do počítače barevná spektra různých homologních párů, opět simultánně hybridizovaných s malovacími sondami kombinatoriálně označenými různými fluorochromy(4). Pomocí počítačové analýzy je možné podle barevných spekter přiřadit chromosomovým párům skutečné barvy nebo pseudobarvy, a tak přiřadit různé barvy všem homologním párům. V jednom hybridizačním pokusu tak lze zjistit všechny chromosomové změny u komplexních přestaveb. Na Obr. 3 je mitóza nemocného s komplexním karyotypem zpracovaná po hybridizaci se směsí sond pro všechny autosomy a pohlavní chromosomy. Na podobném principu značení 5-fluorochromy je založena metoda mnohobarevného pruhování s vysokou rozlišovací schopností mBAND, kterou zavedla Chudoba(5). Na Obr. 4 jsou tři páry chromosomů 5 od tří různých pacientů s myelodysplastickým syndromem a s inter sticiální delecí na jednom z homologů. Rozsah delece bylo možno metodou mBAND zcela přesně identifikovat(6).
Komparativní genomová hybridizace (CGH)
Molekulární cytogenetická metoda, která umožňuje detekovat a mapovat relativní počet kopií jednotlivých sekvencí mezi různými genomy, se nazývá komparativní genomová hybridizace a byla popsána Kalloniemim(7). Normální a sledovaná DNA jsou označeny různě některými z haptenů a jsou simultáně ko-hybridizovány na preparát s normálními chromosomy v metafázi. Po detekci jsou oblasti zmnožení nebo ztráty DNA sekvencí jako jsou delece, duplikace nebo amplifikace viditelné na základě změn barvy homologů. Ta je způsobená změnou poměru intenzity signálu obou fluorochromů měřené podél normálních chromosomů, na které je směs obou označených DNA nahybridizovaná. Poměr intenzit signálů je zpracován nejméně u 10 mitóz a pomocí počítačového programu tak lze určit místa genomu, ve kterých je přítomna delece nebo amplifikace DNA. Schéma CGH je na Obr. 5.
CGH detekuje změny, které jsou přítomny ve velké většině nádorových buněk (tj. klonální aberace). Má vysokou vypovídací hodnotu pro komplexní změny karyotypu a pro lokalizaci marker chromosomů, amplifikaci genů ve formě tzv. double minutes a homogenně se barvících oblastí. CGH nelze využít u jednoduchých translokací, inverzí a inzercí, při kterých se nemění poměr počtu kopií sekvencí DNA.
===== Klinické aplikace nádorové cytogenetiky =====
Kromě hematologů a patologů, kteří využívají výsledky cytogenetického vyšetření při stanovení diagnózy řady maligních onemocnění, je sledování chromosomových odchylek nádorových buněk důležité i pro molekulární biology, kteří se zabývají studiem míst, ve kterých dochází ke zlomům a přestavbám chromosomů, delecím či amplifikacím jednotlivých genů. Důležité je i studium důsledků takových změn. Určité translokace u leukémií a solidních nádorů vedou k aktivaci protoonkogenů nebo, mnohem častěji, ke tvorbě specifických nádorových proteinů jako funkčních produktů nově vzniklých fúzovaných genů. Proteiny obou těchto kategorií jsou velmi často transkripční faktory, a tak přerušení kontroly transkripce hraje význačnou roli v etiologii nádoru Nádorová cytogenetika v těsné spolupráci s molekulární biologií ukázala základní význam chromosomových přestaveb v buňkách zhoubných nádorů.
Většina změn, které nacházíme v nádorových buňkách, je klonální. Podle mezinárodně uznávané definice považujeme za klonální změnu nález dvou mitóz se stejnou odchylkou ve smyslu chromosomové přestavby (translokace, inverze, inzerce, amplifikace) nebo stejným nadpočetným chromosomem, nebo tří mitóz ve kterých stejný chromosom chybí(10,11). Chromosomové změny v nádorových buňkách jsou získané a musíme je odlišovat od změn konstitučních, které jsou vrozené a ve většině případů ve všech buňkách těla.
Z přehledných nálezů u velkých skupin nemocných se stejným typem leukémie vyplývá, že abnormální karyotyp v buňkách kostní dřeně nacházíme jen u určitého procenta vyšetřených pacientů(12). U CML je to až 95 % případů s Ph chromosomem, u akutní myeloidní leukémie (AML) má patologický cytogenetický nález 60 až 70 % nemocných, u kterých lze najít specifické přestavby podle subtypu leukémie. U myelodysplastického syndromu (MDS) najdeme odchylku chromosomů u 60–70 % nemocných, opět podle subtypu MDS. U nemocných můžeme najít jednu změnu, nebo dvě či více strukturních nebo početních změn (komplexní změny karyotypu). V průběhu onemocnění, při progresi maligního procesu můžeme zachytit klonální vývoj, kdy k původní jednoduché změně přibývají změny další. V hematoonkologii využíváme specifické cytogenetické změny při stanovení nebo upřesnění diagnózy. Sledováním velkých souborů nemocných se stejnou odchylkou mají některé specifické přestavby i prediktivní hodnotu pro odezvu na léčbu a průběh onemocnění.
Vzorek tkáně, který používáme k cytogenetickému vyšetření, musí obsahovat neoplastické nebo potenciálně neoplastické buňky. U hematologických malignit to jsou buňky kostní dřeně, které lze poměrně jednoduše získat aspirací ze sterna, tzv. sternální punkcí. U některých onemocnění, jako je např. myelofibróza, nejrůznější typy anémií a jiné hematologické choroby, je však odběr kostní dřeně takřka nemožný a získané vzorky jsou chudé. Další možností je získat buňky z kostní biopsie. V případě, že je odběr kostní dřeně velmi obtížný, musíme přistoupit ke krátkodobým kultivacím periferní krve. Mnohem složitější, než je vyšetření buněk kostní dřeně, je získání reprezentativního vzorku nádorové tkáně pro cytogenetickou analýzu ze solidních tumorů. Úspěch tohoto složitého vyšetření je podmíněn spoluprací zainteresovaného chirurga a cytogenetika. Dalším náročným úkolem je příprava buněk ke kultivaci, příprava příslušných kultivačních systémů podle typu sledovaného nádoru a odhadnutí doby sklizně chromosomů. Vzhledem ke všem těmto technickým problémům byla až do nedávna hlavní pozornost onkocytogenetiků věnována hematologickým neoplaziím. V literatuře publikované výsledky zahrnovaly z více než tří čtvrtin sledování leukémií, i když mezi malignitami zaujímají solidní nádory téměř 90 %(12). Tento poměr se začíná v posledních letech měnit, právě díky vyřešení některých z výše uvedených technických potíží. Další rozvoj cytogenetiky solidních nádorů znamenalo zavedení metod molekulární genetiky a cytogenetiky, kdy k analýze stačí i menší množství dělících se, případně nedělících se buněk. Mezi onkocytogenetiky, kteří pracují ve výzkumu nádorových onemocnění, je v současné době hlavní pozornost upřena na solidní tumory.
Translokace, delece, amplifikace
Nádorová buňka se liší od normální tím, že se trvale a nekoordinovaně dělí, protože se vymkla signálům, které řídí její funkce. Maligní buněčnou transformaci můžeme definovat jako sérii progresívních genetických událostí, které se objevují v jednom buněčném klonu v limitovaném počtu specifických genů. Těmito geny mohou být onkogeny anebo recesívní onkogeny, které byly dříve nazývány nádorové supresorové geny (antionkogeny). Každá změna, ať už je spojena s iniciací, nebo progresem nádorového procesu, může být zprostředkována přestavbou chromosomů, a pokud je tato přestavba rozlišitelná na úrovni světelného mikroskopu, jsme schopni ji cytogeneticky detekovat. Paralelou této představy je, že molekulární charakteristika chromosomových přestaveb povede k identifikaci genů, jejichž úloha je při vzniku a postupu maligního procesu klíčová(13).
Buněčné onkogeny (protoonkogeny) jsou geny, které za normálních okolností nezpůsobují buněčnou maligní transformaci. V normální buňce kódují bílkoviny regulující normální růst buňky, a teprve jejich mutace či atypická aktivace vedou ke ztrátě kontroly růstu a k přeměně normální buňky na buňku nádorovou.
===== Translokace a inverze =====
Translokace a inverze jsou jednou z nejdůležitějších změn v karyotypu nádorových buněk. Schéma vzniku translokací je uvedeno na Obr. 6. Můžeme je rozdělit na specifické - to jsou ty, které se konzistentně vyskytují u určitých typů nádorů, a náhodné, idiopatické - to jsou jednotlivě se objevující změny u některého pacienta. Specifické translokace představují klonální nádorový marker. Zlomová místa některých specifických translokací již byla klonována a ze studia příslušných genů vyplynuly zásadní poznatky o jejich významu v onkogenezi(8). Existují dva principální důsledky translokací a inverzí. Při prvním typu translokace se zlom objeví uvnitř genu na každém ze zúčastněných chromosomů a vytvoří se fúzovaný gen kódující chimerický protein.Jako příklad lze uvést translokaci t(9;22) (q34;q11), která byla první objevená specifická translokace. Schéma uvádíme na Obr. 7. Při druhém typu translokací se gen pro T-buněčný receptor (TCR = T-cell receptor) nebo imunoglobulinový protein dostanou do blízkosti protoonkogenu, a tím jej aktivují. Schéma tohoto typu translokace je na Obr. 8 s vyznačením genů, které hrají důležitou roli při vzniku nádorů. Geny, které jsou zavzaty do translokací, často kódují transkripční faktory. Je to tedy změna v transkripci, která je pravděpodobně jedním ze základních faktorů onkogeneze. Některé specifické translokace u hematologických i solidních nádorů jsou uvedeny v Tab. 1, 2 a 3. Podrobné vysvětlení molekulárních mechanismů lze najít v literatuře(8 a 14).
Chromosomové delece
Translokace, inverze a inzerce ovlivňují geny v určité vzdálenosti od zlomových míst na chromosomech a mohou způsobit deregulaci normálních buněčných genů nebo vznik chimerických genů s onkogenním účinkem. Delece, stejně jako nereciproké přestavby, jsou spojeny se ztrátou částí chromosomů většího nebo menšího rozsahu(13). Schéma vzniku delece až monosomie je na Obr. 9.
Delece nacházíme především u solidních nádorů, ale vyskytují se i u hematologických malignit. Tři solidní nádory dětského věku - retinoblastom, Wilmsův tumor a neuroblastom - byly první, u kterých byly delece popsány a sledovány i na molekulární úrovni. Z těchto tří nádorů to byl zvláště retinoblastom, který je uváděn jako vzorový příklad tumoru se ztrátou nádorového supresorového genu. Nyní jsou nádorové supresorové geny (tzv. antionkogeny) nazývány recesívní onkogeny Stejně jako u onkogenů se jedná o normální buněčné geny, jejichž onkogenicita se projeví při jejich ztrátě, nikoliv při jejich aktivaci, jako je tomu u onkogenů. Rovněž jejich chování je rozdílné. Oproti dominantním onkogenům se nádorové supresorové geny chovají recesívně, a aby mohlo dojít k iniciaci nádorového procesu, jejich kopie na obou homologních chromosomech musí být inaktivovány. Stejně jako u onkogenů exis tuje řada mutačních mechanismů na submikroskopické úrovni, které vedou ke ztrátě konstituční heterozygosity prokazatelné na úrovni DNA. Ztráta celého genu, části chromosomu nebo celého chromosomu, prokazatelná cytogeneticky, může být jedním z mechanismů vedoucích k projevu účinku supresorových nádorových genů. O deleci v oblasti 5q31, která je nejznámější z delecí u hematologických onemocnění, podrobně pojednáme dále. U některých solidních nádorů (retinoblastom, Wilmsův tumor, neuroblastom) přispěla cytogenetika zásadním způsobem ke studiu a vysvětlení funkce specifických recesívních onkogenů, které byly přesně lokalizovány - např. delece del(13)(q14) u retinoblastomu, u Wilmsova tumoru delece del(11)(p13) a celá řada dalších. Do současnosti publikované případy se specifickými i nenáhodnými delecemi lze najít na internetové adrese httpwww.ncbi.nlm. nih.gov/CCAP.
Jako ukázku delece u maligních hematologických onemocnění uvádíme deleci dlouhých ramen chromosomu 5. Viz Obr. 4, 10a a 10b. Delece dlouhých ramen chromosomu 5 (del 5q) je častým nálezem u preleukémií, akutních myeloidních leukémií a myelodysplastického syndromu. Zvláště je častá u tzv. sekundárních leukémií, které vznikají po vystavení některým mutagenům. Celková délka chromosomu 5 je okolo 160 megabází (Mb). Delece na dlouhých ramenech je intersticiální a podle rozsahu při ní dochází ke ztrátě 16-40 Mb. V této oblasti je zmapováno více než 30 genů a kromě toho je zde známo a lokalizováno 60 anonymních DNA segmentů. Kritická oblast, která chybí u všech nemocných při jakémkoliv rozsahu delece, je pruh 5q31, a proto předpokládáme, že jde o lokus, který má význam pro patogenezi onemocnění MDS anebo AML. Cytogenetické a molekulárně genetické analýzy poskytují velmi variabilní nálezy s ohledem na rozsah delece.
Molekulární podstata del 5q není zatím dostatečně vysvětlena, neznáme nádorový supresorový gen, který je zodpovědný za maligní transformaci, ale předpokládáme, že je v této oblasti lokalizován. Výzkum oblasti 5q31 přinesl pro klinickou diagnostiku nové DNA sondy.
Amplifikace chromosomů
Duplikace celých chromosomů nebo jejich částí je velmi častou změnou v nádorových buňkách. Schematické znázornění této chromosomové přestavby je na Obr. 11. Amplifikace chromosomového materiálu, i když se může zdát v mikroskopu poměrně malá, ovlivňuje stovky až tisíce genů. Jedním z uvažovaných mechanismů, které vedou k progresi nádoru, je zvýšená genová dávka (dosage effect), která způsobí nepoměr mezi genovými produkty při několika nadbytečných kopiích genů.
U maligního hematologického onemocnění je získání nadpočetného celého chromosomu nebo jeho části obvykle svědectvím o postupu nádorového procesu. Jako příklad můžeme uvést klonální vývoj u CML, kdy při přechodu z chronické do blastické fáze dochází k poměrně uniformnímu klonálnímu vývoji. Může se objevit trisomie 8, izochromosom 17q, další Ph chromosom, který nevzniká novou translokací, ale mitotickou nondisjunkcí (10).
Dále u zhoubných nádorů můžeme nalézt dvě chromosomové změny, které vždy potvrzují diagnózu maligního onemocnění v pokročilém stadiu. Jsou to mikroskopicky detekovatelné malé částice bez centromery, které se nazývají double minutes (DMs) a vznikají rozpadem tzv. homogenně se barvících oblastí - homogenously staining regions (HSR). Podle původních předpokladů byl výskyt těchto částic dáván do spojitosti s geny ovlivňujícími rezistenci na chemoterapii. Bylo to také proto, že HSR a DMs bylo možné identifikovat jen ve velmi pokročilých nádorech. Pozdějšími studiemi bylo zjištěno, že je tvoří amplifikované geny, nejspíše onkogeny, a že HSR často obsahují i několik tisíc genových kopii, které pak mají tendenci se rozpadat v DMs. Jejich počet kolísá a nikdy nejsou současně v jedné mitóze pozorovatelné DMs a HSR. Bylo prokázáno, že se jedná o amplifikované onkogeny(10). Např. u neuroblastomu jde o amplifikovaný onkogen NMYC, u akutních leukémií a solidních nádorů jde velmi často o amplifikaci CMYC. Elegantní detekce amplifikace vybraných onkogenů se provádí i metodou FISH na cytogenetických nebo histologických preparátech.
Nové trendy a nové projekty
V Národním ústavu pro výzkum rakoviny v USA (National Cancer Institute – NCI) byl započat projekt, který se nazývá Cancer Chromosome Aberration Project (CCAP), má za úkol připravit fyzikální a genetické mapy lidského genomu založené na cytogenetických datech zjištěných při sledování chromosomových přestaveb v buňkách zhoubných nádorů člověka. Cíle bude dosaženo mapováním genů, které byly lokalizovány v lidském genomu na základě lokalizace pomocí metody fluorescenční in situ hybridizace (FISH) s klony bakteriálních umělých chromosomů (BAC) umístěných ve vzdálenostech 1–2 Mb po celé délce lidského genomu. Mapa bude volně přístupná a bude dobře srovnatelná s dalšími genomovými databázemi, jako např. s odchylkami uváděnými v Katalogu chromosomových aberací prof. Mitelmana, který je volně přístupný na internetové adrese http://cgap.nci.nih.gov/ Chromosomes/Mitelman/recurrent/aberrations. Výsledky tohoto projektu umožní mapování zlomových míst na chromosomech, které přímo souvisí se vznikem maligního procesu u hematologických nebo solidních nádorů. Předpokládá se, že lokalizace přibližně 3000 CCAP BAC sond umožní přípravu DNA čipů pro tzv. matrix komparativní genomovou hybridizaci, kterými bude možné lokalizovat geny, důležité v kancerogenezi(15,16). Dalším produktem by pak mohly být sondy DNA, které by byly důležitým pomocníkem diagnostiky v interfázické cytogenetice při určování chromosomových aberací na cytologických a histologických preparátech. Bližší údaje může zájemce získat na internetové adrese httpwww.ncbi.nlm.nih.gov/CCAP.
Od r. 1970, kdy se začaly chromosomy barvit pruhovacími technikami, bylo u nádorů popsáno více než 1800 zlomových míst na chromosomech. Jde o chromosomové změny, které se opakují a nejsou náhodné. Dá se proto předpokládat, že jsou zahrnuty v procesu iniciace nádorového bujení i v progresi onemocnění. Počet zjištěných chromosomových odchylek u malignit narůstá takovou měrou, že není možné si je dále pamatovat, zvláště s ohledem na jejich klinické a biologické charakteristiky. Proto vznikl Atlas genetiky a cytogenetiky v onkologii a hematologii (http://www.infobiogen.fr/services/chromcancer) jako další volně přístupná databáze na internetu, která přináší cytogenetické a klinické nálezy u maligních onemocnění a je připravená pro volné použití cytogenetiky, molekulárními genetiky a lékaři ve všech lékařských odvětvích, která jsou zainteresována v onkologii. Popis a užití této databáze přináší publikace Hureta a kol.(17).
Molekulární cytogenetika spolu se všemi modifikacemi metod FISH, u solidních nádorů především komparativní genomová hybridizace (CGH), přinesla zvláště u solidních tumorů mnoho nových poznatků o delecích a amplifikacích genů nebo částí chromosomů. Malovacími celochromosomovými sondami pak byly identifikovány dosud neznámé translokace. Všechny cytogenetické screeningové metody jsou limitovány citlivostí, která je udávána okolo 2–10 Mb(16). I při tak nízké senzitivitě byla pomocí cytogenetiků vytipována neuvěřitelná řada míst zlomů na chromosomech, která pak byly dále molekulárně-biologickými metodami klonována. Dále byly připraveny sondy DNA, které jsou jednak důležité při diagnostice zhoubných nádorů, ale jsou využívány i ve výzkumu při integraci cytogenetických map do fyzikálních map lidského genomu.
Takováto integrace spolu s informacemi, které poskytují různé databáze chromosomových změn u hematologických malignit a u solidních nádorů ve formě translokací a inverzí a s nimi souvisejících zlomových míst na chromosomech, případně změn v počtu genových kopií, zvyšuje význam existujících poznatků.
První dva chromosomy, jejichž BAC klony byly zmapovány, byly autosomy 7 a 22. Byly připraveny bakteriální umělé chromosomy o délce přibližně 1–2 Mb, které pak po klonování byly metodami dvojbarevné FISH s vysokou rozlišovací schopností zmapovány na chromosomech buněk v prometafázi a metafázi.
Konvenční CGH analýza využívá jako cíl pro hybridizaci připravený preparát s chromosomy buněk v metafázi. Snaha o zvýšení citlivosti cytogenetických metod vedla k vývoji nové koncepce metody tzv. matrix CGH, u které jsou chromosomy nahrazeny imobilizovanými DNA fragmenty umístěnými na pevném, nejčastěji skleněném podkladu (Lichter a spol. 2000). Předpokládáme, že matrix CGH bude stále více pronikat do diagnostiky zhoubných nádorů.
Zcela kritickým problémem zůstává integrace cytogenetických a fyzikálních map, jak již bylo uvedeno výše. Smysluplná integrace musí splňovat následující požadavky:
1. Přímý vztah mezi známými a nově popsanými zlomovými místy nebo oblastmi s nevyváženou genovou výbavou se sadou BAC klonů.
2. Přímý přehled opakujících se zlomových míst, které odpovídají s lokalizací BAC klonů.
3. Umístění zmapovaných BAC klonů na sekvence lidského genomu.
4. Integrace sady BAC klonů s databází pro CGH a další molekulárně-cytogenetické metody (spektrální karyotypování – SKY, mnohobarevná fluorescence – mFISH).
5. Srovnání chromosomových aberací nalezených u lidských neoplazií s odpovídajícími experimentálními modely, jako jsou např. nádory vyvolané u myší.
Závěr
Vstoupili jsme do období, kdy se osvětluje molekulární podstata vzniku maligních nádorů. Při iniciaci neoplazií jde o postupné nahromadění mnoha různých genetických změn v jedné buňce, cytogenetická přestavba je jednou z nich. Zatímco je zřejmé, že žádná jednotlivá změna nemůže stačit ke vzniku nádoru, většina těchto změn a jejich počet, které jsou nutné k přestavbě normální buňky v buňku nádorovou, ještě nejsou zcela objasněny. Proto specifické souhrny genetických změn spojených s alterovanou expresí a genovou produkcí pomáhají pochopit pravidla kancerogeneze.
1. ROWLEY, JD. The Philadelphia chromosome translocation: A paradigm for understanding leukemia. Cancer, 1990, 65, p. 2178-2184.
2. LEBEAU, MM. Fluorescence in situ hybridization in cancer diagnosis. Advances in Oncology Philadelphia : J. B. Lippincott, 1993, p. 29-45.
3. SCHROCK, E., DUMANOIR, S., VELDMAN, T., et al. Multicolor spectral karyotyping of human chromosomes. Science, 1996, 273, p. 494-497.
4. SPEICHER, M., BALLARD, SG., WARD, DS. Karyotyping human chromosomes by combinatorial multi-fluor FISH. Nature Genet, 1996, 12, p. 368-375.
5. CHUDOBA, I., PLESCH, A., LORCH, T., et al. High resolution multicolor-banding: a new technique for refined FISH analysis of human chromosomes. Cytogenet Cell Genet, 1999, 84, p. 156-160.
6. MICHALOVÁ, K., ZEMANOVÁ, Z., BŘEZINOVÁ, J. Multicolor Fluorescence in situ Hybridizace (mFISH). Čas Lék Čes, 2001, 140, p. 99-103.
7. KALLIONIEMI, A., KALLIONIEMI, OP., SUDAR, D., et al. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetics analysis of solid tumors. Science, 1992, 258, p. 818-821.
8. RABBITS, TH. Chromosomal translocations in human cancer. Nature, 1994, p. 143-149.
9. HARTWELL, LH., KASTAN, MB. Cell cycle control and cancer. Science, 1994, 266, p.1821-1828.
10. HEIM, S., MITELMAN, F. Cancer cytogenetics. New York : Wiley-Liss., 1995, 535 p.
11. ISCN 1995: An International System for Human Cytogenetic Nomenclature (1995), MITELMAN, F. (Ed.), Basel : S. Karger, 1995.
12. MITELMAN, F. Catalogue of chromosomal aberrations in cancer. 5th ed., 1995, Wiley Liss, 4252 p.
13. BISHOP, M. The molecular genetics of the cancer. Science, 1987, 235, p. 305-311.
14. MAYER, J., STARÝ, J., a kol. Leukemie. 1. vydání, Praha : Grada Publishing, 2002, 342 s.
15. KIRSCH, IR., RIED,T. Integration of cytogenetic data with genome maps and available probes: Present status and future promises. Seminars in Hematology, 2000, 37, p. 420-428.
16. LICHTER, P., JOOS, S., BENTZ, M., et al. Comparative genomic hybridization: Uses and limitations. Seminars in Hematology, 2000, 37, p. 348-357.
17. HURET, JL., DESSEN, P., LE MINOR, S., et al. The Atlas of Genetics and Cytogenetics in Oncology and Hematology on the internet and the review on infant leukemias. Cancer Genet Cytogenet, 2000, 120, p. 155-159.
Obrazová dokumentace: RNDr. Zuzana Zemanová, CSc.
e-mail: bioch@lf1.cuni.cz
**