MUDr. Barbora Dvořánková, MUDr. Ludomír Brož, MUDr. Igor Pafčuga, MUDr. Robert Zajíček
Univerzita Karlova v Praze, 3. LF a FNKV, Klinika popáleninové medicíny
Obr. 1 – Vepřový dermoepidermální štěp (xenotransplantát) o rozměrech 30x 7 cm je po lavážích rozprostřen na vlhký mul dermální stranou vzhůru
Obr. 2 – Xenotransplantáty jsou připravovány ve třech různých formách. Čerstvý štěp je uložen v Petriho misce, zmrazený štěp se uchovává v hliníkové nádobce a glycerolovaný v plastikové kyvetě.
Jestliže hovoříme o problematice léčby kožních ztrát, musíme přísně rozlišovat pojmy trvalé a dočasné krytí ranné plochy. Trvalého uzávěru ranné plochy je možné dosáhnout spontánní epitelizací, autotransplantací nebo použitím trvalých kožních náhrad, zejména kultivovaných autologních keratinocytů. Ve všech ostatních případech se jedná o krytí dočasné. Mezi nejúčinnější dočasné kryty patří kryty biologické. První zmínku o nich nacházíme již ve starých egyptských papyrech, v 19. století vyvinul francouzský lékař J. L. Revendin metodiku autoa později i alotransplantace. Rozvoj medicíny zejména ve druhé polovině dvacátého století umožnil přežívání pacientů i s rozsáhlým popáleninovým traumatem, tím vyvolal zvýšenou potřebu dočasných biologických krytů. Vzhledem k tomu, že zdroje kadaverózních alotransplantátů byly omezené, byly hledány nové možnosti biologických krytů, zejména v oblasti xenotransplantátů. MUDr. Moserová se svými spolupracovníky (MUDr. Koníčková, MUDr. Böhm) vyvinula v sedmdesátých letech metodiku odběru a později i uchovávání vepřových xenotransplantátů(1). Podle našich současných znalostí řadíme mezi biologické kryty nejen alogenní a xenogenní kožní štěpy, plodové blány, kultivované epidermální štěpy, ale též všechny materiály, které adherují ke spodině rány a stimulují její hojení (např. různé kolagenové houby)(2). Přípravou výše uvedených krytů se zabývají kožní banky.
Kožní banka ve Fakultní Nemocnici Královské Vinohrady zahájila svoji činnost v roce 1986 pod vedením MUDr. Vogtové na Klinice plastické chirurgie, po vytvoření samostatné Kliniky popáleninové medicíny v roce 1991 přešla do její působnosti. V současné době se zabývá zejména odběrem a přípravou vepřových xenotransplantátů, které mají následující výhody:
– na ranné ploše tvoří bariéru proti infekci,
– zabraňují vysychání plochy,
– podporují spontánní epitelizaci z hlubokých dermálních struktur,
– lehce se přikládají na rannou plochu a dobře kopírují povrch těla,
– jsou dobře dosažitelné (co se týče jejich množství a ceny).
Zdrojem xenotransplantátů jsou čerstvé, nespařené, veterinárně kontrolované jateční krupony (hřbetní část kůže prasete zasahující do boků). Z nich jsou po dokonalém umytí a oholení odebírány za sterilních podmínek jemné dermoepidermální štěpy o síle 0,2 až 0,3 mm a rozměrech cca 30x 7 cm. Ty následně projdou laváží chemoterapeutika furantoinu a antibiotik gentamicinu a chloramfenikolu (Obr. 1). Tyto látky bezpečně pokryjí mikrobiální osídlení kůže běžného jatečního zvířete. Po výše uvedených lavážích je sterilita štěpů ověřena testováním v mikrobiologické laboratoři a teprve na základě negativního výsledku mohou být použity k léčbě pacienta. Jak už sám název napovídá, kožní banka by měla být trvalou zásobárnou krytů. Z tohoto důvodu je velmi důležitá i problematika vhodného uchovávání kožních štěpů. V současné době jsou xenotransplantáty připravovány ve třech různých formách (Obr. 2).
Čerstvé xenotransplantáty jsou ve formě smotku na navlhčeném mulu uloženy do sterilní Petriho misky. Jsou skladovány v lednici při 4–6 °C maximálně po dobu deseti dnů, kdy je zaručena jak jejich sterilita, tak i jejich viabilita. Jsou tedy určeny ke krátkodobé spotřebě, ale vzhledem k obratu těchto krytů na naší klinice tvoří přibližně 90 % naší produkce.
Zmrazené xenotransplantáty jsou skladovány v hliníkových nádobkách, které jsou naplněny kryoprotektivním mediem. Jedná se o pufrovaný Ringerův roztok, který obsahuje 15 % glycerolu. Právě ten zmrazovanou tkáň částečně odvodní, a tím chrání buňky před popraskáním v průběhu zmrazování. Štěpy jsou uloženy v parách kapalného dusíku (teplota minus 190 °C), kde mohou být takto skladovány i několik let. Po rozmrazení jsou ze štěpů odstraněny zbytky glycerolu opakovaným vymýváním Ringerovým roztokem. I přes to, že je proces zmrazování a rozmrazování optimalizován, uchovávají si tyto xenotransplantáty pouze 50–70 % viability čerstvého štěpu, a musí být proto použity v průběhu 24 hodin. Tyto hodnoty byly získány měřením spotřeby glukózy a produkce laktátu příslušnou tkání.
Stále více, zejména s výskytem HIV a zvířecích retrovirů, je diskutována otázka bezpečnosti použití nativních biologických tkání k léčbě pacientů. Jsou hledány nové možnosti ošetření tkání tak, aby bylo sníženo riziko přenosu nákazy na minimum. Euro Skin Bank, největší evropský producent alotransplantátů sídlící v Holandsku, připravuje glycerolované kožní štěpy již od začátku devadesátých let(3, 4) a vyprodukuje jich tímto způsobem více než 100 m2 ročně. Konzervace kožních štěpů glycerolem je považována za nejbezpečnější postup z hlediska možného přenosu infekce, nevýhodou však je, že při tomto postupu dochází ke zničení všech živých elementů v tkáni. Výsledkem je pak neviabilní biologický kryt. Od počátku roku 2002 jsme začali s produkcí glycerolovaných xenotransplantátů i v naší kožní bance. V tomto případě jsou vepřové kožní štěpy postupně převedeny do 85% glycerolu (50%, 75%, 85% glycerolu), ve kterém jsou též při teplotě 4 °C uloženy. Výhodou je dlouhá doba použitelnosti, neboť takto mohou být skladovány až 5 let. Další předností glycerolovaných xenotransplantátů je i rychlost přípravy před vlastní aplikací. Přímo na operačním sále je potřeba tyto štěpy 15 min vyprat v teplém fyziologickém roztoku a mohou být ihned přiloženy na rannou plochu. Eventuální zbytky glycerolu v tkáni působí v průběhu hojení defektu antibakteriálně. V letošním roce bylo na naší klinice použito k léčbě pacientů již 450 těchto štěpů, což představuje plochu 9 m2, a výsledky léčby jsou srovnatelné s užitím jiných druhů xenotransplantátů.
Xenotransplantáty lze s výhodou použít zejména k léčbě popálenin II. stupně, kde vytvářejí vhodné mikroklima pro samovolnou epitelizaci ranné plochy a snižují pocit bolesti u pacienta (Obr. 3, 4). Dále jsou aplikovány do nářezů u popálenin III. stupně, na plochy po nekrektomiích nebo po traumatických ztrátách kožního krytu, kde nativní kolagen v jejich dermální části omezuje difúzní krvácení z plochy a současně podporuje tvorbu granulační tkáně. Xenotransplantáty současně slouží v těchto případech jako jakési „testovací štěpy“ před vlastní autotransplantací. Poslední indikací je tzv. „smíšená autotransplantace“, kdy jsou síťované autotransplantáty kryty xenotransplantáty. Tento postup je využíván zejména u rozsáhle popálených pacientů, kde jsou z důvodů nedostatku odběrových ploch využívány široce síťované autotransplantáty, či u pacientů, u kterých lze očekávat problémy s hojením. Produkce xenotransplantátů od počátečních 4000 štěpů v roce 1986 stále stoupá, v letech 2001, 2002 dosáhla počtu 12 000, tedy 240 m2. Více než 90 % naší produkce je využito na Klinice popáleninové medicíny, zbylé štěpy slouží odběratelům z chirurgických a plasticko-chirurgických pracovišť po celých Čechách.
Xenotransplantáty ani alotransplantáty však nemohou vyřešit trvalé krytí kožních ztrát. Omezené množství odběrových ploch u rozsáhle (plochou i hloubkou) popálených pacientů však brání časnému trvalému krytí ranných ploch, a tím i účinnému postupu léčby. Byla vyvinuta řada expanzních metodik, které umožňují pokrýt podstatně větší rannou plochu, než je velikost odebraného kožního štěpu. Jedná se například o síťování autotransplantátů, smíšenou transplantaci nebo sazenicovou metodu. Metodou s maximální plošnou expanzí (1000 –10 000krát) je kultivace epidermálních štěpů. Kultivované štěpy byly poprvé použity v klinické praxi v roce 1981 v Bostonu v USA. Právě díky nim byli zachráněni dva malí chlapci, popálení na 90 % povrchu těla. Myšlenka kultivace epidermis, tedy pomnožení kožních buněk – keratinocytů in vitro – vznikla již koncem devatenáctého století. Prvním krokem v jejím vývoji bylo dlouhodobé uchování kůže ve vhodném prostředí (ascitické tekutině) a její návrat dárci. Počátkem minulého století bylo dokázáno, že jsou-li kožní fragmenty umístěny na vhodný kultivační podklad ve vhodném mediu, dochází k rozrůstání epiteliálních i pojivových buněk – keratinocytů i fibroblastů(5). Jako první byly prováděny transplantace epidermálních buněk ve formě suspenze(6). I v pražském popáleninovém centru se používala tzv. metoda homo-homo, při níž byl homogenát autoepitelu aplikován na rannou plochu pod alotransplantát. K růstu keratinocytů z buněčné suspenze tak docházelo přímo na ranné ploše. Teprve koncem sedmdesátých let byl vývoj metodiky kultivace epidermálních štěpů úspěšně završen Rheinwaldem a Greenem(7). Epidermis se tak stala prvním lidským orgánem či jeho částí, který byl připraven v laboratorních podmínkách. Kultivační laboratoř na Klinice popáleninové medicíny vznikla již v roce 1990 ve spolupráci s pracovníky Ústavu molekulární genetiky AV ČR jako součást kožní banky. Tato laboratoř se zabývá přípravou autologních i alogenních epidermálních štěpů pro léčbu rozsáhle popálených pacientů či pacientů s trofickými a zbytkovými defekty. K přípravě epidermálních štěpů o ploše řádově tisíců centimetrů čtverečných stačí jemný dermoepidermální štěp velikosti 3–4 cm2. Tento štěp je enzymaticky rozvolněn na dermis a epidermis, ze které je získána suspenze keratinocytů. Keratinocyty jsou kultivovány v přítomnosti podpůrných buněk (feederu), které zlepšují jak adhezi keratinocytů ke dnu kultivační nádoby, tak svými metabolity podporují i jejich buněčné dělení. Jako feeder slouží subkonfluentní porost myších fibroblastů, u kterých je zastavena schopnost proliferace, a to buď pomocí gamazáření nebo cytostatika mitomycinu C. Během svého růstu keratinocyty ničí porost podpůrných buněk, za 10 až 14 dní dosáhnou konfluence. Opakováním tohoto kroku získáme požadovanou plochu epidermálních štěpů. V konečné fázi je souvislý několikavrstevný porost keratinocytů odvolněn jako štěp pomocí enzymu proteázy ode dna kultivační nádoby a uchycený na textilním nosiči (Obr. 5) je aplikován na rannou plochu pacienta. Kultivovaný epitel byl použit v léčbě několika desítek pacientů, a to od ploch o rozsahu několika cm2 až po aplikaci několika tisíc cm2 jednotlivým rozsáhle popáleným.
K léčbě kožních ztrát využíváme jak autologní, tak alogenní kultivovaný epitel. Při použití autologních kultivovaných štěpů je pacient zatížen odběrem kožního vzorku, který však lze provést i v lokální anestézii a příprava štěpů trvá přibližně 3 týdny. Autologní keratinocyty jsou schopny vytvořit definitivní kryt na plochách, které se nemohou samovolně zhojit a využívají se tedy především při léčbě rozsáhlých popálenin III. stupně(8, 9). Alogenní kultivované štěpy stimulují samovolné hojení, neboť kultivované keratinocyty produkují jak různé růstové faktory, tak i interleukiny, které působí příznivě na rannou plochu. Využívají se při hojení ploch, kde jsou zachovány v dermálních strukturách zbytky autologních keratinocytů, např. k léčbě popálenin II. stupně, odběrových ploch či bércových vředů. Zdrojem alogenních keratinocytů je zbytková kůže při plastických operacích otestovaných osob a vzhledem k možnosti vytvoření zásoby zamrazených buněk, je příprava štěpů časově méně náročná (10–14 dní). Zmrazené kultivované epidermální štěpy v naší laboratoři nepoužíváme, neboť i při dodržení optimálního procesu zmrazení a rozmrazení je jejich viabilita, a tím i účinnost pro léčbu, výrazně nižší než u štěpů čerstvých.
Kultivované epidermální štěpy byly aplikovány na různé druhy ploch a nejlepších klinických výsledků bylo dosaženo zejména při kombinaci autologního kultivátu s široce síťovaným autotransplantátem (Obr. 7). Zejména u rozsáhle popálených pacientů přináší tato metodika výrazné urychlení hojení, neboť umožňuje transplantovat najednou větší plochy a zlepšení kvality vytvořeného krytu, a to jak funkční, tak kosmetické. Často využíváme kultivovaného epitelu při léčbě odběrových ploch u těžce popálených pacientů nebo rozsáhlých popálenin II. stupně. Ve spolupráci s diabetologií II. interní kliniky FNKV se snažíme podpořit léčbu trofických defektů u diabetiků pomocí kultivovaných keratinocytů.
V kultivační laboratoři se provádí rozsáhlá výzkumná činnost, která se týká celého procesu hojení ran. V současné době je tato laboratoř součástí Centra buněčné terapie a tkáňových náhrad a spolupracuje s mnoha dalšími institucemi.
Literatura
1. MOSEROVÁ, J., HOUŠKOVÁ, E. The healing and treatment of skin defects. 1. vydání, Basel : Karger AG, 1989.
2. HANSBROUGH, JF., ZAPATA-SIRVENT, RL., PETERSON, VN. Immunomodulation following burn injury. Surg Clin N Amer, 1987, 67, p. 69–92.
3. VAN BAARE, J., LIGTVOET, EEJ., MIDDELKOOP, E. Microbiological evaluation of glycerolized cadaveric donor sites. Transplantation, 1998, 65, no. 7, p. 966-970.
4. HORCH, RE., CORBEI, O., FORMANEK-CORBEI, B., et al. Reconstitution of Basement Membrane after „Sandwich-Technique“ Skin Grafting for Severe Burns Demonstrated by Immunohistochemistry. J Burn Care and Rehab, 1998, 19, no. 3, p. 189–202.
5. CARRE, A., BURROWS, MT. Cultivation of adult tissues and organs outside the body. JAMA, 1910, 55, p. 1379.
6. MOSCONA, A. Rotation-mediatedhistogenic aggregation of dissociated cells. Exp Cell Res, 1961, 22, p. 455.
7. GREEN, H., KEHINDE, O., THOMAS, J. Growth of cultured human epidermal cells into multiple epithelia suitable for grafting. Proc Natl Acad Sci, 1979, 76, no. 11 p. 5665–5668.
8. COMPTON, CC., GILL, JM., BRADFORD, DA., et al. Skin Regenerated from Cultured Epithelial Autografts on Full-Thickness Burn Wounds from 6 Days to 5 Years after Grafting. Laboratory Investigation, 1989, 60, no. 5, p. 600–612.
9. DVOŘÁNKOVÁ, B., SMETANA, K., KÖNIGOVÁ, R., et al. Cultivation and grafting of human keratinocytes on a poly(2-hydroxyethyl methacrylate) support to the wound bed: a clinical study. Biomaterials, 1998, 19, p.141-146.
e-mail: dvoranko@fnkv.cz
Obr. 3 – Popálená plocha IIa stupně na vnější straně stehna krytá glycerolovaným xenotransplantátem
Obr. 4 – Zhojená plocha po 4 aplikacích xenotransplantátů; délka léčby 12 dní
Obr. 5 – Kultivovaný epidermální štěp uchycený na textilním nosiči je přenášen na rannou plochu pacienta
Obr. 6 – Kultivované epidermální štěpy na textilním nosiči byly použity v kombinaci se široce síťovanými autotransplantáty k léčbě popálenin III. stupně na hrudníku rozsáhle popáleného pacienta
Obr. 7 – Zhojená plocha na hrudníku 2 měsíce po transplantaci