1Doc. MUDr. Milan Macek Jr., DrSc., 2doc. MUDr. Věra Vávrová, DrSc. ,
1 Univerzita Karlova v Praze, 2. LF a FN Motol, Ústav biologie a lékařské genetiky, Centrum cystické fibrózy
2 Univerzita Karlova v Praze, 2. LF a FN Motol, 2. dětská klinika, Centrum cystické fibrózy
Klíčová slova
cystická fibróza • gen CFTR • molekulárně genetická diagnostika • incidence
===== Epidemiologická a klinická charakteristika =====
Incidence
Cystická fibróza (CF) je nejčastější autosomálně recesívní, monogenní onemocnění u evropských populací s incidencí přibližně 1 na 2500 až 3000 novorozenců(1). V České republice incidence CF byla objektivně stanovena epidemiologickými a molekulárně genetickými metodami na 1 : 2736 novorozenců. Z takto relativně vysoké incidence vyplývá, že každý 26. jedinec je zdravým nosičem tohoto závažného onemocnění(2, 3).
===== Klinické projevy =====
Typickým klinickým projevem CF je život ohrožující chronické, obstrukční, sino-pulmonální onemocnění, která je způsobeno přítomností hustého hlenu v dýchacích cestách. Chronická infekce bakteriálními kmeny Pseudomonas aeruginosa, Staphy lo coccus aureus, Burkholderia cepacia, včetně plísní, jako je například Aspergillus fumigatus, vede k bronchiektáziím a následnému respiračnímu selhání. U většiny případů je pankreatická exokrinní funkce porušená již prenatálně a způsobuje po narození steatoreu a poruchu vstřebávání živin spojenou s následným neprospíváním (tzv. pankreatická insuficience). Neonatální mekoniový ileus se u CF vyskytuje u 10–20 % novorozenců a je často prvním klinickým příznakem této choroby. Další klinické příznaky zahrnují diabetes mellitus (CFRDM; CF-related diabetes mellitus) a mužskou neplodnost danou vrozenou neprůchodností chámovodů (CBAVD – congenital bilateral absence of vas deferens). Pacienti s CF však mají zcela normální inteligenci. Blíže jsou klinické projevy uvedeny v přehledných publikacích z poslední doby(1, 2, 4).
Projevy CF a jejich závažnost jsou u různých pacientů odlišné. Z těchto důvodů rozlišujeme typickou (nebo také „klasickou“) a atypickou formu CF. Postižení jedinci s typickou formou mají dýchací a trávicí obtíže, hladiny chloridů v potu jsou signifikantně zvýšeny, a to nad 60 mmol/L. Pacienti s atypickou formou mají většinou hraniční (30–60 mmol/L) až diagnosticky zvýšené hladiny chloridů v potu. Jejich obtíže jsou podmíněny buď jen postižením plic, nebo slinivky břišní. Někteří trpí pouze opakovanými záněty vedlejších nosních dutin s nosními polypy. U některých dospělých mužů se CF projeví těžkou poruchou plodnosti, chloridy v potu jsou na hranici normy či lehce zvýšené. U atypické formy nelze definitivně vyloučit, že se s postupujícím věkem obtíže nerozvinou v typickou formu CF. Z tohoto důvodu je nezbytné pacienty s atypickou formou CF dlouhodobě dispenzarizovat. Konečně existují i tzv. monosymptomatické formy CF, kde dominantním klinickým znakem je pouze jediný příznak klasické formy CF, jako například chronická pankreatitida nebo obstrukční azoospermie(1, 2).
Diagnóza CF
Diagnóza CF se stanovuje podle typických klinických projevů zahrnujících chronickou obstrukční plicní chorobu, opakované bakteriální infekce (převážně mukoidními kmeny baktérie Pseudomonas), mekoniový ileus, pankreatickou insuficienci spojenou s poruchami prospívání a často i na základě postižení jiného člena rodiny. Klinická diagnóza CF musí být potvrzena zvýšenou koncentrací chloridů v potu (průměrné hodnoty přes 60 mmol/L) nebo přítomností „patologických“ mutací CFTR genu na obou chromosomech u probanda(1, 2, 4). Tato vyšetření, a především pak potní test, by se měla provádět na specializovaném pracovišti, které má dostatečné zkušenosti s jejich prováděním.
Novorozeneckou depistáž („screening“) CF je možno provádět ze suché kapky krve (Guthrieho testu) průkazem a kvantifikací imunoreaktivního trypsinu (IRT test) a/nebo častých mutací genu CF. Tento typ hromadného vyšetřování CF se dosud výrazně nerozšířil pro svou nákladnost, organizační náročnost a časté případy falešně negativních výsledků. Z genetického hlediska je populační screening možný pouze při charakteristice více než 95 % všech mutací genu CF v dané populaci. Prozatím byla ověřena možnost tzv. „cílené depistáže“ v rodinách s postiženým dítětem nebo vyšetřením těhotných žen na nejčastější mutaci genu CF – alely F508del. Toto je však možné pouze v zemích s vysokým podílem této mutace, jako např. v Dánsku(5).
===== Léčba CF =====
V současnosti je CF na celém světě onemocnění léčitelné, ale ne zcela vyléčitelné ad integrum. Cílem nejmodernější léčby je proto především zmenšení obtíží, které s sebou toto celoživotní onemocnění přináší a zlepšení kvality života postižených jedinců. Infekci dýchacích cest je třeba léčit intenzívně antibiotiky a hlen v dýchacích cestách se zřeďuje inhalacemi. Po každé inhalaci je prováděna fyzioterapie, která umožňuje efektivně odstranit hlen z dýchacích cest. Asi u 90 % nemocných s nedostatečnou funkcí slinivky břišní je třeba podávat před každým jídlem pankreatickou substituční terapii. K udržení dobrého stavu výživy potřebují nemocní kvalitní stravu, která obsahuje o 20–40 % více energie než strava stejně starých, nepostižených jedinců. U CF je proto používán komplexní přístup založený na poskytování respirační fyzioterapie, ambulantní a non-ambulantní léčby antibiotiky a broncholytiky, pankreatickou substituční terapií, správnou výživu a psychosociální podporu. Aerosolová terapie rekombinantní Dnasou je zaměřena na zlepšení průchodnosti dýchacích cest. Velmi nadějná je i intenzívní protizánětlivá terapie u sinopulmonálního onemocnění, včetně provádění bilaterálních transplantací plic v indikovaných případech. Blíže je komplexní terapie CF popsána v publikacích(1, 2, 4).
Díky pokroku komplexní terapie se prognóza CF podstatně zlepšila, s průměrným přežíváním ve vyspělých zemích na přibližně 28 let u žen a 30 let u mužů. Pro nedávno narozené nemocné děti s CF se očekávaná délka života neustále prodlužuje díky stále se zdokonalující léčbě(1, 2, 4, 6).
Molekulárně genetická charakteristika CF
===== Gen CFTR =====
Gen CF (cystic fibrosis transmembrane conductance regulator; CFTR) byl v roce 1987 lokalizován na dlouhé raménko chromosomu 7 (lokus 7q31.3) a v roce 1989 identifikován pomocí reverzního klonování(1, 7). Gen CFTR má 27 exonů a rozprostírá se v oblasti přibližně 230 (kilobazí) kb a vytváří mRNA 6 kb dlouhou. Protein, který je kódován tímto genem, se nazývá CFTR protein. Skládá se ze 1480 aminokyselin a patří do skupiny tzv. „ATP-binding cassette“ transmembránových transportních proteinů. CFTR protein plní především funkci chloridového kanálu. Současně s tím však i reguluje asociovanou funkci resorpčního epitelového sodíkového kanálu (ENaC-epithelial sodium channel) a pomocí aktivní exkrece ATP, přes interakci s P glykoproteinem, i funkci dalšího důležitého chloridového kanálu – ORCC (outwardly rectified chloride channel) (Obr. 1). Obsahuje pět základních domén: dvě „TM“ (transmembránové domény, které slouží k uchycení CFTR proteinu v apikální buněčné membráně), „R“ - regulační doménu (která plní funkci „uzávěru“ chloridového kanálu a obsahuje vazebná místa pro proteinkinázu A) a dvě „NBD“ domény (nucleotide binding domains, které obsahují vazebná místa pro aktivovaný trifosfát /ATP/ z cytoplazmatické části buňky a svými konformačními změnami regulují průtok iontů chloridovým kanálem)(1).
Za normálních okolností je CFTR kanál volně prostupný a umožňuje adekvátní koncentraci sodíku a chloridu v lumen exokrinních žláz a dýchacích cest. Takto přesně definovaný osmotický tlak pak přispívá ke správné hydrataci mukoidních sekretů. Daná koncentrace soli je také klíčová i pro správnou funkci vrozené imunity, tj. defensinů. U CF je resorpce chloridů z lumen exokrinních žláz a dýchacích cest porušena a dochází rovněž ke zvýšené resorpci sodíku. Konečně dysfunkční CFTR protein nefunguje jako internalizační - fagocytární receptor pro oportunní bakteriální a plísňové patogeny. Výsledkem těchto komplexních patogenetických mechanismů je pak snížená hydratace mukoidních sekretů, chronická obstrukce dýchacích cest a vývodů pankreatu vedoucí k „bludnému kruhu“ progresívního chronického zánětu(1).
Mutace genu CFTR
Dosud bylo nalezeno přes 1000 mutací CFTR genu v různé četnosti u rozličných světových populací. Z tohoto počtu pouze 10 mutací (F508del, G542X, G551D, R553X, 1717-1 G→A, 621+1 G→T, W1282X, N1303K, 3849+10kb C→T, CFTRdele2,3/21kb/) představuje populačně a klinicky nejdůležitější alely genu CFTR ve velkých heterogenních populacích, přičemž ostatní mutace jsou vzácné. Podrobná distribuce mutací a jejich populační specifičnost je aktualizována na webové stránce CF Genetic Analysis Consortium (http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/). Tomuto konsorciu jsou také hlášeny nové mutace v tomto genu, a to i před jejich publikováním.
Základní a nejčastější mutace genu CFTR je delece 3 pb, která vede ke ztrátě fenylalaninu („F“) na pozici 508 CFTR proteinu (tj. F508del)(1, 7). Nachází se v exonu 10 genu CFTR a porušuje tak funkci klíčové domény proteinu CFTR - NBD1. Tato mutace má společný původ a nachází se celosvětově v průměru na 68 % testovaných CF chromosomů.
Naopak v některých izolovaných populacích mohou např. díky „efektu zakladatele (founder effect)“ některé mutace dosáhnout neobvykle vysoké četnosti. Tento princip se uplatňuje především v populacích, které pocházejí z malé původní skupiny (např. francouzských Kanaďanů, Ashkenazi židovské populace), kde se původní mutace (např. 711+1 G→T, W1282X) přítomné v určitém nenáhodném počtu „namnoží“ s následným rychlým růstem výchozí populace(8).
Nejčastějšími mutacemi jsou záměny aminokyselin („missense“) mutace (38 % všech dosud známých mutací), posunové („frame shift“) mutace způsobující poruchu tzv. čtecího rámečku (26 %), nesmyslné („nonsense“) mutace spojené s vytvoření stop kodonu (20 %), mutace způsobující abnormální sestřih exonů genu CFTR („splice site“ mutace; 14 %) a po 1 % se v genu CFTR vyskytují rozsáhlé delece nebo „samesense“ mutace, kdy je díky degenerovanému genetickému kódu tatáž aminokyselina kódována jiným nukleotidovým tripletem. Většina mutací je rozložena rovnoměrně po celé kódující sekvenci a postihuje tak všechny jednotlivé funkční domény proteinu CFTR (mutace v exonech 3, 4, 6A a 7 postihují funkci první transmembránové domény; v exonech 9-12 porušují funkci NBD I; v exonu 13 postihují funkcí regulační domény; v exonech 14A, 15, 16, 71A, 17B, 18 druhé transmembránové domény a v exonech 19-22 - NBD II)(1, 8).
Z hlediska molekulární patogeneze se mutace rozdělují do pěti základních skupin, podle toho na jakém stupni zasáhnou tvorbu, intracelulární transport, aktivaci a funkci proteinu CFTR. Třída I vytváří defektní protein CFTR (především „nonsense“ /G542X/ a „frameshift“ /2143delT/ mutace), Třída II způsobuje poruchu post-translačního zpracování (glykosylace) a transportu (?) proteinu CFTR v buněčných membránových systémech (např. mutace F508del), třída III způsobuje defektní regulaci nebo aktivaci chloridového kanálu (např. mutace G551D), třída IV snižuje průnik iontů chloridovým kanálem (např. mutace R347P) a třída V (např. mutace 3849+10kb C→T) je spojena se sníženou syntézou proteinu CFTR(1, 9) (Obr. 2).
V genu CFTR bylo také popsáno již více než 200 různých intragenových polymorfismů (http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/poly-intron.html a http://www.genet.sickkids.on.ca/cftr/poly-exon.html). Nicméně rozdělení alterací sekvence genu CFTR na (?) „benigní“ polymorfismy, potenciálně patogenní varianty a „patogenní“ mutace je spíše arbitrární, protože mezi nimi existuje z funkčního hlediska jakési kontinuum. Některé polymorfismy mohou snížit funkci proteinu CFTR řádově o několik procent, ale pokud je jich v genu CFTR více, může být jejich účinek aditivní nebo dokonce i multiplikativní. Vytvoří se tak „polyvariantní haplotyp“, který může fungovat „samostatně“ jako patogenní mutace. Fenotypický projev mutací genu CFTR ať již v homozygotní, nebo heterozygotní konstituci je rovněž např. ovlivňován variantami v intronu 8(10) - tzv. IVS–8 (T)n (5/7/9T) a IVS-8 (TG)n a variantou 1540 A/G (M470V) v exonu 10 genu CFTR(9). Nejsou však dosud objasněny jejich možné populační, etnické a regionální rozdíly ve frekvenci u zdravých jedinců a ani u chronických onemocnění respiračního a gastrointestinálního systému nebo závažných poruch reprodukce(8).
===== Korelace genotypu s fenotypem =====
Prozatím je dobře dokumentován vztah genotypu s fenotypem pro postižení slinivky břišní. Více než 90 % pacientů s pankreatickou insuficiencí má dvě „závažné“ mutace (např. F508del, která postihuje funkci klíčové domény proteinu CFTR - NBD1), a naopak pacienti s pankreatickou suficiencí, či pacienti s opožděným rozvojem pankreatické insuficience mají jednu či dvě „mírné“ mutace (např. R117H, která pouze omezí vodivost kanálu CFTR)(1, 2, 9). Dosud nebyla zcela objasněna korelace mezi genotypem genu CFTR a závažností sino-pulmonálního onemocnění. Vzhledem k tomu, že průběh plicního onemocnění předurčuje prognózu pacientů, není možno zatím bohužel jednoznačně využít genotypu genu CFTR, jakožto obecného prognostického faktoru quoad vitam.
Některé „mírné“ mutace genu CFTR, jako například mutace R117H, se nalézají i u atypických forem CF, které probíhají bez klasického sino-pulmonálního onemocnění nebo jsou přítomny u jinak zjevně zdravých mužů s kongenitální bilaterální absencí chámovodů (CBAVD - congenital bilateral absence of vas deferens), kteří nejeví známky CF(1, 2, 9). Tito pacienti mají většinou nižší koncentraci chloridů v potu a klinické příznaky, které nejsou typické pro klasickou formu CF(4).
Fenotypický projev mutací genu CFTR závisí nejenom na typu mutace a eventuálním intragenovém polymorfismu, ale také i na možném regulačním a modifikujícím účinku jiných genů lokalizovaných na dalších chromosomech(11). V tomto ohledu již byly nalezeny modifikátory pro výskyt mekoniového ileu (CFM1 na chromosomu 19) a alely Z/S v genu pro 1-antitrypsin, které spoluurčují závažnost hepatobiliárního onemocnění (CFLD – cystic fibrosis liver disease).
Principy genotypově specifické moderní farmakoterapie
Na základě znalostí molekulární patogeneze spojené s jednotlivými mutacemi genu CFTR byly vyvinuty „genotypově specifické“ terapeutické postupy(6). Hlavní výzkumné úsilí se zaměřilo na „cílenou“ terapii fenotypických projevů hlavní mutace F508del (přítomné u více než 2/3 všech pacientů s klasickou formou CF), pomocí chemické stabilizace proteinu CFTR-F508del glycerolem in vitro nebo na jeho zvýšenou aktivaci/stabilizaci pomocí 4-fenylbutyrátu in vivo(15, 16). Vzhledem k tomu, že optimální kauzální terapie CF zahrnuje jak obnovení funkce chloridového kanálu, tak i ovlivnění další regulační funkce proteinu CFTR, terapie zaměřená pouze na zvýšenou expresi mutovaného proteinu CFTR in vivo nemusí být vždy plně účinná.
Moderní terapii CF je také nutné optimalizovat podle třídy, povahy a lokalizace příslušné mutace genu CFTR(1, 6). U nesmyslných mutací, jako je například mutace G542X, je možné použít amino glykosidová antibiotika, jako například gentamicin, k modulaci přeskočení exonů in vivo („exon-skipping“) při sestřihu CFTRmRNA(16). Přesný mechanismus modulace transkripce, translace a proteosyntézy určitými typy antibiotik dosud není přesně znám, ale jejich nečekané kauzální léčebné dopady se již zkoušejí v klinické praxi(16). Naopak u mutací, které umožní intracelulární transport mutovaného proteinu CFTR na apikální membránu, jako například u mutace G551D, lze s úspěchem použít analoga ATP v podobě inhalační léčby pomocí uridintrifosfátu (UTP)(1). Je tedy zřejmé, že inhalace UTP je neúčinná u mutace F508del, tak jako je 4-fenylbutyrát nepoužitelný u mutace G551D. S rozvojem molekulární patogeneze spojené s jednotlivými častými mutacemi genu CFTR budou vyvinuty i další genotypově specifické farmakoterapeutické postupy.
===== Ovlivnění funkce dalších iontových kanálů =====
Ke zvýšení úspěšnosti genotypově specifické moderní farmakoterapii je potřeba ovlivnit i ostatní iontové kanály, které jsou nebo i nejsou funkčně vázané k proteinu CFTR. Protein CFTR například negativně reguluje epitelový sodíkový kanál (ENaC), který je v nepřítomnosti proteinu CFTR proteinu hyperaktivní, a tak způsobuje zvýšenou resorpci sodíku(6, 15, 16). K léčbě tohoto typu molekulárního defektu se inhalačně používá diuretikum amilorid, který blokuje resorpční kanál ENaC. Z tohoto důvodu je zřejmé, že je nutno u „kauzální“ farmakoterapie, zacílené na mutaci F508del, použít současně jak 4-fenylbutyrát, tak i amilorid(6, 15, 16).
Somatická genová terapie
Kauzální léčba CF na úrovni genu CFTR v podobě somatické genové terapie by mohla pacienty s CF zbavit jejich příznaků nápravou porušené funkce genu CFTR, pokud by byla použita v nejranějším, optimálně prenatálním stadiu rozvoje CF(6). Klinické využití genové terapie však dosud naráží na řadu nevyřešených problémů, jako je například genotoxicita virových vektorů, jejich nízká účinnost (liposomy), nespecifický tkáňový tropismus a jejich imunogenní potenciál, obzvláště při opakované aplikaci(6). Je rovněž velmi obtížné zajistit trvalou expresi všech genově terapeutických konstruktů v cílových tkáních.
Somatická genová terapie je proto teprve ve fázi intenzívního laboratorního a klinického výzkumu. Používá jak virové (adeno-asociované viry a adenoviry), tak i syntetické vektory (liposomy a DNA-protein komplexy apod.). V budoucnu bude tato moderní terapie umožňovat kauzální léčbu této jinak dosud paliativně léčitelné choroby, pokud se podaří především vyřešit problematiku imunitní odpovědi na přítomnost exprimovaného, nemutovaného, CFTR proteinu a příslušných vektorů. Je také nezbytné rozpracovat cílenou inkorporaci vektorů na definovaná místa lidského genomu nebo jejich kontinuální episomální expresi v podobě umělých autoreplikačních minichromosomů.
Vzhledem k časnému rozvoji příznaků CF bude potřeba genovou terapii použít již v prenatální nebo perinatální fázi vývoje. V této souvislosti se rovněž ukazuje, že genová terapie nebude „samospasitelná“, ale že bude spíše součástí komplexního terapeutického přístupu ke klasické formě CF. Podrobné zhodnocení somatické genové terapie také není předmětem tohoto článku(6). Vzhledem k reálné možnosti genové terapie je proto nezbytné pacienty s CF v současné době léčit standardními postupy co nejlépe, aby se genové terapie dožili v optimálním zdravotním stavu(2).
===== Četnost mutací genu CFTR v České republice =====
V Tab. 1 je uvedena četnost mutací genu CFTR v České republice. Dosud se podařilo dosáhnout přibližně 96% populační záchytnosti všech mutací, což je dosud nejvyšší procento ve střední Evropě(12). Distribuce mutací genu CFTR u nás odráží keltský a slovanský původ naší současné populace(13).
Přímá diagnostika
Přímá diagnostika pomocí vyšetření kauzálních – patogenních mutací(4) umožňuje se 100% jistotou prenatální prevenci CF a může být poskytnuta i v rodině, kde postižené dítě dříve zemřelo, aniž bylo molekulárně geneticky vyšetřeno.
===== Nepřímá diagnostika mutací =====
Přítomnost mutace v genu CFTR lze zjistit i nepřímo, pomocí tzv. genových markerů. Marker (SNP – single nucleotide polymorphism) je takovou změnou sekvence DNA, která chorobu nezpůsobí, ale přenáší se společně s patogenní mutací genu CFTR, s nímž je co nejpevněji vázána. Nepřímou diagnostiku CF je možno provést pouze tehdy, pokud můžeme vyšetřit pacienta a oba jeho rodiče. Na základě výsledků nepřímé diagnostiky lze zajistit prenatální diagnostiku postiženého plodu nebo určit nosičství u pokrevních příbuzných zhruba s 99% jistotou, pokud je marker v těsné blízkosti genu CFTR. Intragenové markery (STR; mikrosatelitní sekvence) uložené uvnitř genu CFTR umožňují 100% diagnostickou jistotu(12).
Prenatální diagnostika CF
Prenatální diagnóza a prevence CF je založena na vyšetření mutací genu CFTR u plodu v časné fázi těhotenství, a to už od 11. týdne gravidity. Provádí se z DNA buněk plodové vody nebo z placenty. Plodová voda je odebírána sterilně, bez narkózy, s minimálním rizikem pro plod a těhotnou ženu, pod kontrolou ultrazvuku. Molekulárně genetické vyšetření DNA plodu pak prokáže, zda se vyvíjí dítě postižené, či nepostižené CF. Výsledek genetického vyšetření lze získat nejdéle do 2 týdnů po odběru plodové vody. V případě, že se prokáže vývoj postiženého plodu, je možno přerušit těhotenství do 24. týdne těhotenství. Přerušení těhotenství lze však provést vždy pouze na základě svobodného rozhodnutí obou rodičů, založeném na získání co nejpodrobnějších informací od specializovaného lékaře-genetika.
V případech, kdy není přímá diagnostika možná, doplňujeme molekulárně genetické vyšetření plodu ještě ultrazvukovým a biochemickým vyšetřením plodové vody. Tato doplňující vyšetření jsou nejspolehlivější v 17.–18. týdnu těhotenství. Odběr plodové vody je proto plánován v těchto případech v této fázi těhotenství.
Prenatální diagnostiku doporučujeme i rodinám, kde pouze jeden z rodičů je prokázaným nosičem mutace genu pro CF (sourozenec nebo pokrevní příbuzný CF pacienta) a u druhého rodiče (kde se CF v rodině nevyskytuje) bylo možno vyloučit přibližně 90 % všech dosud známých populačně specifických mutací genu CFTR. Lze takto vyloučit riziko postižení dítěte CF, pokud se u něho nenalezne mutace zděděná od jednoho z rodičů nebo se sníží toto riziko na nejmenší možnou míru (až pod 1 �). Při tomto prenatálně genetickém vyšetření je zajištěna rovněž spolehlivá prenatální prevence vrozených vad, podmíněných poruchami počtu a struktury chromosomů a jiných vrozených vad, zjistitelných u plodu podrobným ultrazvukovým vyšetřením(12, 14).
===== Genetické poradenství =====
Každé rodině, v níž se narodilo dítě nemocné CF, je nutno zajistit specializované genetické poradenství. Tato služba umožňuje objasnit genetickou povahu onemocnění, výši genetických rizik pro další děti a doporučit optimální formu časné genetické prevence a léčby v těchto geneticky rizikových rodinách. Genetické poradenství umožňuje provést všechna klinicko-genetická vyšetření včetně molekulárně genetické diagnostiky mutací genu CFTR, která rozhodnou o optimální strategii prenatální genetické prevence. Pomůže rovněž takovýmto rodinám vyrovnat se bez pocitu viny s narozením nemocného dítěte a umožnit narození dalších zdravých dětí(14).
Souhrn a výhled do budoucna
CF představuje u nás i celosvětově závažný medicínský a sociálně ekonomický problém také vzhledem k vysokým nákladům na její prevenci a léčbu. Léčba CF se s každým přibývajícím rokem věku pacientů stále více prodražuje, protože s věkem přibývá i komplikací, které je nutno intenzívněji léčit. Průměrné roční náklady na léčbu nekomplikovaného případu CF v USA v roce 1997 přesáhly 50 000 USD (VI/2001) (Genetic Testing for Cystic Fibrosis, National Institutes of Health (NIH) Consensus Statement-Online 1997, 15(4):1-37; odp.od.nih.gov/consensus/cons/106/ 106_statement.htm). V USA se odhaduje, že celoživotní náklady na léčení jednoho pacienta s CF přesahují 1 milión USD. V České republice odhadnuté roční náklady na léčení všech známých pacientů s CF činí celkem přibližně 164 miliónů Kč. V této celkové částce však nejsou zohledněny náklady na hospitalizaci, platy ošetřujícího personálu a ostatní výdaje spojené s ambulantní léčbou. Rodiny pacientů jsou také většinou vyřazeny z pracovního procesu, neboť matky musí zůstat často trvale s nemocným dítětem doma. Podrobně je tato problematika uvedena na webové stránce českého Klubu nemocných s CF (www.fw.cz/CF/;(2). Dospělí pacienti s CF jsou většinou v invalidním důchodu a jsou často opakovaně a dlouhodobě hospitalizováni. Nutná odhadnutá délka hospitalizace u námi registrovaných pacientů s CF dosahovala v roce 2000 4900 dnů.
Z tohoto důvodu se celosvětově věnuje trvalá pozornost výzkumu molekulární patogeneze, diagnostiky a léčby CF(1). Pokroky v oblasti genetiky budou dány rozvojem genomických přístupů k objasnění komplexní molekulární patogeneze a rozvojem cílené farmakoterapie a genové terapie, které využijí poznatky rychle se rozvíjejícího základního výzkumu.
1.WELSH, MJ., RAMSEY, BW., ACCURSO, F., et al. Cystic fibrosis. In SCRIVER, CR., BEAUDET, AL., SLY, WS., VALLE, D. (Eds), The metabolic and molecular basis of inherited disease. New York : McGraw-Hill Inc., vol. III, 2002 - v tisku.
2.VÁVROVÁ, V., ZEMKOVÁ, D., BARTOŠOVÁ, J., et al. Cystická fibrosa. Postgraduální Medicína, 1999, 1, s. 24-32.
3.MACEK, M., Jr., MACEK, M., KREBSOVÁ, A. et al. Possible association of the allele status of the CS.7/HhaI polymorphism 5´ of the CFTR gene with postnatal female survival. Human Genetics, 1997, 99, p. 565-572.
4.ROSENSTEIN, BJ., CUTTING, GR. The diagnosis of cystic fibrosis: a consensus statement. Cystic Fibrosis Foundation Consensus Panel. J Pediatr, 1998, 132, p. 589-595.
5.FARRELL, PM. Improving the health of patients with cystic fibrosis through newborn screening. Adv Ped, 2000, 49, p. 79-115.
6.WELSH, MJ. Gene transfer for cystic fibrosis. J Clin Invest, 1999, 104, p. 1165-1166.
7.KEREM, B., ROMMENS, JM., BUCHANAN, JA., et al. Identification of the cystic fibrosis gene: genetic analysis. Science, 1989, 245, p. 1073-1080.
8.ESTIVILL, X., BANCELLS, C., RAMOS, C. and the Biomed CF Mutation Analysis Consortium. Geographic distribution and regional origin of 272 cystic fibrosis mutations in European populations. Hum Mut,1997, 10, p. 135-154.
9.ZIELENSKI, J. Genotype & phenotype in cystic fibrosis. Respiration, 2000, 67, p. 117-133 .
10.KIESEWETTER, SS., MACEK, M., Jr., DAVIS, C., et al. A mutation in CFTR produces different phenotypes depending on chromosomal background. Nature Genetics, 1993, 5, p. 274-278.
11.ZIELENSKI, J., COREY, M., ROZMAHEL, R., et al. Detection of a cystic fibrosis modifier locus for meconium ileus on human chromosome 19q13. Nature Genetics,1999, 22, p. 128-129.
12.MACEK, M., Jr., M., KREBSOVÁ, A., MACEK, M. et al. Current possibilities of prenatal and postnatal molecular genetic diagnosis of cystic fibrosis in Czech and Slovak Republics. Česko-Slovenská Pediatrie, 1997, 52, s. 557-564.
13.MACEK, M., MACEK, M., Jr., KREBSOVÁ, A., et al. Keltský původ populace v Česku. Vesmír, 2000, 79, s. 285.
14.MACEK, M., MACEK, M., Jr., KREBSOVÁ, A. Molekulárně genetická diagnostika v prenatální genetické prevenci VVV a chorob. In HÁJEK, Z., KULOVANÝ, E., MACEK, M., (Eds), Prenatální diagnostika. Praha : Grada Publishing, 2000.
15.ZEITLIN, PL. Therapies directed at the basic defect in cystic fibrosis. Clinics in Chest Medicine, 1998, 19, p. 515-525.
16.WILSCHANSKI, M., FAMINI, C., BLAU, H., et al. A pilot study of gentamycin on nasal potential difference measurements in cystic fibrosis patients carrying stop mutations. Am J Respir Crit Care Med, 2000, 161, p. 860-865.
Podpořeno IgA MZ ČR-5067-3, VZ FN Motol–00000064203 a MŠMT ČR–LN00A079 a VZ UK 2. LF 111300003
milan.macek.jr@lfmotol.cuni.cz
===== Souhrn =====
Energetická bilance a hromadění tuku v těle závisí na kalorickém příjmu a energetickém výdeji. Součástí energetického výdeje je také uvolňování tepla během oxidační fosforylace (proces tvorby ATP) v mitochondriích. Prvním krokem oxidační fosforylace je tvorba gradientu protonů na vnitřní mitochondriální membráně. Energie uložená v tomto gradientu je následně využívána pro syntézu ATP. Propustnost membrány pro protony zvyšují odpřahující proteiny (UCP), které tak snižují účinnost energetické přeměny, brzdí syntézu ATP a stimulují uvolňování energie ve formě tepla. UCP také zvyšují oxidaci substrátů a snižují tvorbu volných kyslíkových radikálů v mitochondriích. Dosud bylo popsáno pět UCP s podobnou strukturou a funkčními vlastnostmi, označovaných jako UCP1–UCP5. Exprese a funkce jednotlivých UCP v organismu závisí na typu tkáně. UCP1 je za fyziologických podmínek přítomen výhradně v hnědé tukové tkáni, kde řídí tvorbu tepla. UCP2 se nachází ve více tkáních, zejména v bílém tuku, některých buňkách imunitního systému (makrofázích) a v b-buňkách pankreatu. Exprese UCP2 v bílém tuku negativně koreluje s obezitou a je pravděpodobné, že se UCP2 podílí na řízení lipidového metabolismu v adipocytech. V makrofázích zasahuje UCP2 do regulace fagocytózy a v b-buňkách do sekrece inzulínu. UCP3 je přítomen v hnědém tuku a ve svalech a má vztah k oxidaci mastných kyselin a k citlivosti svalů k inzulínu. Expresi UCP v různých tkáních lze modulovat farmaky, dietou a typem lipidů ve stravě. Ovlivňování exprese UCP ve svalu a tukové tkáni je slibnou cestou nových způsobů terapie obezity a metabolického syndromu.
Zatímco v minulosti byla obezita pokládána za původce či přinejmenším rizikový faktor diabetu 2. typu, dnes jsou obezita a diabetes považovány spíše za projev jednoho onemocnění. Vyskytují-li se obezita a diabetes současně, mohou mít stejný genetický základ a představují nejzávažnější složky metabolického syndromu. Pro vývoj nových postupů léčby metabolického syndromu je třeba na molekulární úrovni poznat pochody ovlivňující celkovou energetickou bilanci organismu a syntézu a degradaci tuků, které s energetickou bilancí úzce souvisí(1). Množství tuku v těle je dáno poměrem dvou složek energetické bilance, energetického příjmu a energetického výdeje. Zatímco energetický příjem lze do značné míry vědomě regulovat, energetický výdej závisí na vědomých procesech jen částečně. Převážnou část (asi 60 %) tvoří klidový energetický výdej (RMR, z anglického resting metabolic rate), který je mírou energetického výdeje za standardních klidových podmínek (v teplotě termoneutrální zóny a v postabsorpčním stavu). Příspěvky jednotlivých orgánů k RMR jsou shrnuty v Tab. 1.
Přeměna energie uložené v zásobních metabolitech (zejména v tucích a cukrech) na ATP, tedy formu využitelnou pro veškeré základní životní pochody buňky, je asi z 90 % zajišťována oxidační fosforylací, odehrávající se na vnitřní membráně mitochondrií (Obr. 1). Mechanismus oxidační fosforylace sestává ze dvou kroků. Nejprve je energie uvolněná během oxidace (= spalování) substrátů transformována čtyřmi proteinovými komplexy dýchacího řetězce na gradient protonů na membráně. Dochází tak k „energizaci“ membrány, což lze pro jednoduchost přirovnat k „nabíjení“ akumulátoru. Ve druhém kroku je energie tohoto buněčného akumulátoru hnací silou syntézy ATP. V žádné tkáni neprobíhá oxidační fosforylace se stoprocentní účinností. Část protonů se navrací do mitochondrií, aniž by poháněly syntézu ATP. Tento děj, analogický „zkratu“ akumulátoru, nazýváme odpřažení oxidační fosforylace. Stejně jako při „zkratu“ se i zde přebytečná energie uvolňuje ve formě tepla (Obr. 1). Zároveň v mitochondriích stoupá rychlost oxidace substrátů. Odpřažení oxidační fosforylace je v některých tkáních zodpovědné za významnou část spotřeby kyslíku (např. v játrech až 25 %, v kosterním svalu v klidovém stavu až 50 %) a spolu s cyklickými metabolickými ději, které spotřebovávají ATP (např. účinkem Na+/K+– ATPázy na cytoplazmatické membráně), představuje nejdůležitější zdroj metabolického tepla. Úroveň RMR (a termogeneze) zvyšují mimo jiné hormony štítné žlázy a hormon tukové tkáně leptin, které stimulují spotřebu kyslíku v řadě tkání. Přitom se uplatňuje jak zvýšení permeability mitochondrií pro protony, tak stimulace reakcí spotřebovávajících ATP(1).
Mechanismus, kterým může být řízena tvorba tepla v mitochondriích, byl poprvé odhalen v hnědé tukové tkáni, jediném specializovaném termogenním orgánu savců. V letech 1976–1978 bylo prokázáno, že přenos protonů přes vnitřní membránu mitochondrií hnědého tuku a termogenezi zprostředkovává protein, který pro jeho funkci nazýváme odpřahujícím proteinem [UCP, z anglického uncoupling protein(2, 3)]. Donedávna se předpokládalo, že existuje pouze jediný UCP. Od roku 1997 však bylo nalezeno několik genů kódujících proteiny, které jsou UCP více či méně podobné (UCP2 až UCP5). Protein prvně objevený v hnědém tuku byl přejmenován na UCP1 (Tab. 2). Na rozdíl od UCP1 jsou geny pro nové UCP aktivní v řadě tkání a zřejmě podobně jako UCP1 zvyšují propustnost vnitřní mitochondriální membrány pro protony, čímž snižují syntézu ATP. Přesto může být jejich začlenění do rodiny „odpřahujících proteinů“ matoucí. To platí zvláště pro UCP4 a UCP5, které jsou s UCP1 homologní jen asi ze 30 % a jejichž funkce se může od UCP1 zásadně lišit. V dalším textu se proto budeme zabývat jen UCP1, UCP2 a UCP3, které jsou si navzájem velmi blízké strukturou a pravděpodobně také biochemickou aktivitou.
Principiální otázkou je, do jaké míry se účinnost energetické přeměny v tkáních projevuje na tělesné hmotnosti. Již v roce 1885, dlouho před tím, než byl objeven mechanismus oxidační fosforylace (Obr. 1), bylo zjištěno, že látky ze skupiny dinitrofenolů (používané tehdy jako potravinářská barviva) zvyšují termogenezi. Později bylo zjištěno, že zejména 2,4-dinitrofenol stimuluje metabolický obrat a způsobuje úbytek hmotnosti. I přes mnoho náznaků toxicity byla tato látka aplikována obézním pacientům, a to zejména v USA. Z hlediska léčby obezity byly výsledky velmi dobré. V některých případech však léčba měla závažné vedlejší účinky (např. kardiopulmonální selhání), které vedly i k úmrtím(4). Od roku 1938 bylo od používání 2,4-dinitrofenolu v humánní medicíně upuštěno. Dnes víme, že za účinky 2,4-dinitrofenolu stála jeho schopnost působit jako odpřahovač oxidační fosforylace (Obr. 1).
Návrat ke strategii léčby obezity pomocí odpřažení oxidační fosforylace přinesl až rok 1979. V klasickém experimentu(5) byla laboratorním krysám podávána chuťově atraktivní a kaloricky bohatá strava (anglicky cafeteria diet), čímž výrazně stoupl energetický příjem, ale bez odpovídajícího přírůstku na váze. Díky zvýšené aktivitě hnědé tukové tkáně (a UCP1) organismus přebytečnou energii vyzářil ve formě tepla. Také u lidí příjem potravy stimuluje výdej energie. Tento efekt se nazývá termogeneze indukovaná dietou (DIT, z anglického diet-induced thermogenesis) a činí 8–10 % energetického příjmu(6). Biochemický podklad DIT není zcela znám. Pokusy na myších však naznačily, že se zde pravděpodobně uplatňuje leptin. Zatímco podávání „cafeteria“ diety kontrolním myším vedlo k dvojnásobnému kalorickému příjmu bez patrného nárůstu tělesné hmotnosti, u geneticky obézních ob/ob myší (myši s nefunkčním genem pro leptin) se příjem potravy zvýšil jen o polovinu a myši výrazně přibývaly na váze(7). Rozdíl v efektu diety na tělesnou hmotnost pramenil z aktivace DIT u kontrolních myší a absence DIT u ob/ob myší. I u dalších modelů obezity u experimentálních zvířat byl prokázán defekt DIT, často na úrovni hnědého tuku (a opět UCP1), ale i v dalších tkáních. Lze předpokládat, že také u lidí mírná stimulace celkového energetického výdeje kontrolovaným odpřažením oxidační fosforylace může zabránit vzniku obezity. Nadváhu by proto bylo možné redukovat stimulací hnědého tuku. Tato tkáň se sice u člověka vyskytuje jen u novorozenců a během prvního roku po porodu involuje, ale její rezidua lze detekovat i v osmé dekádě života(8). U zvířat indukují růst hnědého tuku látky ze skupiny b3-adrenergních agonistů, které zároveň redukují obezitu. U člověka je však tento typ termogenních farmak ne účinný (lidské tukové buňky neobsahují funkční b3-adrenoreceptor).
Objev UCP2(9, 10) a UCP3(11), které se nacházejí i v jiných tkáních než v hnědém tuku (Tab. 2), přinesl novou šanci pro redukci nadváhy farmakologickým ovlivňováním účinnosti oxidační fosforylace. UCP2 je atraktivním cílem pro hledání nových termogenních farmak zejména díky své přítomnosti v bílém tuku. Ve prospěch této strategie svědčí i to, že termogeneze v podkožním bílém tuku(12) a exprese UCP2 v intraabdominálním tuku(13) negativně korelují s množstvím tuku v těle. Byl také popsán vztah mezi polymorfismem v promotoru genu pro UCP2 a prevalencí obezity(14). Dosud však nebyla funkce UCP2 v bílém tuku bezpečně charakterizována a jeho potenciální vliv na energetickou bilanci je nejasný.
Účinky odpřažení oxidační fosforylace na metabolismus bílé tukové tkáně poprvé pozorovali Robert Rognstad a Joseph Katz(15), kteří před více než 30 lety zkoumali in vitro vliv 2,4-dinitrofenolu na fragmentech intraabdominálního tuku. Vlivem odpřažení došlo nejen ke stimulaci oxidačního metabolismu, ale klesla také syntéza mastných kyselin (zřejmě v důsledku nedostatečné produkce ATP v mitochondriích). Vliv odpřažení na syntézu mastných kyselin vysvětluje redukci nadváhy 2,4-dinitrofenolem (a snad i působením UCP2) lépe než stimulace termogeneze, protože příspěvek bílé tukové tkáně k celkovému energetickému výdeji je relativně nízký (Tab. 1). Po více než 30 letech jsme závěry Rognstada a Katze potvrdili v naší laboratoři ve Fyziologickém ústavu AV ČR v Praze na adipocytech v buněčné kultuře [citace(16) a Obr. 2]. Dále jsme prokázali v pokusech na transgenních myších s ektopickou expresí UCP1 v bílé tukové tkáni, že odpřažení oxidační fosforylace v bílé tukové tkáni zvyšuje oxidaci endogenních substrátů a zároveň snižuje syntézu mastných kyselin in vivo [citace(16) a Obr. 3]. Inhibice syntézy mastných kyselin v různých depech tukové tkáně je úměrná množství transgenního UCP1 (Obr. 3). Odpřažení v bílém tuku snižuje nadváhu, ale neovlivní hmotnost myší krmených standardní dietou [citace(16–18) a Obr. 4]. Lipogeneze v tukové tkáni probíhá i u člověka a její inhibice vlivem odpřažení by mohla snižovat hromadění tělesného tuku. Je třeba ověřit, zda např. omega-3 polynenasycené mastné kyseliny z mořských ryb nebo hypolipidemika ze skupiny fibrátů, které zvyšují expresi UCP2 v tukové tkáni, inhibují lipogenezi a snižují hromadění tuku u zvířat, mohou přispívat k léčbě nadváhy u lidských pacientů(1).
Z hlediska patofyziologie a léčby metabolického syndromu jsou zajímavé nové poznatky o funkci UCP2 v b-buňkách pankreatu, které naznačují, že UCP2 je negativním regulátorem inzulínovésekrece.Sekrece inzulínu závisí na koncentraci glukózy v krvi. Zvýšená utilizace glukózy vede ke zvýšení syntézy ATP a následně k uzavření KATP kanálů na buněčné membráně a k depolarizaci membrány. V důsledku toho dojde k otevření napěťově řízených vápníkových kanálů a toku vápníku do buněk. Zvýšená koncentrace vápníku v buňkách je hlavním stimulátorem fúze váčků obsahujících inzulín s cytoplazmatickou membránou a sekrece inzulínu. Dlouhodobý nadbytek mastných kyselin v krvi obézních jedinců může stimulovat expresi UCP2 v b-buňkách, tak snižovat produkci ATP a inhibovat sekreci inzulínu(19, 20). Zvýšená exprese UCP2 v b-buňkách by proto mohla být klíčovým faktorem spojujícím obezitu s diabetem. Tato představa však vyžaduje důkladné ověření.
Pro vývoj nových termogenních farmak je důležitý i UCP3, zejména pro specifickou expresi genu UCP3 ve svalových buňkách a v hnědé tukové tkáni (Tab. 2), tedy v orgánech, které výrazně přispívají k celkovému energetickému výdeji (Tab. 1). Jak již bylo uvedeno výše, až 50 % spotřeby kyslíku v kosterním svalu za klidových podmínek jde na vrub „zkratování“ protonového gradientu v mitochondriích. Klidový metabolismus svalů odpovídá až za 50 % rozdílů v RMR mezi různými jedinci a za jejich dispozice k obezitě. Již od objevu v roce 1997 (viz výše) byla proto UCP3 přisuzována role v regulaci energetického obratu a termogeneze. Změny exprese UCP3 v kosterním svalu, které naznačují vliv UCP3 na oxidační kapacitu tkáně, byly prokázány v mnoha studiích u lidí při obezitě, diabetu a při svalové aktivitě(21–24). U zvířat i u lidí exprese UCP3 koreluje s mírou oxidace mastných kyselin při hladovění, které je doprovázeno vzestupem neesterifikovaných mastných kyselin v krvi(25). U myší prudce stoupá exprese UCP3 těsně po porodu v závislosti na příjmu lipidů mateřským mlékem(26). Všechny tyto nálezy svědčí o těsném vztahu UCP3 k regulaci oxidace lipidů, a tím i citlivosti k inzulínu, která klesá při nedostatečné oxidaci lipidů a jejich akumulaci ve svalu(27). Exprese UCP3 v kosterním svalu se liší podle typu svalových vláken. Nejvyšší je ve vláknech typu IIA (vlákna bílá, glykolytická), která jsou schopna metabolizovat jak sacharidy, tak i mastné kyseliny. Naopak nejnižší hladina UCP3 byla naměřena ve vláknech typu I (vlákna červená, oxidační), která jsou specializována na utilizaci mastných kyselin(25). Je možné, že hlavní funkcí UCP3 na molekulární úrovni není transport protonů z cytoplazmy do mitochondrií, ale transport aniontů mastných kyselin v opačném směru. Tyto molekulární mechanismy se doposud nepodařilo experimentálně odlišit, protože měřitelným výsledkem je v obou případech přenos protonů do mitochondrií a úbytek ATP. Transportuje-li anionty mastných kyselin, mohl by UCP3 „chránit“ mitochondrie před toxickými účinky mastných kyselin akumulovaných za stavů, kdy jejich nabídka převáží nad oxidační kapacitou mitochondrií(28, 29). Oxidace mastných kyselin v mitochondriích může probíhat až po jejich aktivaci konverzí na acylkoenzym A vně mitochondrií. Protože glykolytická vlákna aktivační aparát postrádají, jsou relativně citlivá k toxickému působení mastných kyselin. Vyšší hladiny UCP3 v glykolytických oproti oxidačním vláknům by mohly odrážet „ochrannou“ funkci UCP3.
Pochybnosti o molekulárním mechanismu funkce UCP3 nesnižují šance pro jeho využití k regulaci nadváhy i citlivosti svalu k inzulínu. Bylo zjištěno, že nadprodukce transgenního UCP3 v kosterním svalu myši vede ke snížení tělesné hmotnosti, rezistenci k obezitě a zvýšení RMR(30). Potencionální farmakoterapie obezity i inzulínové rezistence zaměřená na indukci UCP3 ve svalu by mohla vycházet z modulace exprese genu UCP3 prostřednictvím transkripčního faktoru PPAR-a (z anglického peroxisome proliferator-activated receptor). Působením přes PPAR- -a zvyšují expresi UCP3 ve svalu nejen mastné kyseliny, ale též hypolipidemika ze skupiny fibrátů(31). Stimulátorem exprese UCP3 v kosterním svalu je rovněž leptin. Je zajímavé, že látky ze skupiny b3-adrenergních agonistů, které snižují nadváhu a indukují tvorbu hnědého tuku u zvířat (viz výše), indukují expresi genu UCP3 v bílé tukové tkáni. Ve všech uvedených případech stoupá oxidace lipidů(1).
Výše uvedené poznatky jsou stručným souhrnem znalostí o různých UCP, zejména z hlediska jejich významu pro řízení termogeneze a lipidového metabolismu ve svalu a v tukové tkáni a také pro modulaci celkové energetické bilance. UCP ale mají v organismu i další funkce, které závisejí na typu tkáně a na stadiu ontogenetického vývoje. Metabolický stav a funkce různých typů buněk pravděpodobně určují fyziologický dopad aktivit UCP v mitochondriích, tj. regulace tvorby ATP, tepla, oxidace substrátů a také tvorby kyslíkových radikálů. V kardiomyocytech se UCP2 a UCP3 pravděpodobně uplatňují při přechodu z glykolytického na oxidační typ metabolismu v průběhu postnatálního vývoje (naše nepublikované výsledky). Prokázali jsme také, že v perinatálním období má UCP2 vztah k diferenciaci hematopoetických buněk v játrech(32). Výsledky jiných autorů naznačují, že se UCP2 uplatňuje při eliminaci infekčních agens v makrofázích a ochraně buněk proti oxidačnímu poškození (díky schopnosti UCP snižovat tvorbu volných kyslíkových radikálů v mitochondriích, viz Obr. 1). Podle nejnovějších poznatků je možné, že redukce tvorby kyslíkových radikálů v mitochondriích rovněž chrání organismus před vznikem diabetické angiopatie. Poškození cév, vyvolávané chronickou hyperglykémií, je způsobeno několika patobiochemickými mechanismy (např. aktivací hexosaminové kaskády nebo proteinkinázy C, viz níže), na jejichž počátku je vždy nadměrná tvorba volných kyslíkových radikálů v mitochondriích. Důsledkem aktivace hexosaminové kaskády a proteinkinázy C je mimo jiné snížení tvorby oxidu dusnatého (NO) v endoteliálních buňkách. Oxid dusnatý má vazodilatační účinky, je inhibitorem agregace trombocytů a jejich adheze na stěny cév, kontroluje expresi řady proteinů účastnících se aterogeneze, snižuje permeabilitu cév a oxidaci LDL a inhibuje proliferaci buněk hladké svaloviny cév. Za tvorbu NO v endotelu je zodpovědná endoteliální NO-syntáza (eNOS), která je aktivovaná signální kaskádou inzulínu. Zatímco aktivace hexosaminové dráhy způsobí kovalentní modifikaci (a inaktivaci) eNOS, proteinkináza C přímo inhibuje efekt inzulínu. Potlačením tvorby kyslíkových radikálů v mitochondriích (buď enzymem superoxid dismutázou, nebo expresí transgenního UCP1 v endoteliálních buňkách) byly důsledky inhibice eNOS zvráceny(33, 34). Je třeba zjistit, zda se v endoteliálních buňkách některý z UCP vyskytuje přirozeně a zda může brzdit vznik vaskulárního poškození. Je pravděpodobné, že UCP mají ještě řadu dalších, dosud nepoznaných funkcí v různých tkáních.
Léčba obezity, diabetického syndromu a jejich komplikací vyžaduje komplexní přístup. Zejména modulace účinnosti oxidační fosforylace v tukové tkáni a ve svalu je slibnou cestou nových způsobů kombinované terapie. Odpřahující proteiny v mitochondriích jsou nadějným kandidátem pro působení nových typů farmak.
1. Kopecký, J., Flachs, P. Tkáňový metabolismus a obezita. In Hainer, V. (Ed), Základy klinické obezitologie. Praha : Grada Publishing s. r. o., v tisku.
2. Ricquier, D., Kader, JC. Mitochondrial protein alteration in active brown fat: a sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoretic study. Biochem Biophys Res Commun, 1976, 73, no. 3, p. 577–583.
3. Heaton, GM., Wagenvoord, RJ., Kemp, A., Jr., et al. Brown-adipose-tissue mitochondria: Photoaffinity labelling of the regulatory site of energy dissipation. Eur J Biochem, 1978, 82, no. 2, p. 515–521.
4. Parascandola, J. Dinitrophenol and bioenergetics: an historical perspective. Mol Cell Biochem, 1974, 5, no. 1–2, p. 69–77.
5. Rothwell, NJ., Stock, MJ. A role for brown adipose tissue in diet-induced thermogenesis. Nature, 1979, 281(5726), p. 31–35.
6. MacDonald, IA. Energy expenditure in humans: the influence of activity, diet and the sympathetic nervous system. In Kopelman, PG., Stock, MJ. (Eds), Clinical obesity. Oxford : Blackwell Science, 1998, p. 112–128.
7. Trayhurn, P., Jones, PM., McGuckin, MM., et al. Effects of overfeeding on energy balance and brown fat thermogenesis in obese (ob/ob) mice. Nature, 1982, 295(5847), p. 323–325.
8. Merklin, RJ. Growth and distribution of human fetal brown fat. Anat Rec, 1974, 178, no. 3, p. 637–645.
9. Fleury, C., Neverova, M., Collins, S., et al. Uncoupling protein-2: A novel gene linked to obesity and hyperinsulinemia. Nat Genet, 1997, 15(3), p. 269–272.
10. Gimeno, RE., Dembski, M., Weng, X., et al. Cloning and characterization of an uncoupling protein homolog: a potential molecular mediator of human thermogenesis. Diabetes, 1997, 46, no. 5, p. 900–906.
11. Boss, O., Samec, S., Paoloni-Giacobino, A., et al. Uncoupling protein-3: A new member of the mitochondrial carrier family with tissue-specific expression. FEBS Lett, 1997, 408(1), p. 39–42.
12. Bottcher, H., Furst, P. Decreased white fat cell thermogenesis in obese individuals. Int J Obes Relat Metab Disord, 1997, 21, no. 6, p. 439–444.
13. Oberkofler, H., Dallinger, G., Liu, YM., et al. Uncoupling protein gene: Quantification of expression levels in adipose tissues of obese and non-obese humans. J Lipid Res, 1997, 38, no. 10, p. 2125–2133.
14. Esterbauer, H., Schneitler, C., Oberkofler, H., et al. A common polymorphism in the promoter of UCP2 is associated with decreased risk of obesity in middle-aged humans. Nat Genet, 2001, 28, 2, p. 178–183.
15. Rognstad, R., Katz, J. The effect of 2,4-dinitrophenol on adipose-tissue metabolism. Biochem J, 1969, 111, no. 4, p. 431–444.
16. Rossmeisl, M., Syrový, I., Baumruk, F., et al. Decreased fatty acid synthesis due to mitochondrial uncoupling in adipose tissue. FASEB J, 2000, 14, no. 12, p. 1793–1800.
17. Kopecký, J., Clarke, G., Enerbäck, S., et al. Expression of the mitochondrial uncoupling protein gene from the aP2 gene promoter prevents genetic obesity. J Clin Invest, 1995, 96, no. 6, p. 2914–2923.
18. Kopecký, J., Hodný, Z., Rossmeisl, M., et al. Reduction of dietary obesity in aP2-Ucp transgenic mice: physiology and adipose tissue distribution. Am J Physiol, 1996, 270(5 Pt 1), p. E768–775.
19. Lameloise, N., Muzzin, P., Prentki, M., et al. Uncoupling protein-2: A possible link between fatty acid excess and impaired glucose-insulin secretion? Diabetes, 2001, 50, no. 4, p. 803–809.
20. Zhang, CY., Baffy, G., Perret, P., et al. Uncoupling protein-2 negatively regulates insulin secretion and is a major link between obesity, beta cell dysfunction and type 2 diabetes. Cell, 2001, 105, no. 6, p. 745–755.
21. Schrauwen, P., Xia, J., Bogardus, C., et al. Skeletal muscle uncoupling protein 3 expression is a determinant of energy expenditure in Pima Indians. Diabetes, 1999, 48, no. 1, p. 146–149.
22. Bao, S., Kennedy, A., Wojciechowski, B., et al. Expression of mRNAs encoding uncoupling proteins in human skeletal muscle: effects of obesity and diabetes. Diabetes, 1998, 47, no. 12, p. 1935–1940.
23. Krook, A., Digby, J., O’Rahilly, S., et al. Uncoupling protein 3 is reduced in skeletal muscle of NIDDM patients. Diabetes, 1998, 47, no. 9, p. 1528–1531.
24. Boss, O., Samec, S., Desplanches, D., et al. Effect of endurance training on mRNA expression of uncoupling proteins 1, 2, and 3 in the rat. FASEB J, 1998, 12, no. 3, p. 335–339.
25. Schrauwen, P., Saris, WHM., Hesselink, MKC. An alternative function for human uncoupling protein 3: protection of mitochondria against accumulation of nonesterified fatty acids inside the mitochondrial matrix. FASEB J, 2001, 15, no. 13, p. 2497–2502.
26. Brun, S., Carmona, MC., Mampel, T., et al. Activators of peroxisome proliferator-activated receptorinduce the expression of the uncoupling protein-3 gene in skeletal muscle. Diabetes, 1999, 48, no. 6, p. 1217–1222.
27. Frayn, KN., Summers, LKM. Substrate fluxes in skeletal muscle and white adipose tissue and their importance in the development of obesity. In Kopelman, PG., Stock, MJ. (Eds), Clinical obesity. Oxford : Blackwell Science Ltd, 1998, p. 129–157.
28. Himms-Hagen, J., Harper, ME. Physiological role of UCP3 may be export of fatty acids from mitochondria when fatty acid oxidation predominates: an hypothesis. Exp Biol Med, 2001, 226, no. 2, p. 78–84.
29. Moore, GBT., Himms-Hagen, J., Harper, ME., et al. Overexpression of UCP-3 in skeletal muscle of mice results in increased expression of mitochondrial thioesterase mRNA. Biochem Biophys Res Commun, 2001, 283, no. 4, p. 785–790.
30. Clapham, JC., Arch, JR., Chapman, H., et al. Mice overexpressing human uncoupling protein-3 in skeletal muscle are hyperphagic and lean. Nature, 2000, 406 (6794), p. 415–418.
31. Cabrero, A., Alegret, M., Sanchez, RM., et al. Bezafibrate reduces mRNA levels of adipocyte markers and increases fatty acid oxidation in primary culture of adipocytes. Diabetes, 2001, 50, no. 8, p. 1883–1890.
32. Brauner, P., Nibbelink, M., Flachs, P., et al. Fast decline of hematopoiesis and uncoupling protein 2 content in human liver after birth: location of the protein in Kupffer cells. Pediatr Res, 2001, 49, no. 3, p. 440–447.
33. Du, XL., Edelstein, D., Dimmeler, S., et al. Hyperglycemia inhibits endotelial nitric oxide synthase activity by posttranslational modification at the Akt site. J Clin Invest, 2001, 108, no. 9, p. 1341–1348.
34. Brownlee, M. Biochemistry and molecular cell biology of diabetic complications. Nature, 2001, 414 (6865), p. 813–820.
e-mail: brauner@biomed.cas.cz