Autoimunitní hemolytická anémie je skupina patologických stavů, charakterizovaných výskytem autoprotilátek proti antigenům erytrocytů. Autoimunitní hemolytickou anémii klasifikujeme jednak podle asociace s jinými onemocněními (primární vs. sekundární autoimunitní hemolytická anémie), jednak podle vlastností patologických autoprotilátek. Klinické projevy jsou závislé na intenzitě autoprotilátkami zprostředkovaného zrychleného zániku erytrocytů a na schopnosti erytropoézy tento zánik kompenzovat, průběh může být akutní, event. chronický se střídáním období relapsů a remisí, ale i bezpříznakový pouze s laboratorními projevy. Výskyt autoprotilátek může představovat komplikaci případné transfúzní substituce a vyžadovat složitější postupy při předtransfúzním vyšetření.
Klíčová slova autoimunitní hemolytická anémie • klasifikace AIHA • autoprotilátky proti erytrocytům • diagnostika AIHA • komplikace transfúze při AIHA • poléková AIHA
Summary
Pisacka, M. Immunologic/haematological aspects of autoimmune haemolytic anaemia (pathogenetic mechanisms, laboratory findings) Autoimmune haemolytic anaemia is a group of pathological conditions characterised by the presence of autoantibodies against erythrocyte antigens. Autoimmune haemolytic anaemia is classified according to associations with other diseases (primary vs. secondary autoimmune haemolytic anaemia), and also based on properties of the pathological autoantibodies. The clinical symptoms are dependent on the intensity of the autoantibodies-induced shortened survival of erythrocytes and on the bone marrow erythropoietic capacity. The condition can be both acute and chronic, with periodical phases of relapses and remissions, but it can also be asymptomatic, detectable only by laboratory findings. The presence of the autoantibodies can complicate blood transfusion and thus call for more complex pre-transfusion testings.
Key words autoimmune haemolytic anaemia • AIHA classification • anti-erythrocyte autoantibodies • AIHA diagnostics • blood transfusion complications caused by AIHA • drug-induced AIHA Autoimunitní hemolytická anémie (AIHA) je heterogenní skupina patologických stavů, kterým je společný výskyt autoprotilátek proti antigenům červených krvinek a jimi zprostředkovaný zrychlený zánik erytrocytů. Jde o nepříliš časté onemocnění, roční incidence je udávána v počtech 1–3 případy na 100 000.
AIHA můžeme klasifikovat jednak podle vlastností patogenních autoprotilátek (teplotní optimum, mechanismus účinku) jako typ tepelný (převážně IgG autoprotilátky s teplotním optimem 37 °C), chladový (převážně IgM autoprotilátky s teplotním optimem pod tělesnou teplotou), smíšený (oba typy autoprotilátek) a chladovou paroxyzmální hemoglobinurii (bifázický hemolyzin); jednak podle toho, zda je evidentní asociace s určitými patologickými stavy (sekundární AIHA) či nikoliv (primární AIHA).(1) Laboratorními imunohematologickými nálezy jsou, v závislosti na typu AIHA, průkaz autoprotilátek navázaných na erytrocyty a/nebo volných v plazmě a/nebo jimi indukované aktivace dalších efektorových imunitních mechanismů (na krvinky navázaný komplement) a/nebo nález specificky probíhající krvinek (bifázická hemolýza, narušení stability membrány). V malém počtu případů (cca 5 %) nemusí být rutinními laboratorními postupy prokazatelné autoprotilátky a diagnóza je suspektní podle klinických projevů a případné terapeutické odezvy.
Další laboratorní a klinické nálezy závisí na typu a intenzitě proběhlé a aktuálně probíhající hemolýzy a na kapacitě krvetvorby kompenzovat zrychlený zánik erytrocytů, na schopnosti organismu tolerovat sníženou transportní kyslíkovou kapacitu krve a metabolizovat a vylučovat produkty hemolýzy (tíže anémie a související problémy z ischémie, hyperbilirubinémie, hemoglobinémie, hemoglobinurie, hladina haptoglobinu, LDH aj.), v některých případech též na „nehemolytickém“ působení kompletních IgM protilátek (okluzívní působení shlukujících se erytrocytů in vivo či vliv na zpracování a vyšetřování vzorku krve).(2)
Mechanismy imunitní destrukce erytrocytů a vztah k laboratornímu nálezu přímého antiglobulinového testu
AIHA působí autoprotilátky tříd IgG, IgM a vzácně IgA. Protilátkami indukovaná hemolýza může probíhat více mechanismy, dosud jsou známy dva „klasické“ a jeden „nově poznaný“.
Klasické formy hemolýzy probíhají buď fagocytózou (zprostředkovanou interakcí příslušných makrofágových receptorů s Fc-segmentem protilátky a/nebo s C3b složkou komplementu), nebo přímou lýzou erytrocytové membrány, způsobenou aktivací terminálního komplexu komplementu (C5b-C9). První typ je nazýván extravaskulární imunitní hemolýzou, druhý hemolýzou intravaskulární. Při intravaskulární hemolýze dochází k hemoglobinémii a někdy i hemoglobinurii, zatímco při extravaskulární hemolýze pozorujeme tyto příznaky vzácně (pouze při masivní hemolýze, kdy makrofágy nestačí „úplně pohltit“ všechny senzibilizované krvinky a v cévním řečišti se objevují a posléze rozpadají erytrocyty s membránou alterovanou kontaktem s makrofágy).
K jakému z těchto typů hemolýzy a k jaké její intenzitě v daném případě dojde, závisí jednak na vlastnostech protilátek (třída, podtřída, koncentrace, specifita), dále na expresi autoantigenů (jak hustě jsou na membráně zastoupeny, jak jsou přístupné pro protilátky a ev. zda nedochází k útlumu jejich exprese) a konečně na individuálních vlastnostech makrofágů (polymorfismy Fc a CR1 [C3b] receptorů).
Autoprotilátky třídy IgG navázané na erytrocyty působí jejich opsonizaci – umožnění interakce s Fc-receptory makrofágů. Makrofágy mají vysoce afinitní receptory pro IgG3, méně afinitní pro IgG1, velmi slabě afinitní pro IgG2 a žádné pro IgG4. Z toho vyplývá i vztah mezi množstvím molekul jednotlivých podtříd IgG, potřebných k indukci fagocytózy: IgG3 cca 135 molekul – IgG1 1000–4000 molekul – IgG2 minimálně 10 000 molekul. Podrobnosti extravaskulárního zániku erytrocytů při vzácných případech výskytu autoprotilátek IgA a IgM neaktivujících komplement nejsou dosud dostatečně objasněny. Přímý antiglobulinový test (PAT) s polyspecifickým a anti-IgG antiglobulinovým sérem (AGH) je vždy pozitivní u senzibilizace IgG protilátkou (resp. pokud je na krvince navázáno citlivosti testu odpovídající dostatečné množství IgG molekul), průkaz IgA a/nebo IgM v tomto vyšetření závisí na tom, zda s těmito imunoglobuliny je schopna přítomná antiglobulinová složka AGH reagovat. Ojediněle mohou reagovat s IgA a IgM polyspecifická a polyklonální IgG AGH séra, spolehlivě však přítomnost IgA a IgM prokáže pouze pozitivní reakce monospecifických anti-IgA a anti-IgM AGH sér.
Autoprotilátky mohou dále indukovat aktivaci komplementu, která může vést až k tvorbě terminálního lytického komplexu C5b-9, a tudíž k intravaskulární hemolýze, nebo k opsonizaci erytrocytů prostřednictvím na erytrocyt navázaného degradačního produktu C3b, následné interakci s C3b-receptorem (CR1) makrofágů a k extravaskulární hemolýze. První případ, přímou komplementem mediovanou intravaskulární hemolýzu, působí pouze malá část autoprotilátek (některé klinicky významné chladové aglutininy, Donathův-Landsteinerův bifázický hemolyzin a některé „lék-dependentní“ autoprotilátky), ostatní klinicky významné IgM autoprotilátky a některé autoprotilátky IgG (IgG3 efektivněji než IgG1) působí hemolýzu indukcí C3b-mediované fagocytózy. Příčinou tohoto faktu je, že v plazmě a na membráně erytrocytu je přítomná řada (glyko)proteinů, regulujících aktivaci komplementu. Erytrocyty, které takto unikly buď přímé hemolýze C5b-9 komplexem, nebo C3b-mediované fagocytóze, nesou na povrchu krátce C3c a poté C3d, což jsou degradační produkty C3b (zodpovědné za pozitivitu reakce PAT s polyspecifickým a anti-C3d antiglobulinovým sérem). Při interpretaci laboratorní pozitivity antikomplementového PAT je však třeba mít na paměti, že erytrocyty nesou také C3b receptory (CR1), a proto se na ně může navázat tato složka komplementu i při jakékoliv jiné klasické či alternativní aktivaci komplementové kaskády, a to jak in vivo, tak in vitro (k tomu může docházet u déle skladovaných vzorků).(1) Nově popsaný mechanismus hemolýzy byl pozorován u těžké AIHA (vyžadující pobyt na JIP s podporou respirace, hemoglobin 5 dní pod 35 g/l i přes 14 podaných TU) s chladovými IgG autoaglutininy se specifitou anti-Pr (titr 256), bez průkazu vazby IgG na erytrocytech a jen se slabou aktivací komplementu. Bylo prokázáno, že tyto autoprotilátky vazbou na glykoforin A (GPA) ovlivňují uspořádání fosfolipidů v membráně, zvyšují její permeabilitu pro Ca2+ a vedou tak k jejímu rozpadu, bez účasti výše uvedených „klasických“ mechanismů.(3)
Klasifikace AIHA podle laboratorních a klinických nálezů
Rozeznáváme tyto typy AIHA (zkratky z anglických termínů): • AIHA s tepelnými protilátkami (WAIHA) • AIHA s chladovými protilátkami (syndrom chladových aglutininů [CAS] jako sekundární při infekcích a malignitách a primární klonální lymfoproliferativní porucha [CAD]) • AIHA smíšeného typu • AIHA s protilátkami přímo destabilizujícími membránu • paroxyzmální chladová hemoglobinurie (PCH) • léky indukovaná imunitní hemolytická anémie (DIHA)
AIHA s tepelnými autoprotilátkami (WAIHA)
Jednoznačný mechanismus vzniku je stále nejasný, z experimentů je však zřejmé, že u AIHA je nalézána dysbalance regulačních a supresorových lymfocytárních populací, vyvolaná při infekcích působením zkříženě reaktivních mikrobiálních antigenů (blízká podobnost s „autoantigenem“) a při lymfoproliferacích celkovou dysregulací imunity. Tato dysbalance se projevuje aktivací autoreaktivních Th-lymfocytů, které jsou za normálních okolností funkčně inaktivovány. V relapsu AIHA je převaha Th1 (produkující INF-gamma), v remisi Th2 (produdestrukce kující IL-4). Působení těchto lymfocytů a jimi produkovaných cytokinů na B-lymfocyty vede k jejich přeměně na plazmocyty produkující autoprotilátky.
V patogenezi tepelné AIHA jde zřejmě o komplexní proces, kde svou roli hrají autoantigeny, komplementový systém, efektivita prezentace autoantigenů a funkční abnormality B- a T- lymfocytů.(4) U autoantigenů jsou zřejmě důležité charakteristiky jejich zkřížené reaktivity s antigeny externích patogenů (u lidí jsou nejčastějšími terči tepelných autoprotilátek Rh polypeptidy, zatímco u psů jsou to glykoforiny a u myší bílkovina pásu 3). U osob s tepelným typem AIHA a ve zvířecích modelech byly pozorovány též alterace komplementového systému (snížení exprese CR1 [CD35], DAF [CD55] a CD59). V rozvoji tepelné AIHA se též mohou uplatňovat poruchy prezentace autoantigenu (přetrvávání nedostatečně maturovaných antigen-prezentujích buněk) a následná aktivace autoreaktivních klonů, případně mohou být poruchy v procesu zpracovávání autoantigenů. Dále je studována role cytokinů: Th1 cytokinová odpověď působí ve smyslu patogenním, zatímco Th2 odpověď má ochranný charakter.(5) Na rozvoji AIHA se podílí specifické působení imunoregulačních T-lymfocytů (autoreaktivní Treg typy odvozené od Th1 prokázány u AIHA u chronických autoimunitních onemocnění).(6) Tepelný typ představuje cca 70 % AIHA, idiopatická forma postihuje častěji (60 %) ženy. Incidence je udávána mezi 1 : 40 000 až 1 : 80 000, přičemž frekvence idiopatického a sekundárního typu jsou přibližně stejné. Sekundární neboli symptomatická AIHA je asociována s definovaným onemocněním, u dospělých nejčastěji lymfoproliferativním nebo autoimunitním (nejčastěji revmatická onemocnění a kolagenózy); u dětí nejčastěji s infekcemi; méně časté bývají asociace s jinými malignitami a chronickými onemocněními (ulcerativní kolitida, ovariální cysta aj.). Jsou popisovány též případy AIHA s minimální klinickou symptomatologií na pomezí auto/aloimunity – tvorba autoprotilátek po stimulaci transfúzí či těhotenstvím. U idiopatické či primární AIHA není souvislost nalézána. Tepelný typ AIHA se vyskytuje ve všech věkových skupinách, idiopatická forma je častější ve vyšším věku (nad 50 let). Hemolýza bývá v naprosté většině případů extravaskulární.
Imunohematologické laboratorní nálezy u WAIHA
Základním nálezem je průkaz vazby autoprotilátek na krvinky – pozitivita přímého antiglobulinového testu (PAT). Cca ve 40 % případů je současně prokazována přítomnost volných autoprotilátek v séru – pozitivita nepřímého antiglobulinového testu (NAT), častěji bývá prokazována pozitivita enzymových testů. Pouze v ojedinělých případech je nález PAT-/NAT+. Síla a charakter nálezu PAT a NAT se může v průběhu onemocnění a léčby vyvíjet, závisí rovněž na použité testovací metodě (zkumavkový test má mez citlivosti cca 200–250 molekul IgG/C3d na erytrocyt, citlivější sloupcová aglutinace 100–150 molekul IgG/C3d na erytrocyt; nerutinní ELISA a průtoková cytometrie jsou dále citlivější).
Pozitivní PAT bývá: • pouze IgG (30–40 %), • IgG + C3d (40 + 60 %), • IgG + C3d + IgA/IgM (5–10 %)… tento nález se někdy označuje jako „AIHA smíšeného typu“, často bývá asociován s SLE, • pouze IgA nebo pouze IgM (vzácně), • pouze C3d (vzácně), • rutinními testy negativní, pozitivní NAT v eluátu z krvinek (vzácně).
IgG podtřídy jsou podle literárních údajů zastoupeny následovně: IgG1
90 % (
70 % samostatně), IgG2 cca 10 % (
<
1 % samostatně), IgG3
10 % (2 % samostatně) a IgG4 4 % (
<
1 % samostatně). Působení imunosupresivních a imunoregulačních léků při AIHA může indukovat přepnutí („switch“) vytvářených imunoglobulinů na méně patogenní podtřídy.
Případy AIHA s negativním PAT jsou vzácné – dříve popisovaný občasný výskyt tzv. „Coombs-negativních AIHA“ souvisel pravděpodobně s menší citlivostí testů a/nebo s případy IgA a/nebo IgM autoprotilátek.
Zvláštním typem AIHA (někdy i s těžkým průběhem) je přítomnost autoprotilátek se slabou vazbou za laboratorní a vyšší teploty, kdy mohou být rutinní testy negativní nebo velmi slabé a nález se ozřejmí až při promytí erytrocytů chladným LISS roztokem.(7) Autoantigeny v těchto případech bývají lokalizovány na glykoforinových strukturách membrány erytrocytů, a to jak na enzym-senzitivních, tak i na enzym-rezistentních částech.(8) Nově se objevuje možnost zařadit do rutinního laboratorního testování průkaz klinicky závažných IgG podtříd (IgG1 a IgG3). Kombinace semikvantitativního vyšetření všech na erytrocyt navázaných IgG molekul versus IgG1 a/nebo IgG3 zvyšuje prediktibilitu klinické závažnosti nálezu pozitivního PAT a umožňuje monitorovat efekt léčby.
Antigeny, proti kterým jsou autoprotilátky u WAIHA zaměřeny, patří nejčastěji do Rh systému, ovšem byly popsány specifity autoprotilátek téměř ve všech ostatních erytrocytových systémech. Specifita v rámci systému může být „úzká“ (např. auto-anti-e, -D, aj.), „širší“ (např. auto-anti-Ce, -C+D aj) nebo „komplexní“ (např. auto-anti-Rh/total/ – tj. negativní reakce pouze s Rh[null]). Autoprotilátky mohou mít někdy „aloprotilátkymimikující“ vzorec reaktivity, tj. negativní reakci s vlastními krvinkami – příčinou je pravděpodobně negativní regulace membránové exprese některých autoantigenů v průběhu relapsu onemocnění.
Transfúzní aspekty WAIHA
Nálezy senzibilizace krvinek a volných autoprotilátek mohou komplikovat předtransfúzní vyšetření. Navázané autoprotilátky mohou být příčinou falešně pozitivních (častěji) i negativních výsledků určování AB0, RhD i ostatních antigenů. Častější falešnou pozitivitu (způsobenou shlukováním vyšetřovaných krvinek vlivem navázané autoprotilátky, nikoliv diagnostika) můžeme odhalit pomocí tzv. diluentové kontroly, tj. paralelně s reakcí vyšetřovaných krvinek s diagnostikem (obsahujícím specifické protilátky) provedenou reakcí s kontrolním roztokem (obsahujícím stejné látky kromě specifických protilátek). Má-li tato kontrola pozitivní výsledek, nelze dané stanovení považovat za platné. Na vzácnější falešně negativní určení (způsobené „zamaskováním“ hledaného antigenu navázanou autoprotilátkou) nás může upozornit případný nález „atypických“ fenotypů. Na oba typy falešných reakcí může též upozornit diskrepance mezi určením AB0 antigenů a protilátek, případně mezi aktuálním a starším nálezem. Pokud ke správnému určení nevede změna diagnostik (použití diagnostika s nižším obsahem makromolekul v diluentu a související „znegativnění“ příslušné diluentové kontroly), je nutné pokusit se o odstranění navázaných protilátek elucí (někdy postačí opakované promytí fyziologickým roztokem, event. roztokem z komerčních elučních kitů, tepelná eluce aj.). Při tomto postupu se však nesmí zapomenout, že eluční proces může alterovat vyšetřovaný antigen, a proto musí být stejným způsobem zpracovány i krvinky pro příslušnou pozitivní a negativní kontrolu.
Volné autoprotilátky v séru/plazmě mohou interferovat se stanovením AB0 protilátek, se screeningem a identifikací protilátek a s křížovou zkouškou s erytrocyty transfúzního přípravku. Vzhledem k tomu, že literární zdroje uvádějí poměrně častý současný výskyt autoprotilátek a aloprotilátek (15–38 %, dokonce až 75 % u příjemců více než pěti transfúzí náhodně vybraných přípravků), je třeba vyloučit, že za nálezem autoprotilátky není skrytá aloprotilátka. Zatímco u některé „úzce“ specifické autoprotilátky (např. u auto-anti-D) se případné aloprotilátky vyloučí poměrně lehce, u širších a komplexních specifit je to rutinními postupy velmi obtížné až nemožné. Je proto nutné pokusit se autoprotilátku odstranit „vysycením“ na vlastní krvinky (tyto před absorpcí můžeme zbavit navázaných protilátek elucí a zvýšit jejich „vazebnou kapacitu“ případnou úpravou enzymy a/ nebo přidáním potenciačních látek). Vysycení (= inkubaci séra se sedimentem vlastních krvinek) je obvykle třeba do dosažení negativní reakce několikrát opakovat, přesto se v některých případech i přes četné opakování nepodaří autoprotilátku odstranit. U pacientů, kteří byli v nedávné době transfundováni a u nichž lze předpokládat přetrvávání převedených dárcovských erytrocytů v oběhu, a tedy i ve vzorku, nemůžeme k vysycení použít „vlastní“ vzorek. Mohlo by totiž dojít k tomu, že přítomné dárcovské erytrocyty by vysytily případnou aloprotilátku. V těchto případech používáme k vysycení krvinky dárce s vhodným antigenním vybavením, tj. negativní pro ty antigeny, proti kterým by vyšetřovaný pacient mohl vytvářet aloprotilátky. Všechny vysycovací postupy však v sobě z principu nesou riziko diluce slabých skrytých aloprotilátek (zejména při vícečetném opakování absorpce), a tudíž dosažené negativní reakce vysyceného materiálu neposkytují 100% jistotu nepřítomnosti ev. aloprotilátek – proto všechny transfúze v těchto situacích musí být prováděny s opatrností a pokud možno s preventivním výběrem fenotypově kompatibilních přípravků. U pacientů se silně pozitivním PAT jsou některé antigeny obtížně detekovatelné (zejména ty, které jsou určovány nepřímým antiglobulinovým testem), v těchto případech je vhodné vyšetření genotypu a následná predikce fenotypové exprese.
Je však třeba mít na paměti, že komplikace při předtransfúzním vyšetření a sérologická inkompatibilita nejsou absolutní kontraindikací transfúze a nepřipustit, aby zdržení, zapříčiněné složitým vyšetřováním skupiny pacienta a charakteru autoprotilátek a jejich často opakovaným vysycováním, ohrozilo včasné podání transfúze. Je-li tedy riziko z ischemických komplikací při nízkých hodnotách krevního obrazu, je nutné podat inkompatibilní přípravek. V takových případech se alespoň snažíme vybrat co nejméně rizikové přípravky (nepodařila-li se určit skupina, pak podat 0 RhD negativní; máme-li více validních výsledků, pak vybrat přípravek fenotypově kompatibilní v systémech Rh a Kell; vždy respektovat v minulosti určovanou klinicky významnou protilátku aj.).
AIHA s chladovými protilátkami (choroba chladových aglutininů [CAD], syndrom chladových aglutininů [CAS])
Chladové protilátky, resp. chladové aglutininy (CA), jsou příčinou hemolýzy u cca 10–25 % AIHA. Jsou to protilátky reagující při teplotě nižší než 37 °C a mající schopnost přímo shlukovat erytrocyty = aglutinovat. V naprosté většině případů jsou to protilátky třídy IgM. CAS postihuje obě pohlaví stejně často. Idiopatická (primární) forma se vyskytuje v pozdějším věku (nad 50 let). Bývá označována jako choroba chladových aglutininů (CAD). Jedná se o klonální lymfoproliferativní onemocnění, a tudíž produkované autoprotilátky mají monoklonální charakter (IgM s restrikcí kappa lehkých řetězců). Imunohistochemické vyšetření kostní dřeně u 75 % pacientů s CAD prokazuje B-buněčnou lymfoproliferaci, v 50 % klasifikovanou jako lymfoplazmocytový lymfom (LPL) a v 8 % jako lymfom marginální zóny (MZL).
Symptomatické, sekundární formy (CAS) souvisejí buď s infekcemi (nejčastěji Mycoplasma pneumoniae, infekční mononukleóza, ale i jiné), kdy protilátky jsou na rozdíl od CAD polyklonální, nebo s hematologickými (jinými než LPL a MZL) i jinými malignitami. Někteří autoři zpochybňují paraneoplastické CAS s tím, že může jít o koincidenci maligního procesu a CAD.(9)
Imunohematologické laboratorní nálezy
u CAS/CAD
U CAS jsou při infekcích protilátky polyklonální, s titrem obvykle do 2000, téměř vždy s aktivací komplementu – C3d pozitivní PAT. U idiopatických CAD jsou protilátky obvykle monoklonální, u idiopatické formy často s vysokým titrem (přes 2000), rovněž provázené aktivací komplementu, a tudíž C3d pozitivitou PAT. Nejčastější specifitou u CA jsou antigeny I/i (repetitivní N-acetyllaktosaminové jednotky, větvené u I antigenu na krvinkách dospělých osob a lineární i u antigenu na fetálních a pupečníkových krvinkách). Další specifity jsou např. charakterizovány rozdílnou reaktivitou s nativními a proteázami upravenými erytrocyty. Není zde příliš zřejmá souvislost se systémy krevních skupin jako u WAIHA. Klinické projevy souvisí více s termální amplitudou protilátky a s její schopností aktivovat komplement, méně s koncentrací (stanovovanou titrací při 4 °C). Zatímco vazba IgM je intenzívnější za nižších teplot, aktivace komplementu naopak při tělesné teplotě. Komplementová hemolýza se tak uplatní u těch CA, které jsou schopné reagovat při širším teplotním rozmezí (10–37 °C) – součinnost obou faktorů je optimální při teplotě mezi 20–22 °C. Proto je dalším faktorem rozhodujícím pro intenzitu hemolýzy stupeň expozice chladu (roční období, profese aj.).
CA reagují aglutinací erytrocytů za chladu (0–4 °C), v závislosti na termální amplitudě dané protilátky se stoupající teplotou reaktivita slábne a při 37 °C mizí. Nález slabé reaktivity za chladu do titru 1 : 16 až 1 : 32 může být fyziologický. V některých případech CAS mohou být pozorovány extrémně vysoké titry (přes 1 : 100 000), významná hemolýza však může být i při nižších titrech. Mechanismus hemolýzy je založen na aktivaci komplementu (viz výše). PAT je pozitivní díky přítomnosti C3d na membráně dosud nehemolyzovaných krvinek.
Transfúzní aspekty CAS/CAD Díky charakteru CA se komplikace objevují ve fázi přípravy a transportu vzorku a v testech při teplotě nižší než 37 °C (AB0 určování, detekce antigenů IgM diagnostiky). Pro správnou interpretaci a reprodukovatelnost je třeba dodržovat při odběru a transportu vzorku takové postupy, které zabrání vlivu snížené teploty na vyšetření (teplota místnosti, odběrových nádob, oddělení séra/plazmy a krvinek za tepla, transport do laboratoře v termoboxu aj.). Falešně pozitivní reakce určování antigenů bývají většinou odstraněny promytím vyšetřovaných krvinek zahřátým fyziologickým roztokem. Problémy při určování ABO protilátek a při screeningu a křížové zkoušce bývá možno odstranit prováděním všech kroků testů při 37 °C a používáním monospecifického anti-IgG AGH séra. Pokud nedojde k odstranění reaktivity CA předehřátím komponent předtransfúzních testů, lze se pokusit vysytit CA inkubací s vhodnými erytrocyty při 4 °C (stejně jako u tepelného vysycování IgG autoprotilátek je i zde riziko diluce případných slabých skrytých aloprotilátek, tudíž k transfúzím je třeba přistupovat s opatrností). Před vlastním podáním transfúze je vhodné ohřát daný přípravek na zařízení k tomu určeném.
Paroxyzmální chladová hemoglobinurie
Paroxyzmální chladová hemoglobinurie (PCH, též nazývaná Donathův-Landsteinerův – DL – syndrom) je charakterizována intravaskulární hemolýzou a následnou hemoglobinurií poté, co byl organismus vystaven chladu. V minulosti se PCH vyskytovala především v souvislosti s terciární a vrozenou syfilis. V současné době jde typicky o onemocnění dětského věku v souvislosti s prodělanou epizodou virového infektu. I když hemolýza v těchto případech bývá prudká, s bolestmi hlavy, břicha a zad a s třesavkou a s výrazným poklesem v krevním obraze, většinou dochází po několika dnech ke spontánní úpravě.
Příčinou je přítomnost tzv. bifázického Donathova-Landsteinerova hemolyzinu, za chladu reagující protilátky (většinou IgG, ojediněle IgM), silně aktivující komplement a uvolňující se z vazby na krvinku v teplotách vyšších než 10–15 °C.
Imunohematologické nálezy u paroxyzmální chladové hemoglobinurie
Nalézáme pozitivitu PAT, způsobenou pouze vazbou C3d. Samotný hemolyzin není prokazován na krvinkách, ale pouze v séru, kde se projevuje nepříliš silnou chladovou (0–4 °C) reaktivitou. Titr nebývá vysoký (1 : 16, vzácně více), specifita je nejčastěji anti-P (antigen přítomný téměř na všech krvinkách, chybí pouze u jedinců s raritním fenotypem PP1pk negativním = Tj[a-]). Průkazem PCH je pozitivita testu bifázické hemolýzy (DL test): krvinky inkubované za chladu s protilátkou hemolyzují in vitro po přenesení do 37 °C za přítomnosti komplementu. Kontrolní zkumavky (s normálním sérem nebo bez chladové inkubace nebo bez komplementu) musí být beze známek hemolýzy. V akutní fázi je tento test někdy obtížně interpretovatelný – pokud je hemolýza silná a sérum hemolytické, může být na další hemolýzu usuzováno jen podle úbytku erytrocytů v příslušné zkumavce.
Polékové imunitní hemolytické anémie (drug-induced immune hemolytic anemia, DIHA, ev. DIHA)
Polékové hemolytické stavy jsou známy již od 50. let.(11, 12) Mnoho různých léků (dokumentováno již cca 100) způsobuje zrychlený zánik erytrocytů, zprostředkovaný imunitními mechanismy. Klinické příznaky, stejně jako u klasické AIHA, závisí na mechanismu hemolýzy a jsou v rozsahu od život ohrožující prudké intravaskulární hemolýzy až po téměř nerozpoznatelný pokles v krevním obraze. Sérologické testování v této oblasti není dosud dostatečně standardizováno, mnoho případů (zejména s lehčí hemolýzou) není diagnostikováno a často je diagnostika velmi obtížná (zejména, pokud je vyvolávajícím činitelem nikoliv lék jako takový, ale jeho metabolit). Proto zůstává skutečná incidence této jednotky neznámá.
DIHA je heterogenní skupinou, některé z případů spadají do kategorie autoimunity (např. metyldopová DIHA, charakterizovaná tvorbou autoprotilátek a neodlišitelná laboratorně od WAIHA), jiné svým mechanismem připomínají spíše aloimunitní hemolýzu (např. penicilinové a cefalosporinové DIHA, kde hlavní roli hrají lék-dependentní protilátky, k jejichž laboratornímu průkazu je zapotřebí různý způsob přítomnosti léku nebo jeho metabolitu). U „alo-like“ DIHA bývá i rozdílný průběh při prvním kontaktu s lékem (primární imunitní odpověď, projevy za cca 5–6 dní) a při reexpozici (sekundární imunitní odpověď, projevy mohou být již po první dávce léku).
Klasické rozdělení DIHA (haptenový typ – imunokomplexový typ – adsorpční typ – autoimunitní typ) se v současné době jeví jako rigidní schéma, některé léky totiž mohou u jednoho pacienta fungovat více způsoby a/nebo působit u různých pacientů odlišně. Modernější teorie neoantigenu vysvětluje vznik DIHA tím, že při interakci léku (či metabolitu) s membránou erytrocytu vzniká nová struktura (= neoantigen) a tato je individuálním způsobem rozpoznávána imunitním systémem. Pokud imunitní systém reaguje spíše na lékovou část neoantigenu, vytvářejí se lék-dependentní protilátky; pokud je cílovou strukturou spíše membránová část, tvoří se lékem-indukované autoprotilátky.(13) Klasickým příkladem je DIHA po podání penicilinu. Tento lék je navázán na membránách erytrocytů u 30 % osob dostávajících dávku 1,2–2,4 miliónu jednotek denně a u všech pacientů s dávkou vyšší než 10 miliónů jednotek. U 3 % z těchto osob se objevuje tvorba lék-dependentních protilátek a IgG pozitivní PAT, pouze několik z nich vyvine extravaskulární hemolýzu. Vzácně však může dojít k produkci komplement aktivujících lék-dependentních protilátek a poté k intravaskulární hemolýze, a to i po běžných dávkách léku. Další skupinou léků asociovanou s DIHA jsou cefalosporiny. Zatímco léky první generace indukují převážně DIHA s IgG lék-dependentními protilátkami bez aktivace komplementu, léky novějších generací jsou spíše asociovány s produkcí komplement aktivujících lék-dependentních protilátek. Dlouhodobé (více než tři měsíce) podávání metyldopy a levodopy vede asi u 10 % pacientů k indukci tvorby IgG autoprotilátek, k mírné hemolýze dochází u 0,3–0,8 %. DIHA byly dále popsány u mnoha dalších léků, šlo ovšem většinou o ojedinělé případy a nelze tak generalizovat, jaký typ (auto)protilátek je pro který lék typický.
K DIHA je též přiřazován typ „membránové modifikace“ s odlišným patogenetickým mechanismem. Lék (např. cisplatina, oxaliplatina, sulbaktam, klavunát, tazobaktam) zde nepůsobí tvorbou neoantigenu, ale přímé alterace membrány, na kterou se potom pasivně adsorbují plazmatické bílkoviny včetně imunoglobulinů. Klinické projevy (hemolýza) však jsou zde téměř minimální a tento stav je tedy diagnostikován spíše jako vedlejší laboratorní nález.
V přehledné práci, shrnující 127 léků prokazatelně spojených s DIHA, je 42 % antimikrobiálních medikamentů, 16 % nesteroidních protizánětlivých léků, 13 % cytostatik a 6 % antihypertenzív. Z antibiotik jsou to nejčastěji cefotetan (53 %), ceftriaxon (16 %), piperacilin (9 %) a betalaktamázové inhibitory (5 %). Fatální hemolýzy byly v souvislosti s cefotetanem (8 %) a ceftriaxonem (6 %).(14) Indukce antierytrocytových autoprotilátek a klinicky manifestní případy AIHA byly dokumentovány v souvislosti s podáváním fludarabinu a kladribinu.( Ve skupině posttransplantačních hemolytických anémií je pravděpodobně také část případů asociovaná s podáváním léčiv (alemtuzumab, cyklosporin, daklizumab, mykofenolát mofetil, takrolimus).(16)
Imunohematologické nálezy u DIHA
PAT je IgG pozitivní u autoprotilátkové DIHA (metyldopa) a u DIHA s lék-dependentními protilátkami neaktivujícími komplement (klasický penicilinový typ). Jestliže se na DIHA účastní lék-dependentní komplement aktivující protilátky, je PAT pozitivní s anti-C3d a event. i s anti-IgG (např. cefalosporiny novějších generací).
Při vyšetření nalézáme buď reakce séra (autoprotilátek) se všemi krvinkami bez ohledu na přítomnost či nepřítomnost léku (u metyldopové DIHA), nebo reakci séra pacienta pouze s krvinkami s navázaným lékem (i bez přítomnosti léku v séru – klasická penicilinová DIHA), nebo reakci krvinek pouze se sérem, ve kterém je přítomný lék (DIHA s cefalosporiny novějších generací). U DIHA s membránovou modifikací je test dvoukrokový: na krvinky, na které nejprve působil lék, se při další inkubaci adsorbují imunoglobuliny, ale na rozdíl od penicilinového typu nespecificky, tj. ze séra pacienta i normálních zdravých osob.
Vyšetření séra je ovšem často komplikovanější, neboť správný výsledek může být někdy získán, až pokud je použit lékový metabolit (tj. do reakcí jsou používány ex vivo metabolity, získané v séru či moči pacientů či dobrovolníků, užívajících stejný lék).
**
Literatura 1. PETZ, LD., GARRATTY, G. Immune hemolytic anemia. 2nd ed, Philadelphia : Elsevier Inc; 2004. 2. GEHRS, BC., FRIEDBERG, RC. Autoimmune hemolytic anemia. Am J Hematol, 2002, 69, p. 258–271. 3. BRAIN, MC., PREVOST, JM., PIHL, CE., BROWN, CB. Glycophorin A-mediated haemolysis of normal human erythrocytes: evidence for antigen aggregation in the patogenesis of immune haemolysis. Br J Haematol, 2002, 118, p. 899–908. 4. BARROS, MMO., BLAJCHMAN, MA., BORDIN, JO. Warm autoimmune hemolytic anemia: recent progress in understanding the immunobiology and the treatment. Transfusion Medicine Reviews, 2010, 24, p. 195–210. 5. HALL, AM., WARD, FJ., VICKERS, MA., et al. Interleukin-10-mediated regulatory T-cell responses to epitopes on a human red blood cell autoantigen. Blood, 2002, 100, p. 4529–4536. 6. WARD, FJ., HALL, AM., CAIRNS, LS., et al. Clonal regulatory T cells specific for a red blood cell autoantigen in human autoimmune hemolytic anemia. Blood, 2008, 111, p. 680–687. 7. ARNDT, PA., HUNT, PP., GARRATTY, G. Suspected autoimmune hemolytic anemia associated with RBC-bound IgG only detectable by 4°C LISS wash method using certain anti-IgG reagens. Transfusion, 2009, 49, 129A. 8. JOHNSON, ST., BANDOUVERES, S. DAT negative autoimmune hemolytic anemia due to low affinity IgG warm-reactive anti-Pr in an infant. Transfusion, 2002, 42, 20S. 9. BERENTSEN, S., TJONNFJORD, GE. Diagnosis and treatment of cold agglutinin mediated autoimmune hemolytic anemia. Blood Reviews, 2012, 26, p. 107–115. 10. ZILOW, G., KIRSCHFINK, M., ROELCKE, D. Red cell destruction in cold agglutinin dinase. Infusionsther Transfusionsmed, 1994, 21, p. 410–415. 11. SNAPPET, I., MARKS, D., SCHWARTZ, L., HOLLANDER, L. Hemolytic anemia secondary to Mesantoin. Ann Intern Med, 1953, 39, p. 619–623. 12. HARRIS, JW. Studies on the mechanism of a drug-induced hemolytic anemia. J Lab Clin Med, 1956, 47, p. 760–775. 13. MUELLER-ECKHARDT, C., SALAMA, A. Drug-induced imine cytopenias: a unifying pathogenetic concept with special emphasis on the role of drug metabolites. Transfus Med Rev 1990, IV, p. 69–77. 14. GARRATTY, G., ARNDT, PA. An update on drug-induced imune hemolytic anemia. Immunohematology, 2007, 23, p. 105–119. 15. HAMBLIN, TJ. Autoimmune complications of chronic lymphocytic leukemia. Semin Oncol, 2006, 33, p. 230–239. 16. ELIMELAKH, M., DAYTON, V., PARKS, KS., et al. Red cell aplasia and autoimmune hemolytic anemia following immunosuppression with alemtuzumab, mycophenolate and daclizumab in pankreas transplant recipients. Haematologica, 2007, 92, p. 1029–1036.
O autorovi| 1, 2MUDr. Martin Písačka 1Ústav hematologie a krevní transfuze, Praha 2Ústav klinické a experimentální hematologie, Praha Prohlášení: autor v souvislosti s tématem práce nespolupracuje s žádnou farmaceutickou firmou. e-mail: martin.pisacka@uhkt.cz